Interpretação/Resultados

Após 16–24 horas de incubação, examinar as placas para verificar a presença de uma distorção no halo de inibição do disco de ertapenem devido ao crescimento realçado da cepa ATCC na intersecção do organismo teste e a E.coli ATCC 25922 dentro dos limites do halo. O THM positivo apresentará presença de distorção no halo de inibição de ertapenem devido ao crescimento da cepa E.coli ATCC 25922 ao longo da estria da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibição. Já o THM negativo, terá ausência de crescimento da cepa E.coli ATCC 5922 ao longo da estria da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibição do disco de ertapenem. Este resultado está representado na figura 6.

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Figura 6: Interpretação resultado do Teste de Hodge Modificado (adaptado CDC, 2004). Teste positivo na estria da cepa teste na parte superior da placa; teste negativo na estria da cepa teste na parte inferior da placa.

Tendo positivo como resultado, o paciente era um provável contaminado por KPC. As amostras então foram encaminhadas para a Fundação Osvaldo Cruz (FIOCRUZ) para confirmação final. As amostras finalmente confirmadas como positivas para KPC foram isoladas e guardadas no banco de cepas clínicas do hospital. Após a autorização do CEP, amostras das cepas foram transferidas para meio de transporte Stuard em caixa térmica fechada em baixa temperatura e levadas para o laboratório de microbiologia clínica da universidade.

No laboratório da universidade, as amostras foram separadas e realizadas repiques em meios MacConkey e incubadas por 24h. As colônias características forão isoladas em caldo BHI e mantidas em shaker a 37oC por 2h. Após isto, foram executadas as análises a seguir.

Os isolados de Enterobactérias produtoras de carbapenemases foram submetidos à extração de DNA e posterior seqüenciamento para identificação dos genes de resistência blaKPC de 1 a 13 e identificação do gene universal. Os pacientes de onde os materiais biológicos contendo as Enterobactérias produtoras de carbapenemases foram os isolados foram investigados quanto aos aspectos epidemiológicos e clínicos.

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4. 5. Extração de DNA bacteriano

A extração de DNA bacteriano foi realizada utilizando o kit NucleoSpin Plasmid® (MN). Antes de iniciar a extração foi feito a preparação das soluções/ reagentes, materiais e amostras (vortexando), colocou-se em banho-maria à 50ºC o tampão AW. Partiu-se de colônias isoladas cultivadas, que sofreram passagem em meio LB líquido por 12h. Adicionou-se 1,5 mL da amostra no tubo eppendorf, centrifugou por 5 minutos, descartou o sobrenadante (com cuidado para não descartar o Pellet). Repetiu-se este procedimento por mais três vezes, completando- se o volume de 6mL. Foram adicionados 250µL do tampão Resuspension Buffer A1, encostando a ponteira no Pellet e misturando (este tampão tem como função separar a formação de grumos celulares). Após isso, homogeneizou e vortexou os tubos eppendorfs. Após isso, foram adicionados 250µL do tampão Lysis Buffer A2, homogenizou e deixou descansar por 5 minutos (esta etapa é importante para a lise da parede e da membrana celulares, e liberação do conteúdo da célula).

Passado o tempo de descanso, foi adicionado 300µL do tampão Neutralization Buffer A3, homogeneizou e centrifugou por 10 minutos (este tampão irá retirar as proteínas que envolvem o DNA e voltará com o pH para próximo de 8, impedindo que a solução de lise facilite a quebra das ligações covalentes do ácido nucléico). Em seguida, enumeraram-se os tubos contendo filtros com sílica; transferiu-se o sobrenadante para o filtro e centrifugou por 5 minutos. Descartou-se o que foi filtrado, adicionou 500µL do tampão AW (banho-maria); centrifugou por 2 minutos. Novamente, foi descartado o filtrado. Adicionou-se 600µL do tampão A4, centrifugou por 2 minutos e descartou o filtrado (os tampões AW e A4 contêm isotiocianato de guanidina, em concentrações crescentes, para facilitar a adsorção do DNA na sílica e retirada das outras biomoléculas da amostra). Foi feita outra centrifugação com o tubo vazio. Após isto, o filtro foi trocado para outro eppendorf definitivo, onde foi adicionado 50µL do tampão Elution Buffer AE (este tampão favorece a eluição do DNA), centrifugou por 2 minutos, descartou o filtro e armazenou as amostras em freezer -20ºC.

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4. 6. Iniciadores e reação de PCR

Os iniciadores universais para o gene blaKPC foram desenhados baseados em seqüências conservadas apresentadas pelos sub-grupos de genes que codificam a enzima carbapenemase de klebsiella pneumoniae (YIGIT, et. al, 2001).

Baseado na seqüência para o blakpc-1 depositada no GenBank (AF297554.1), o oligonucleotídio (oligo) iniciador direto (5'- ATGTCACTGTATCGCCGTC-3’) foi desenhado para reconhecer a seqüência blaKPC na posição (131..149), enquanto que o iniciador reverso (5'- TTACTGCCCGTTGACGCC-3’) foi reconhecido na posição (995..1012). As análises baseadas em alinhamento de seqüências mostraram que o par de iniciadores blaKPC podem detectar os alelos de 1 a 13 do gene blaKPC conforme a tabela 2.

Tabela 2: Número de acesso ao GenBank dos alelos blaKPC e seus microrganismos originais. Número de Acesso GenBank Microrganismo Alvo AF297554.1 Klebsiella pneumoniae blaKPC-1 GU086225.1 Klebsiella pneumoniae blaKPC-2 HQ258934.1 Klebsiella pneumoniae blaKPC-2-like AB557734.1 Klebsiella pneumoniae blaKPC -3 EU447304.1 Klebsiella pneumoniae blaKPC-4 EU400222.2 Pseudomonas aeruginosa blaKPC-5 EU555534.1 Klebsiella pneumoniae blaKPC-6 EU729727.1 Klebsiella pneumoniae blaKPC-7

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FJ234412.1 Klebsiella

pneumoniae

blaKPC-8

FJ624872 Escherichia coli blaKPC-9

GQ140348.1 Acinetobacter baumannii blaKPC-10 HM066995.1 Klebsiella pneumoniae blaKPC-11

HQ342889.1 Enterobacter cloacae blaKPC-12

HQ342890.1 Enterobacter cloacae blaKPC-13

As reações de PCR para a detecção de blaKPC foram realizadas em um

primeiro tempo de desnaturação, em que foi 94ºC por 5 minutos; seguido de 30 ciclos utilizando nos passos de desnaturação, anelamento e polimerização com os respectivos comandos: 94 ºC por 60 s, 58 ºC por 60 s e 72 ºC por 90 s. Por último, no processo de extensão, 78ºC por 8 minutos. Além das amostras, foi utilizado um controle negativo

A PCR do blaKPC foi realizada utilizando os componentes para o volume da reação de 25 µL citados na tabela 3. A banda do tamanho do produto de PCR foi de 881 pares de bases (pb), o que corresponde ao plasmídeo.

Tabela 3: Reagentes utilizados para realização da reação de PCR do gene blaKPC.

Reagente Volume

DNA molde 4 µL

Tampão Taq 2,5 µL

MgCl2 0,75 µL

Mistura dos 4 nucleotídeos- dNTP

2 µL

Oligo F 1 µL

Oligo R 1 µL

Taq DNA polimerase 0,5 µL

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Total (em cada ependorff) 25 µL * * Todos exceto o Controle Negativo (CN).

Baseado na seqüência para o gene 16S rRNA, em que o oligonucleotídio Universal iniciador direto/ foward (5'-CCAGCAGCCGCCGTAATACG-3’) foi desenhado para reconhecer a seqüência universal na posição 1513, enquanto que o iniciador reverso (5'-ATCGGYTACCTTGTTACGACTTC-3’) foi reconhecido na posição 1491, foram realizadas PCR’s. As reações de PCR para a detecção deste gene foram realizadas nos seguinte tempos: separação, 94ºC por 10 minutos; 30 ciclos utilizando nos passos de desnaturação, anelamento e polimerização com os respectivos comandos: 94 ºC por 60 s, 55 ºC por 60 s e 72 ºC por 120 s. Por último, no processo de extensão, 72ºC por 10 minutos.

A PCR do gene 16S rRNA foi realizada utilizando os componentes para o volume da reação de 25µL, citados na tabela 4. A banda do tamanho do produto de PCR foi de 996 pb, correspondente á região ribossomal, capaz de amplificar todas as espécies.

Tabela 4:Reagentes utilizados para realização da reação de PCR do gene universal. Reagente (quantidade/ concentração do estoque) Volume DNA molde 10 ng 4 µL Tampão Taq 10 x 2,5 µL MgCl2 50mM 1,25 µL

Mistura dos 4 nucleotídeos- dNTP 2,5 mM

1,25 µL

Oligo F 10µM 0,5 µL

Oligo R 10µM 0,5 µL

Taq DNA polimerase 5U/µL 0,4 µL

Água Miliq 14,6 µL

Total (em cada ependorff) 25 µL * * Todos exceto o Controle Negativo (CN).

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O termociclador utilizado para os experimentos foi o LifeTouch da BIOER.

4. 7. Digestão

Para realização da digestão, foi utilizada a enzima BshF I (Hae III), EN- 1105; tamanho 7000 units; concentração 10 units/µL; fonte Bacillus sphaericus, empresa Jena bioscience.Utilizaram-se os componentes para o volume de 50µL da reação citados na tabela 5.

Tabela 5: Reagentes utilizados para realização da digestão do gene universal. Reagente Volume Produto de PCR 10 µL Enzima BshF I 0,1 µL Tampão (10x) 5 µL Água Miliq 34,9 µL

Total (em cada ependorff) 50 µL  Valores para 1 digestão

Os ependorffs foram colocados por 30 minutos em banho-maria a 37ºC. Após isso, fez-se a corrida das amostras em gel de agarose para verificação do resultado. (LU, et. al., 2000)

4. 8. Eletroforese em gel de agarose

Os produtos de DNA, PCR e digestão foram analisados em gel de agarose 2%. O tempo de corrida do gel é de aproximadamente 1hora e 30minutos, sendo que no começo foi usada à voltagem de 50 V e após começar a correr o gel, aumentou a voltagem para 100 v. Utilizou-se o marcador de 100pb (pares de bases). Foi adicionado 3µL de corante Bromophenol (que tem a função de fazer uma ligação na amostra de DNA e permitir a visualização da corrida no gel de agarose) em 7µL de amostra, tanto de DNA quanto de PCR. Para o preparo do gel foi utilizado TBE

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(Tris- Ácido Bórico), agarose e brometo de etídio (sua função é de corante para o gel e permitir a visualização do DNA, quando colocado à luz ultravioleta). Para o oligo blaKPC, a banda da amplificação foi em 881ppb, correspondendo ao plasmídeo. Já o oligo Universal foi em 996 pb.

4. 9. Descarte de resíduos

Todos os materiais utilizados nos ensaios foram de uso único e manipulados em câmaras de segurança biológica classe II. Após o uso, foram colocados em solução desinfetantes (hipoclorito a 1%), e em seguida, autoclavados a 127oC por 20 min em sacos apropriados para autoclavação. Após a finalização do ciclo de esterilização, os sacos contendo o material descartável foram colocados em recipientes de coleta da empresa responsável pela coleta de materiais biológicos produzidos no laboratório de microbiologia. Todos os procedimentos seguiram a normativa RDC-ANVISA 306/2004 sobre o descarte de resíduos de serviço de saúde.

4. 10. Aspectos epidemiológicos e clínicos

Os aspectos clínicos e epidemiológicos foram investigados por meio de prontuários dos pacientes portadores de enterobactérias produtoras de carbapenemases e envolveram topografia mais provável do foco infeccioso, a enfermidade motivadora da internação, o desfecho clínico, a idade e o tempo de internação.

4. 12. Análises eepidemiológicas

As análises foram realizadas com o pacote estatístico SPSS versão 20.0. Para verificar quais variáveis referentes aos dados epidemiológicos e microbiológicos influenciaram no desfecho, verificou- se a diferença média das variáveis idade e tempo de internação em cada grupo. O teste estatístico utilizado foi o teste t de Student, após se executar o teste de normalidade de Shapiro-Wilk. Para as variáveis sexo, perfil microbiológico das enterobactérias produtoras de

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carbapenemases, foi avaliada a associação com o desfecho por meio do teste Exato de Fisher. O nível de significância adotado foi de 5%.

4. 13. Preceitos éticos

Este projeto está inserido em um projeto maior denominado “Epidemiologia clínica e caracterização molecular do Acinetobacter Baumannii resistente a antibioticoterapia em pacientes internado em hospitais do Sistema Único de Saúde”, que foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa da Secretaria do Estado de Saúde do Distrito Federal (SES/DF) e emitido parecer aprovado pelo protocolo nº 231/09 (anexo).

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