5. RESULTADOS
5.1. Análise molecular
Para a amplificação com o oligo blaKPC, foram amplificadas amostras, que devolveram bandas de amplificação na altura de 881 pb, correspondente ao plasmídeo. A análise da amplificação da região do gene blaKPC mostrou que apenas a amostra A10 não amplificou, isso demonstra que esta amostra não possuía o gene de resistência.
5. 1. 1. Gene blaKPC
Figura 7: Gel de agarose a 2% da amplificação do gene blaKPC das amostras dos 17 pacientes estudados. A banda amplificada corresponde a uma região de 881 pb . Marcador = Marcador de 100pb, CN= controle negativo
A amostra A3 não amplificou no primeiro momento, então, foi realizado
novamente a PCR e corrida de gel, obtendo então, a amplificação da amostra, como apresentado na figura 8.
45
Figura 8: Gel de agarose a 2% da amplificação do gene blaKPC da mostra A3 estudada. A banda amplificada corresponde a uma região de 881
pb. Marcador = Marcador de 100pb, CN= controle negativo.
5. 1. 2. Gene 16S rRNA
Para a amplificação do gene 16S rRNA, utilizou-se o oligo universal. Foram amplificadas amostras, que devolveram bandas de amplificação na altura de 996 pb.
Figura 9: Gel de agarose a 2% da amplificação do gene 16S rRNA das amostras dos 17 pacientes estudados. A banda amplificada corresponde a uma região de 996 pb . Marcador = Marcador de 100pb, CN= controle negativo
46
Segundo Lu et al (2000) a digestão com a enzima HaeIII deste amplicons de 16S rRNA devolveriam bandas com perfis entre 150 a 200 pb. No gel abaixo é possível evidenciar que este perfil ocorreu, com o predomínio de bandas na altura de 200pb.
Figura 10: Gel de agarose a 2% da digestão do amplicon do gene 16S rRNA das amostras com a enzima HaeIII, evidenciando diversos fragmentos próximos a 200 pb. A banda amplificada corresponde a uma região ribossomal
de 996 pb . Marcador = Marcador de 100pb, CN= controle negativo.
5. 2. Análises epidemiológicas 5. 2. 1. Sexo
No total, foram detectados 17 isolados de KPC resistêntes aos carbapenêmicos, no período de 2010 á 2011, onde a maior a prevalência foi detecatada em amostras de pacientes do sexo masculino (53%) do que no sexo feminino (47%).
47
Figura 11: Isolado de KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados no HRAN, no período de 2010 á 2011.
5. 2. 2. Desfecho clínico
Em 17 isolados de KPC resistêntes aos carbapenêmicos, no período de 2010 á 2011, a porcentagem de pacientes que foram a óbito (59%) foi maior que a de pacientes que tiverm alta (41%).
Figura 12: Isolado de KPC segundo desfecho clínico dos 17 pacientes investigados no HRAN, no período de 2010 á 2011.
48
5. 2. 3. Local da coleta
Dos 17 episódios detectados de infecção por KPC resistêntes aos carbapenêmicos, no período de 2010 á 2011, a infecção em swab retalfoi mais frequente (47%), seguida de ponta de catéter (18%) e secreção traqueal (12%).
Figura 13: Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17 pacientes investigados no HRAN, no período de 2010 á 2011.
5. 2. 4. Microorganismo
O microorganismo mais encontrado foi a Klebsiella pneumoniae (82%), seguida da Enterobacter clocae (12%) e Serratia marcescens (6%), dos 17 isolados de KPC resistêntes aos carbapenêmicos, no período de 2010 á 2011. Isto afirma o fato de a sigla KPC ser utilizada de forma errônea á Klebsiella pneumoniae, visto que, a evidência dela é maior em relação as outras cepas.
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Figura 14: Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17 pacientes investigados no HRAN, no período de 2010 á 2011.
5. 2. 5. Relações variáveis relativas à infecção bacteriana e desfecho clínico
Tabela 6 – Distribuição do perfil genético, sexo, coleta, tipificação de microrganismos e análise da resistência bacteriana segundo o desfecho clínico. Brasília-DF, 2010 a 2011.
Variável Resultado
Desfecho
Alta Óbito
N % N % P
Gene 16S rRNA Positivo 7 100,0 10 100,0
N/A
Gene blaKPC Positivo 6 85,7 10 100,0
Negativo 1 14,3 0 0,0 0,218 Sexo Feminino 2 28,6 6 60,0
Masculino 5 71,4 4 40,0
0,201
Local da coleta Fundo saco de Douglas 1 14,3 0 0,0 Hemocultura 0 0,0 1 10,0 0,463 Ponta de cateter 1 14,3 2 20,0 Sec. Traqueal/Brônquica 0 0,0 1 10,0
50 Secreção traqueal 2 28,6 0 0,0 Swab retal 3 42,9 5 50,0 Urina 0 0,0 1 10,0 Microrganismo Enterobacter cloacae (KPC) 1 14,3 1 10,0 Klebsiella pneumoniae 6 85,7 8 80,0 0,416 Serratia marcescens 0 0,0 1 10,0
Teste de Hodge Hodge positivo 7 100,0 10 100,0
N/A
Amicacina sem informação 4 57,1 5 50,0
intermediário 1 14,3 1 10,0 0,848 resistente 0 0,0 1 10,0 sensível 2 28,6 3 30,0 Amoxicilina/ Ácido Clavulânico sem informação 4 57,1 5 50,0 não testado 0 0,0 1 10,0 0,688 resistente 3 42,9 4 40,0 Ampicilina / Sulbactam sem informação 4 57,1 5 50,0 não testado 3 42,9 4 40,0 0,688 resistente 0 0,0 1 10,0
Ampicilina sem informação 4 57,1 5 50,0
0,772
resistente 3 42,9 5 50,0
Aztreonan sem informação 4 57,1 5 50,0 0,772 resistente 3 42,9 5 50,0
Cefazolina sem informação 4 57,1 5 50,0
não testado 0 0,0 1 10,0 0,688 resistente 3 42,9 4 40,0
Cefoperazona sem informação 4 57,1 5 50,0
não testado 3 42,9 4 40,0 0,688 resistente 0 0,0 1 10,0
Cefotaxima sem informação 4 57,1 5 50,0
0,772
resistente 3 42,9 5 50,0 Cefoxitina sem informação 4 57,1 5 50,0 intermediário 1 14,3 0 0,0
0,509
não testado 0 0,0 1 10,0 resistente 2 28,6 4 40,0
Ceftazidima sem informação 4 57,1 5 50,0 0,772 resistente 3 42,9 5 50,0
Cetriaxona sem informação 4 57,1 5 50,0
resistente 3 42,9 5 50,0 0,772 Cefalotina sem informação 4 57,1 5 50,0
não testado 3 42,9 4 40,0
0,688
resistente 0 0,0 1 10,0
51
resistente 3 42,9 5 50,0
Claritromicina sem informação 4 57,1 5 50,0 0,772 não testado 3 42,9 5 50,0
Clindamicina sem informação 4 57,1 5 50,0
0,772
não testado 3 42,9 5 50,0
Eritromicina sem informação 4 57,1 5 50,0 0,772 não testado 3 42,9 5 50,0
Gentamicina sem informação 4 57,1 5 50,0
0,942
resistente 2 28,6 3 30,0 sensível 1 14,3 2 20,0 Imipenem sem informação 4 57,1 5 50,0 intermediário 0 0,0 2 20,0
0,193
Resistente 1 14,3 3 30,0 sensível 2 28,6 0 0,0 Nitrofurantoína sem informação 4 57,1 5 50,0
não testado 3 42,9 4 40,0
0,688
resistente 0 0,0 1 10,0
Norfloxacina sem informação 4 57,1 5 50,0 0,772 não testado 3 42,9 5 50,0
Oxacilina sem informação 4 57,1 5 50,0
0,772
não testado 3 42,9 5 50,0
Penicilina sem informação 4 57,1 5 50,0 0,772 não testado 3 42,9 5 50,0
Piperacilina sem informação 4 57,1 5 50,0
0,772
resistente 3 42,9 5 50,0
Rifampicina sem informação 4 57,1 5 50,0 0,772 não testado 3 42,9 5 50,0
Tetraciclina sem informação 4 57,1 5 50,0
0,772 resistente 3 42,9 5 50,0 Ticarcilina / Ácido Clavulônico sem informação 4 57,1 5 50,0 0,688 não testado 0 0,0 1 10,0 resistente 3 42,9 4 40,0
Tobramicina sem informação 4 57,1 5 50,0 0,772 resistente 3 42,9 5 50,0 Trimetoprima / Sulfametoxazol sem informação 4 57,1 5 50,0 0,112 resistente 1 14,3 5 50,0 sensível 2 28,6 0 0,0
Vancomicina sem informação 4 57,1 5 50,0 0,772 não testado 3 42,9 5 50,0
Tigeciclina sem informação 4 57,1 5 50,0
intermediario 0 0,0 1 10,0 0,211 não testado 1 14,3 4 40,0
52
Cefepime sem informação 4 57,1 5 50,0
0,772
resistente 3 42,9 5 50,0 Cefuroxima sem informação 4 57,1 5 50,0 não testado 1 14,3 0 0,0
0,381
resistente 2 28,6 5 50,0 Levofloxacina sem informação 4 57,1 5 50,0
resistente 2 28,6 5 50,0 0,381 sensível 1 14,3 0 0,0 Piperacilina / Tazobactam sem informação 4 57,1 5 50,0 intermediário 1 14,3 0 0,0 0,381 resistente 2 28,6 5 50,0
Ertapenem sem informação 4 57,1 5 50,0
resistente 2 28,6 5 50,0 0,381 sensível 1 14,3 0 0,0
Meropenem sem informação 4 57,1 5 50,0 intermediário 1 14,3 0 0,0
0,223
resistente 1 14,3 5 50,0 sensível 1 14,3 0 0,0 Cefotetan sem informação 4 57,1 5 50,0
não testado 3 42,9 4 40,0
0,688
sensível 0 0,0 1 10,0
Gemifloxacina sem informação 4 57,1 7 70,0 0,585 não testado 3 42,9 3 30,0 Desfecho Alta Óbito Média Erro padrão Média Erro padrão p Idade 58 9 59 5 0,991 Tempo Internação (dias) 50 13 46 12 0,571
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6. DISCUSSÃO
Nos últimos anos houve um aumento na incidência de bactérias multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar, tornando isto, um problema mundial de saúde pública (HULSCHER, et. al., 2010). Quando se trata principalmente de bacilos Gram negativos, a freqüência destas bactérias é ainda maior em países da América Latina quando comparada a países desenvolvidos (GALES, et.al., 2012).
De acordo com dados do “Meropenem Yearly Susceptibility Test Information Collection” (MYSTIC), ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade de K. pneumoniae nos últimos anos, graças a práticas de controle de disseminação de amostras resistentes(RHOMBERG, P. R. et. al., 2009). O aumento crescente da prevalência destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependência do uso de antibióticos carbapenêmicos, considerados como a opção terapêutica para o tratamento de infecções por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE, 2012). Isto afeta diretamente as opções de tratamento, sobrando poucas alternativas para a terapêutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina, que apresentam respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficácia. (LIVERMORE, et. al., 2011). Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E, por exemplo, são a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES, C. A. C. et. al.,2009 ).
Devido à resistência ser usualmente de natureza plasmidial e, portanto de maior disseminação, especialmente quando carreadas por K. pneumoniae, microrganismo com uma notória capacidade para acumular e transferir plasmídeos com determinantes para resistência; o número de casos detectados pelo fenótipo/genótipo blaKPC é bastante preocupante (MONTEIRO, et. al., 2009). Comparada com outras bactérias hospitalares, a transmissão de clones multirresistentes de K. pneumoniae é maior e podem não ser controladas pelos métodos de controle de infecção hospitalar (PAAUW, et. al., 2007). A forma plasmidial para transferência da resistência adicionada a este grande potencial para disseminação de clones resistentes, é preocupante; visto que após surtos, muitas vezes, pode se tornar endêmica. Já é uma realidade a disseminação desta bactéria
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entre pacientes, hospitais, países e até mesmo continentes (WOODFORF, et. al., 2010; ROGERS, et. al., 2011).
As chances de surtos são maiores em países com poucos recursos, devido à maior carência de práticas de prevenção e controle de infecções hospitalares, e o uso irracional de antimicrobianos de forma empírica e inadequada (KUMARASAMY, et. al., 2010). Até o momento, os mecanismos de resistência aos cabapenêmicos geralmente encontrado eram a produção de ESBL (CTX-M) somada á perda de porina (CARVALHAES, et. al., 2010). Foi notado a partir do ano de 2008 um aumento no número de K. pneumoniae produtoras de KPC-2, apresentando outra forma de resistência (GALES, 2012).
Um estudo mostrou que, o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade, internado há mais de 1 semana no hospital. A mortalidade geral nos últimos anos ficou em torno de 7%, sendo que dos 77 pacientes estudados, 32 (41,5%) pacientes evoluíram para óbito, evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES, A. P. et. al., 2013).
Em estudo com 2.316 pacientes avaliados, a população de sexo masculino foi de 52,6%, idade média global de 53 anos (mediana de 55 anos), permanência média de 5,8 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA, A. C. et. al., 2010). Outros trabalhos apresentaram ausência de significância entre sexo/idade e o desenvolvimento de infecções por microrganismos resistentes (PERES-BOTA, D. et. al., 2003; COLPAN, A. et. al., 2005; COELLO, R. et. al., 1997).
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras, sendo elas isoladas de urina, escarro, secreção pleural, ponta de cateter, aspirado traqueal e hemocultura. A mais prevalente foi em urina (40%). Entre as 30 cepas analisadas, a maior porcentagem foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70%), Enterobacter sp (13,3%), Klebsiella
ozaenae (10%), Escherichia coli (3,33%) e Klebsiella oxytoca (3,33%)
(DIENSTMANN, R. et. al., 2010). Nos Estados Unidos a enzima KPC já se tornou endêmica. Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York, onde testaram 602 amostras e 45% apresentaram algum mecanismo de resistência, sendo apenas 3,3% confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU. et. al., 2005).
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Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japão apresentou o tipo Toho-1 como o mais prevalente nessa pesquisa. Até o ano de 2000, ano em que foi publicado tal estudo, este era o primeiro relatório no Japão para identificar derivados de ESBLs, como tipo de SHV e TEM entre E. coli e K. pneumoniae. Em especial, o tipo SHV- 12 foi identificado com uma maior freqüência. Estes resultados indicam que tipos distintos de ESBLs, que são diferentes em sua especificidade de substrato e origem genética, coexistem no Japão. Isto mostra a importância de caracterizar genótipos distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendências de ESBLs no Japão, além da necessidade de uma interpretação uniforme utilizando as diretrizes do CSLI, para relatar cepas produtoras de ESBL. Além da detecção de ESBLs, são necessárias mais informações, tais como o perfil de sensibilidade específica para diversas β-lactâmicos e o local da infecção. Esses fatores são essenciais para a escolha adequada de antibióticos (YAGI, T. et. al., 2000).
No ano de 2004, uma pesquisa avaliou a produção de uma enzima de hidrólise de carbapenêmicos; através da técnica de seqüenciamento, foi revelado um novo membro da família KPC, designado KPC- 3. Pesquisadores encontraram em um mutante de K. pneumoniae, uma substituição de um gene associado com resistência a Imipenem, mas essa substituição foi considerada improvável na contribuição da resistência aos carbapenêmicos da espécie estudada . Além da resistência aos carbapenêmicos, estes isolados eram em sua maioria resistentes às cefalosporinas, penicilinas e aminoglicosídeos. Usando estudos de transformação, conjugação e hibridação, localizaram o alelo blaKPC em plasmídeo, além disso mostraram que esse alelo também carregava uma resistência aos aminoglicosídeos. A transferência das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro, tanto neste como em outros estudos, pode ser que os plasmídeos que fazem esta transferência estavam começando a se espalhar no ambiente clínico, resultando na multiresistência dessas estirpes (WOODFORD, et. al., 2004).
O presente estudo apresentou um viés quanto aos resultados dos testes de susceptibilidade microbiana. Observou-se que não foi encontrado resultado deste teste em algumas amostras, o que não cooperou para um estudo mais preciso futuros estudos quanto às amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de patologia. Porém, mesmo sem algumas amostras com este resultado disponível, foi
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confirmada a presença da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistência aos carbapenêmicos, por meio dos genes de resistência blaKPC e 16S rRNA, que as amostras apresentaram em sua maioria, serem portadoras. Quanto aos resultados estatísticos, nenhuma das variáveis apresentou significância estatística (p > 0,05), mostrando assim, que estas variáveis isoladas não foram o fator determinante para o desfecho clínico de alta ou óbito.
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7. CONCLUSÃO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados, confirmando a a presença da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistência aos carbapenêmicos . Houve uma maior prevalência da cepa K. pneumoniae, e isto confirma outros estudos que apresentam a maior prevalência desta cepa em amostras com KPC. Além disso, isso justifica a forma popular da K. pneumoniae ser chamada de KPC, enquanto que na verdade, KPC é uma enzima, podendo estar presente em outras cepas como Enterobacter clocae, também apresentada no presente estudo. O desfecho clínico de óbitos maior que 50%, é um possível indicador sobre a necessidade de se realizar um teste rápido para identificação de KPC, visando iniciar o mais rápido possível o tratamento, afim de, diminuir a mortalidade por esta infecção.
Nenhuma das variáveis isoladamente está relacionada ao desfecho clínico óbito ou alta, pois não apresentaram relevância estatística. O presente estudo mostrou que há presença da bactéria nas amostras de pacientes do hospital estudado, podendo então, afirmar que este tipo de bactéria se encontra também presente em ambiente hospitalar. O uso irracional de antimicrobiano é demonstrado de forma indireta, quando foi apresentado através do Teste de Hodge Modificado, uma resistência de 100% aos antibióticos carbapenêmicos. Isto também reflete na terapêutica, sendo que, pacientes portadores de bactérias resistentes aos antibióticos carabepêmicos tem uma escassa opção de tratamento, e as opções apresentam problemas quanto à toxicidade e eficácia.
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