UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA FACULDADE DE CEILÂNDIA
CURSO DE FARMÁCIA
Tawana Correa Rodrigues Amorim Rosa
Análise de aspectos epidemiológicos e clínicos e caracterização de genes de resistência das Enterobactérias produtoras de carbapenemases em um
hospital do Distrito Federal
CEILÂNDIA, DF 2014
Tawana Correa Rodrigues Amorim Rosa
Análise de aspectos epidemiológicos e clínicos e caracterização de genes de resistência das Enterobactérias produtoras de carbapenemases em
um hospital do Distrito Federal.
Monografia de Conclusão de Curso apresentada como requisito parcial
para obtenção do grau de Bacharel em Farmácia, na Universidade de Brasília, Faculdade de Ceilândia.
Orientadora: Profa. Dra.Margô Gomes de Oliveira Karnikowski Co-orientadora: Profa. Dra. Izabel Cristina Rodrigues da Silva
CEILÂNDIA, DF 2014
Tawana Correa Rodrigues Amorim Rosa
Análise de aspectos epidemiológicos e clínicos e caracterização de genes de resistência das Enterobactérias produtoras de carbapenemases em
um hospital do Distrito Federal.
Orientadora: Profa. Dr. Margô Gomes de Oliveira Karnikowski (FCe/ Universidade de Brasília)
Co-orientadora: Profa. Dr. Izabel Cristina Rodrigues da Silva (FCe/ Universidade de Brasília)
CEILÂNDIA, DF 2014
Tawana Correa Rodrigues Amorim Rosa
Análise de aspectos epidemiológicos e clínicos e caracterização de genes de resistência das Enterobactérias produtoras de carbapemases em um
hospital do Distrito Federal.
BANCA EXAMINADORA
_______________________________________ Orientadora: Profa. Dr. Margô Gomes de Oliveira Karnikovski
(FCe/ Universidade de Brasília)
_______________________________________ Profa. MSc. Micheline Marie Milward de Azevedo Meiners
(FCe/ Universidade de Brasília)
_______________________________________ Prof. MSc Daniel Oliveira Freire
(LS/ Faculdade LS)
CEILÂNDIA, DF 2014
AGRADECIMENTOS
Primeiramente á Deus, autor da vida, que me concedeu a graça e a benção de ter conquistado este sonho da graduação.
À minha amada família, principalmente meus pais Elias Amorim e Liliana Correa; irmão, Thales Correa e avó, Herondina; por serem a minha base, meu refúgio em todos os momentos, e acreditarem em mim.
À minha grande amiga de graduação Susan Suellen, por partilhar dos meus medos, alegrias, vitórias, angustias e em todos os momentos ser meu braço direito.
Ao meu amor Robson Bastos, que mais que um noivo, foi meu amigo e companheiro, me apoiando e me incentivando.
À minha querida orientadora Dra.Margô Gomes e querida co-orientadora, Dra. Izabel Cristina, por acreditarem em mim, me dando a oportunidade de trabalhar com elas. Além do apoio, ensino e dedicação.
À todos os professores (as) da Universidade de Brasília- Faculdade de Ceilândia, pelo ensino e pela contribuição na minha formação acadêmica.
À MSc. Fabiana Cartaxo, pela ajuda e apoio, além da prontidão quando solicitada a sua ajuda.
Ao professor mestre Daniel Oliveira e a técnica de laboratório Thais Mendes; pela ajuda laboratorial, contribuindo para a realização de um bom trabalho.
RESUMO
Introdução: A Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) é uma enzima produzida por bactérias gram-negativas (enterobactérias), que confere resistência aos antimicrobianos carbapenêmicos: meropenen, ertapenen, imipenen; classe amplamente utilizada no tratamento de infecções envolvendo Enterobacteriaceae. Esta resistência é uma das principais causas de falha terapêutica, devido à produção de beta-lactamases de espectro estendido (ESBL) por esta bactéria, mecanismo de resistência mais comum aos antibióticos beta-lactâmicos de amplo espectro. A identificação destas enterobactérias pode ser feita através de técnicas de identificação molecular de patógenos, dentre elas a Reação em Cadeia de Polimerase (PCR); que consiste na análise do padrão de amplificação de elementos repetidos encontrados no genoma bacteriano, permitindo uma maior rapidez na obtenção de resultados quando comparada com outros métodos, além de apresentar alta reprodutibilidade, simples execução e implementação, dependendo da aplicação da técnica não enfrenta problemas com a degradação do DNA. Objetivo: Caracterizar genes de resistência das Enterobactérias produtoras de carbapenemases e aspectos epidemiológicos e clínicos de pacientes internados em um hospital público do Distrito Federal. Materiais e métodos: Estudo transversal onde foi realizado o teste de susceptibilidade das Enterobactérias aos antibióticos Carbapenêmicos, a partir dos materiais biológicos coletados dos pacientes internados no Hospital Regional da Asa Norte (HRAN). Análise molecular dos genes 16S rRNA e blaKPC, utilizando PCR; além de análises estatísticas. Resultados e discussão: Detectou-se a região ribossomal e o gene de resistência testado, confirmando a resistência microbiana. Maior prevalência de pacientes do sexo masculino (53%), desfecho clínico de óbito(59%), sítio de infecção de swab retal (47%), Klebsiella pneumoniae foi microrganismo mais encontrado (82%). Não houve diferença estatística entre as variáveis e o desfecho clínico (p foi > 0,05). Conclusão: Através da caracterização molecular dos genes de resistência blaKPC e Universal, confirmou-se a presença de Klebsiella pneumoniae, resistente aos carbapenêmicos. Os valores de p não foram significativos (<0,05), sendo assim,nenhuma das variavéis estudadas foram o principal motivo do desfecho clínico (alta ou óbito).
Palavras chaves: Klebsiella pneumoniae carbapenemase; Resistência bacteriana a antimicrobianos; β-lactamases de espectro estendido (ESBL); Reação em Cadeia de Polimerase (PCR).
ABSTRACT
Introduction: Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) is an enzyme produced by gram - negative bacteria (Enterobacteriaceae), which confers resistance to carbapenem antibiotics: meropenen, ertapenen, imipenem; class widely used in the treatment of infections involving Enterobacteriaceae. This resistance is a major cause of treatment failure due to beta-lactamases production of extended spectrum (ESBL) by this bacterium most commonly resistance to beta-lactam antibiotics of wide spectrum engine. The identification of these Enterobacteriaceae can be made by techniques of molecular identification of pathogens, among them the Polymerase Chain Reaction (PCR); which consists in the analysis of the amplification pattern of repeated elements found in the bacterial genome, allowing faster in getting results when compared with other methods, in addition to presenting high reliability, simple implementation and deployment, depending on the application of the technique has no trouble with the degradation of DNA. Objective: To characterize the resistance genes of Enterobacteriaceae producing carbapenemases and epidemiological and clinical features of patients admitted to a public hospital in the Federal District aspects. Materials and methods: Cross-sectional study where susceptibility testing of Enterobacteriaceae to antibiotics Carbapenems, from biological materials collected from patients admitted to the Hospital Regional da Asa Norte ( HRAN ) was performed . Molecular analysis of 16S rRNA genes and blaKPC using PCR; in addition to statistical analysis. Results and Discussion: Was detected region and the ribosomal tested resistance gene, confirming the microbial resistance. Higher prevalence of male patients (53 %), clinical outcome of death (59 %), site of infection rectal swabs (47 %), Klebsiella pneumoniae was found more microorganism (82%). There was no statistical difference between the variables and the clinical outcome (p was > 0.05). Conclusion: Through molecular characterization of genes and the Universal blaKPC resistance confirmed the presence of Klebsiella pneumoniae resistant to carbapenems. P values were not significant (< 0,05), so none of the variables studied were the main reason the clinical outcome (discharge or death).
Keywords: Klebsiella pneumoniae Carbapenemase; Bacterial resistance to
antibiotics; Extended-Spectrumβ-lactamases (ESBL); Polimerase Chain Reaction (PCR).
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Ação do ß-lactâmico sobre a bactéria gram-positiva e gram-negativa. Figura 2: Divulgação internacional de Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) produtoras de Enterobacteriaceae.
Figura 3: Mecanismos de resistência bacteriana. Figura 4: Etapas da Reação de PCR.
Figura 5: Mecanismo de semeamento de material biológico oriundos de pacientes com suspeita de infecção por KPC.
Figura 6: Interpretação resultado do Teste de Hodge Modificado.
Figura 7: Gel de agarose a 2% da amplificação do gene blaKPC das amostras dos 17 pacientes estudados.
Figura 8: Gel de agarose a 2% da amplificação do gene blaKPC da mostra A3 estudada.
Figura 9: Gel de agarose a 2% da amplificação do gene 16S rRNA das amostras dos 17 pacientes estudados.
Figura 10: Gel de agarose a 2% da digestão do amplicon do gene 16S rRNA das amostras com a enzima HaeIII, evidenciando diversos fragmentos próximos a 200 pb.
Figura 11: Infecção por KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados no HRAN, no período de 2010 á 2011.
Figura 12:Isolado de KPC segundo desfecho clínico dos 17 pacientes investigados no HRAN, no período de 2010 á 2011.
Figura 13: Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17 pacientes investigados no HRAN, no período de 2010 á 2011.
Figura 14:Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17 pacientes investigados no HRAN, no período de 2010 á 2011.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Critérios Interpretativos para testes de sensibilidade.
Tabela 2: Número de acesso ao GenBank dos alelos blaKPC e seus microrganismos
originais.
Tabela 3: Reagentes utilizados para realização da reação de PCR do gene blaKPC. Tabela 4: Reagentes utilizados para realização da reação de PCR do gene universal.
Tabela 5: Reagentes utilizados para realização da digestão do gene universal.
Tabela 6 - Distribuição das variáveis estudadas: perfil genético, sexo, coleta, tipificação de microrganismos e análise da resistência bacteriana segundo o desfecho clínico. Brasília-DF, 2010 a 2012.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AmpC- Adenosina Monofosfato Cíclico BRMD- Bactérias multirresistentes
CCIH- Comissão de Controle de Infecção Hospitalar CDC- Centers for Disease Control and Prevention CIM- Concentração Inibitória Mínima
CLSI- Clinical and Laboratory Standards Institute
DNA- Ácido Desoxirribonucléico E. coli- Escherichia coli
ERIC-PCR - Enterobacterial Repet it ive Intergenic Consensus ESBL- Beta-Lactamases de Espectro Estendido
Et. al- e outros ETP- Ertapenem
HRAN- Hospital Regional da Asa Norte
K. ornithinolytica- Klebsiella ornithinolytica K. oxytoca- Klebsiella oxytoca,
K. planticola- Klebsiella planticola K. pneumoniae- Klebsiella pneumoniae K. terrigena- Klebsiella terrigena
KPC - Klebsiella pneumoniae produtora de Carbapenemase KPCNEG- Bacilos Gram-Negativos Não Fermentadores KPCPOS- Bacilos Gram-Positivo Não Fermentadores MBL- metalo-beta-lactamases
MEM- Meropenem N/A- Não se aplica Oligo- Oligonucleotídeos PB- Pares de Bases
PBPs (Penicilim-Binding-Protein)- Proteínas de ligação à penicilina. PCR- Polymerase Chain Reaction (Reação em Cadeia da Polimerase) PFGE - "Pulsed-Field Gel Electrophoresis" (Eletroforese em campo pulsado)
RAPD- Randomly Amplified Polymorphic DNA (DNA polimórfico amplificado aleatoriamente)
RFLP’s - “Restriction Fragment Length Polymorphisms”( polimorfismos de tamanho de fragmentos de restrição)
THM- Teste de Hodge Modificado
TSA- Teste de Susceptibilidade aos Antibióticos UTI- Unidade de Terapia Intensiva
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 15
1.1. Klebsiella pneumoniae produtora de Carbapenemase (KPC) ... 15
1. 2. Resistência bacteriana ... 20
1.3. Análise genética de microrganismos ... 27
2. JUSTIFICATIVA ... 30
3. OBJETIVOS ... 31
3.1. Objetivo geral. ... 31
3.2. Objetivos Específicos: ... 31
4. MATERIAIS E MÉTODOS ... 32
4. 1. Coleta e transporte das amostras biológicas ... 32
4. 2. Procedimentos para confirmação de resistência bacteriana por disco de Ertapenem (adaptado CDC, 2004) ... 32
4. 2. 1. Interpretação dos Resultados ... 33
4. 3. Teste de susceptibilidade aos antibióticos ... 34
4. 4.Teste de Hodge Modificado (THM) (adaptado CDC, 2004) ... 35
4.4.1 Controle de qualidade (C.Q) ... 35
4.4.2 Interpretação/Resultados ... 35
4. 5. Extração de DNA bacteriano ... 37
4. 6. Iniciadores e reação de PCR ... 38
4. 7. Digestão ... 41
4. 8. Eletroforese em gel de agarose ... 41
4. 9. Descarte de resíduos ... 42
4. 10. Aspectos epidemiológicos e clínicos ... 42
4. 12. Análises estatísticas ... 42
4. 13. Preceitos éticos ... 43
5.1. Análise molecular ... 44 5. 1. 1. Gene blaKPC ... 44 5. 1. 2. Gene 16S rRNA ... 45 5. 2. Análises epidemiológicas ... 46 5. 2. 1. Sexo ... 46 5. 2. 2. Desfecho clínico ... 47 5. 2. 3. Local da coleta ... 48 5. 2. 4. Microrganismo ... 48 6. DISCUSSÃO ... 53 7. CONCLUSÃO ... 57
15
1. INTRODUÇÃO
1.1. Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC)
Klebsiella pneumoniae pertence á família Enterobacteriaceae,
encontrado em locais como água, solo, plantas e esgoto. São encontradas cinco espécies, K. pneumoniae, K. oxytoca, K. planticola, K. terrigena e K. ornithinolytica.
O gênero Klebsiella é definido como contendo bacilos Gram-negativos, não móveis,
em forma de bastão e geralmente encapsuladas, que produzem lisina descarboxilase, mas não produzem ornitina descarboxilase. Provavelmente a colonização em seres humanos ocorre por contato com as diferentes fontes ambientais, podendo ser encontrada colonizando a orofaringe e fezes de pessoas sadias. Pessoas imunocomprometidas, a bactéria encontra um ambiente favorável para seu crescimento, levando aos quadros de infecção (MOREIRA, et. al., 2014).
A Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) é uma enzima produzida por enterobactérias gram-negativas, sendo um mecanismo de resistência aos antimi-crobianos carbapenêmicos meropenen, ertapenen e/ou imipenen; classe amplamente utilizada no tratamento de infecções envolvendo Enterobacteriaceae. Ela também é capaz de inativar os agentes β-lactâmicos: cefalosporinas, penicilinas e o aztreonam (COTRIM, et. al., 2012).
Devido à semelhança estrutural e estereoquímica, os antibióticos beta-lactâmicos possuem um mecanismo de ação comum ao grupo. Eles atuam inibindo a síntese da parede celular bacteriana, através do mecanismo de bloqueio da transpeptidação responsável pela união dos componentes individuais do peptidoglicano, conforme demonstrado na figura 1 (KIDWAI, et. al., 1999). A ação destes antibióticos é através de ligações covalentes com as proteínas, as Penicilim-Binding-Protein (proteína de ligação da penicilina- PBP ou PLP), que se encontram presentes na membrana citoplasmática de todas as bactérias. Devido às mutações, ocorre uma indução na alteração dessas proteínas, podendo determinar uma diminuição da afinidade dos beta-lactâmicos às mesmas. A ação dos carbapenêmicos é através da sua ligação às PBPs presentes na parede bacteriana, especialmente as PBP1 e PBP2, provocando a lise osmótica da bactéria. Além disso, eles têm uma facilidade na penetração da bactéria, por meio dos canais porínicos presentes nas bactérias gram-negativas, induzindo um efeito
pós-16
antibiótico. Quando comparados com outros beta-lactâmicos, os carbapenêmicos são mais resistentes à hidrólise pela maioria das beta-lactamases, tanto cromossômicas como plasmídicas (LIVERMORE, 1995; LIVERMORE, et. al., 2000).
Figura 1: Ação do ß-lactâmico sobre a bactéria positiva e
gram-negativa. Fonte:
<<http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/controle/rede_rm/cursos/rm_controle /opas_web/modulo3/gramn_lacta2.htm> (adaptado)
A bactéria Klebsiella pneumoniae quando apresenta gene ESBL, pode expressar resistência a até 95% dos antimicrobianos existentes no âmbito farmacêutico, sendo a produção de beta-lactamases de espectro estendido (ESBL)
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por esta bactéria, uma das principais causas de falha terapêutica. Existem outras formas de resistência emergentes, de grande importância, como a produção de beta-lactamases tipo adenosina monofosfato cíclico (AmpC), que hidrolizam cefoxitina; as carbapenemases, como as metalo-beta-lactamases (MBL) e carbapenemases tipo KPC (MOREIRA, et. al., 2014).
O mecanismo de resistência mais comum aos antibióticos beta-lactâmicos de amplo espectro é a produção de ESBL por enterobactérias. A ação hidrolítica apresentadas por estas enzimas pode conferir, clinicamente, resistência ao aztreonam, cefalosporina e a todas as penicilinas (PATERSON, et. al., 2005). As ESBL são enzimas mediadas por genes plasmidiais (transmissíveis entre as espécies). Os principais microrganismos produtores de ESBL são Klebsiella
pneumoniae (mais encontrada), Escherichia coli e Proteus mirabilis, podendo ocorrer
em outros membros da família Enterobacteriaceae e em alguns microrganismos não entéricos, como Acinetobacter ssp (TURNER, 2005). A importância clínica médica destes microrganismos portadores de ESBL é que, graças ás suas resistências a muitas classes de antimicrobianos, o tratamento de infecções é difícil, gerando um aumento da morbidade e mortalidade dos pacientes (SHAH, et. al., 2004).
A enzima KPC foi detectada pela primeira vez na Carolina do Norte Costa Leste dos Estados Unidos, no ano de 1996, em Klebsiella pneumoniae, dando então este nome a enzima. Em pouco tempo ela disseminou por outras regiões e recentemente, tornou-se uma das preocupações quanto à saúde pública mundial. Os países de onde KPCs têm sido relatados desde 2001 são mostrados na figura 2, apresentando como os organismos têm agora sido disseminados amplamente pelo mundo (NEIL GUPTA, et. al., 2011).
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Figura 2: Divulgação internacional de Enterobacteriaceae produtora de
Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC)( NEIL GUPTA et. al., 2011).
Este mapa apresenta países onde Enterobacteriaceae produtoras KPC de foram descritos em relatórios publicados disponíveis a partir de 11 fevereiro de 2011. Os países não destacadas nesta figura também podem apresentar a presença de Enterobacteriaceae produtoras de KPC, porém, pode ter tido uma falta de vigilância sistemática para estes organismos ( NEIL GUPTA, et. al., 2011).
No ano de 2005 foram registradas pela primeira vez essas bactérias produtoras de carbapenemases. Após 6 anos deste primeiro relato, elas passaram a causar surtos mais graves em nosso país. Em janeiro de 2011, foram notificados no Distrito Federal/Brasil, 367 casos em um curto espaço de tempo (01 a 08 de janeiro de 2011), com 26 óbitos. A maior parte destes casos (263 casos) foi identificada nas unidades de terapia intensiva – UTI (COTRIM, et. al., 2012).
O potencial de disseminação da KPC é alto, devido à grande capacidade de transferência do seu material genético, e, por conseguinte, os genes de resistência. O controle de epidemias é difícil devido a esta característica de fácil disseminação, preocupando os profissionais da área de saúde, devido à dificuldade de tratamento, podendo resultar em um aumento das taxas de mortalidade. Apesar da maior
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freqüência em Klebsiella pneumoniae, a KPC pode ser identificada em outras bactérias, como a Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii, Salmonella spp., E. coli e Pseudomonas spp. (DIENSTMANN, et. al., 2010).
Os pacientes com comorbidades incluindo pacientes transplantados, neutropênicos, em ventilação mecânica, em Unidade de Terapia Intensiva (UTI), com longos períodos de internação que apresentam risco aumentado de infecção ou colonização para bactérias multirresistentes; são mais vulneráveis a Klebsiella
pneumoniae produtora de KPC (COTRIM, et. al., 2012).
Os sinais e sintomas apresentados por um indivíduo infectado por KPC são febre ou hipotermia, taquicardia, piora do quadro respiratório e em casos mais graves hipotensão, inchaço e sepse. Quanto ao sítio de infecção, a bactéria que possui a enzima KPC pode causar pneumonia associada à ventilação mecânica, infecção do trato urinário, infecção de corrente sanguínea, infecção de partes moles e outros tipos de infecção (COTRIM, et. al., 2012)
Para desenvolver a infecção, a colonização é um pré-requisito, porém o pacientes pode estar colonizado, ou seja, ser portadores de KPC, e não desenvolver a infecção (ALVES, et. al., 2013). A forma de transmissão é basicamente por contato com secreção ou excreção de pacientes infectados ou colonizados, logo, fora do ambiente hospitalar, a bactéria não representa perigo (COTRIM, et. al., 2012).
As opções terapêuticas para o tratamento da Klebsiella pneumoniae, é dividida em: Terapia Empírica e Terapia após a determinação do perfil de sensibilidade. A terapia empírica para infecções por enterobactérias multirresistentes se baseia na utilização de polimixina B ou polimixina E (Colistina) em associação com um (1) ou mais dos antimicrobianos da classe dos aminoglicosídeos (gentamicina ou amicacina), Carbapenêmicos (meropenem ou doripenem) e/ou tigeciclina (ANVISA, 2013).
Recomenda-se usar sempre associações de dois ou três antimicrobianos, sendo um deles a polimixina B ou a polimixina E (colistina). Deve-se evitar a utilização de monoterapias pelo risco de rápido desenvolvimento de resistência. A escolha do(s) fármaco(s) de associação com polimixina B ou E deve se basear, preferencialmente, no perfil de susceptibilidade esperado aos referidos
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medicamentos das enterobactérias resistentes aos carbapenêmicos detectadas no hospital ou, na ausência de dados locais, na região. Deve-se considerar igualmente o local de infecção e a penetração esperada do antimicrobiano na escolha da droga a ser utilizada na combinação (ANVISA, 2013).
Após a liberação do perfil de sensibilidade deve-se adequar o uso dos medicamentos. Sempre que possível, manter no mínimo 2 (dois) fármacos com sensibilidade comprovada in vitro. Não havendo sensibilidade a um segundo medicamento (suscetibilidade apenas à polimixina B ou E), recomenda-se manter a terapia combinada de polimixina B ou E com carbapenêmicos (meropenem ou doripenem) ou tigeciclina, na tentativa de ocorrência de sinergismo entre elas (ANVISA, 2013).
Sugere-se além da determinação das Concentrações Inibitórias Mínimas (CIMs) para uma das polimixinas (B ou E), que também sejam determinadas as CIMs de tigeciclina e carbapenêmicos (meropenem), bem como a consultoria de um infectologista (ou Comissão de Controle de Infecção Hospitalar- CCIH) para a determinação da terapia combinada com base na interpretação do antibiograma / CIM e quadro clínico do paciente. No caso de resistência às polimixinas (concentrações inibitórias mínimas [CIMs] > 2 mg/L), recomenda-se a associação de dois ou três do antimicrobianos sugeridos para a combinação (ANVISA, 2013).
A antissepsia eficiente do ambiente, dos instrumentos cirúrgicos e das mãos com o uso do álcool a 70%, é fundamental para a contenção de surtos. Além disto, os pacientes contaminados devem permanecer isolados, até o controle da infecção, para evitar a disseminação da bactéria (COTRIM, et. al., 2012).
1. 2. Resistência bacteriana
Hoje a disseminação e a proliferação das bactérias resistentes estão cada dia mais presente. As bactérias multirresistentes (BRMD) poderão levar à humanidade a uma era pós-antibiótica, resultando em uma ausência de qualquer opção de tratamento para os portadores destas cepas (HENRIQUE, et. al., 2014).
Os fatores envolvidos na disseminação desses patógenos multirresistentes são diversos, incluindo o uso irracional de antimicrobianos, procedimentos invasivos
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(cirurgias, implantação de próteses médicas e outros) e a transferência de material genético com a informação de resistência a antibióticos entre as bactérias (DIENSTMANN, et. al., 2010; ENDIMIAMI, et. al., 2009; FONTANA, et. al., 2010).
Com a prática da antibioticoterapia, principalmente em ambientes nosocomiais, os mecanismos de resistência tornaram-se comuns. Esses mecanismos incluem: alteração na permeabilidade da membrana celular, que impede a entrada do antibiótico na célula, bombeamento do antibiótico para fora da mesma, pelo mecanismo de efluxo; mutação genética que altera de alguma forma o alvo do antibiótico e, conseqüentemente, não afeta o funcionamento da bactéria, bem como desenvolvimento da capacidade de degradar ou da inativação do antibiótico (COTRIM, et. al., 2012). Estes mecanismos estão representados na figura 3.
Figura 3: Mecanismos de resistência bacteriana. Fonte: <http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/controle/rede_rm/cursos/rm_controle/ opas_web/modulo3/pop_mecanismo.htm>.
Um dos mais importantes mecanismos de resistência é a alteração do local-alvo onde atua determinado antimicrobiano, de modo a impedir a ocorrência de qualquer efeito inibitório ou bactericida. As bactérias podem adquirir um gene que
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codifica um novo produto resistente aos antimicrobianos, substituindo o alvo original, por exemplo, o Staphylococcus aureus resistente à oxacilina e estafilococos coagulase-negativos adquiriram o gene cromossômico Mec A e produzem uma PBP ou PLP resistente aos β-lactâmicos, denominada 2a ou 2', que é suficiente para manter a integridade da parede celular durante o crescimento, quando outras PBPs essenciais são inativadas por antibimicrobianos β-lactâmicos. Como alternativa, um gene recém-adquirido pode atuar para modificar um alvo, tomando-o menos vulnerável a determinado antimicrobiano. Assim, um gene transportado por plasmídeo ou por transposon codifica uma enzima que inativa os alvos ou altera a ligação dos antimicrobianos como ocorre com eritromicina e clindamicina (ANVISA, 2007).
Em função da bomba de efluxo, pode variar a especificidade do antibiótico. Ele atua por meio do bombeamento ativo de antimicrobianos do meio intracelular para o extracelular, gerando uma resistência bacteriana a determinados antimicrobianos, como é o caso da resistência às tetraciclinas codificada por plasmídeos em Escherichia coli, devido à presença de proteínas integrantes da membrana plasmática bacteriana (PIDDOCK, 2006).
O aumento da síntese de proteínas é o principal responsável pela resistência antimicrobiana devido às várias mutações que ocorrem em seus repressores transcricionais. Estas mutações também podem influenciar levando a um aumento da eficiência do transporte dos antibióticos para o exterior da célula (HARBOTTLE, et. al., 2006).
A resistência aos antibióticos é freqüentemente associada à alteração/ diminuição da permeabilidade que ocorre na membrana externa das bactérias gram-negativas. O fluxo de moléculas para o interior da célula ocorre por características peculiares como carga, estrutura e dimensão e através de proteínas de membrana, as quais formam canais. Este percurso é utilizado pelos antibióticos para atingir o interior da célula bacteriana ou o espaço periplasmático como é o caso dos antibióticos β-lactâmicos. Portanto, a perda de função destas proteínas, pode efetivamente causar a diminuição da susceptibilidade a vários antibióticos (LIVERMORE, 2003).
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Os mecanismos de resistência que podem impedir a ação de antimicrobianos são vários. O fármaco atua de forma a inibir os processos essenciais a multiplicação e sobrevivência da célula bacteriana, como a membrana citoplasmática e, conseqüentemente, bloqueando a síntese protéica, de ácidos nucléicos e da parede celular. A resistência bacteriana é um mecanismo natural de defesa. Sendo assim, as bactérias estão em constante defesa, e para cada novo fármaco desenvolvido, as bactérias irão desenvolver resistência em algum momento (POSSEBON, et. al., 2003).
O grupo de antibióticos beta-lactâmicos são amplamente utilizado e se encontram dentro da classe dos melhores agentes antimicrobianos com relevância clínica. No entanto, o seu uso tem sido restringido devido a vários mecanismos de resistência. O desenvolvimento dos carbapenêmicos surgiu devido à proliferação de beta-lactamases, mediadas por plasmídeos e cromossomos (POSSEBON, et. al., 2003).
A bactéria KPC tem um gene chamado SHV-1 que tem a característica de resistência a quase todos os tipos de antimicrobianos, inclusive os carbapenêmicos, específicos para o tratamento de infecções por bactérias multiresistentes e emergências. Mesmo com no seu código genético a informação necessária para o desenvolvimento da resistência, a resistência da bactéria só é desenvolvida caso a bactéria entre em contato com o antibacteriano, desencadeando todo o processo, nos casos de resistência induzida, comuns em KPC (MOREIRA, et. al., 2014).
A resistência bacteriana pode ser apresentada de forma intrínseca ou adquirida. A resistência intrínseca faz parte das características fenotípicas/ naturais do microrganismo, ou seja, faz parte de sua herança genética sendo transmitida verticalmente a prole sem perda da característica. A presença ou ausência do alvo para a ação da droga é o principal determinante deste tipo de resistência. (MOREIRA, et. al., 2014). Essa resistência corresponde a uma característica de espécie bacteriana, quando estes microrganismos são naturalmente resistentes a certo tipo de antibiótico. Este processo é decorrente da ausência de estruturas de atuação de antimicrobianos ou a impermeabilidade, por parte de estruturas periféricas das bactérias (HENRIQUE, et. al., 2014).
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A resistência adquirida aos antibióticos, por sua vez, ocorre quando há uma da mutação de genes reguladores ou estruturais, aquisição de genes de resistência veiculados por elementos genéticos móveis ou da combinação entre eles. Este aparecimento de resistência em uma espécie bacteriana era anteriormente sensível a droga, e devido a um destes fatores se torna resistente. O fenótipo resultante desta resistência não estará presente nas células genitoras, e sim nos indivíduos de uma linhagem bacteriana derivada de um organismo susceptível. Os genes muitas vezes são adquiridos por meio de elementos móveis, como plasmídeos e transposons (MOREIRA, et. al., 2014).
Então, a resistência adquirida ocorre por diversos mecanismos genéticos, tais como: produção de enzimas inativadoras, interferência com a entrada e acúmulo de droga na bactéria, alteração do receptor para ação da droga, via metabólica alternativa. É originada por meio de uma alteração a nível genético da célula, de natureza cromossômica pelos processos de mutação, transdução e transformação ou extra cromossômica (plasmidial) (HENRIQUE, et. al., 2014).
Como todo antibiótico β-lactâmico,os carbapenêmicos tem como mecanismo de ação a inibição da síntese protéica, através da ação de inibição da parede microbiana, fazendo a ligação e inativação das proteínas ligadoras de penicilinas (NETO, et al., 2007).
Imipenem e meropenem, antibióticos pertencentes ao grupo dos carbapenêmicos, possuem um amplo espectro de ação in vitro, incluindo atividade contra cocos gram-positivos, bacilos gram-negativos e bactérias anaeróbias (MOHR, 2008). Já o ertapenem, possui um espectro de ação mais limitado que o os dois antibióticos anteriormente citados, tendo uma eficiência limitada contra os bacilos gram-negativos não fermentadores. Um novo antibiótico carbapenêmico ainda não disponível no Brasil, doripenem, possui uma atividade mais potente principalmente contra Pseudomona aeruginosa, devido ao seu mecanismo de ação que combina os espectros de ação de imipenem e meropenem (ZHANEL, et. al., 2007).
Devido as suas estabilidades, espectro de ação, poucos relatos de resistência, boa tolerância pelos pacientes, com efeitos adversos mais comuns as complicações no sítio da infusão e toxicidade gastrintestinal; estes antibióticos carbapenêmicos têm sido considerados terapia de escolha (NICOLAU, 2008). Como
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uma resposta adaptativa das Enterobactérias, o índice de resistência aos carbapenêmicos tem aumentado nos últimos anos de forma proporcional ao seu uso, limitando imensamente as opções terapêuticas para as infecções causadas por estes microrganismos (FALAGAS, et. al., 2009).
As enzimas produtoras de betalactamases hidrolisam o anel betalactâmico, tornando este mecanismo de resistência o mais importante. Os dois grupos mais preocupantes são o grupo das betalactamases de aspecto ampliado e os da carbapenemases, que além de hidrolizar os carbapenêmicos, hidrolizam todas as outras classes de betalactâmicos. Em enterobactérias, as carbapenemases mais prevalentes são codificadas por genes dos grupos blaKpc, blaIMP, blaVIM, blaNdm e blaOxa . A ocorrência de carbapenemases é mais frequentemente em bactérias gram-negativas fermentadoras da glicose, conhecidas como enterobactérias, predominantes nos gêneros Klebsiella, Serratia, Citrobacter, Enterobacter,
Escherichia, Samonella, Proteus, Morganella . Podem ser encontradas também em
bactérias gram-negativas não fermentadoras, como espécies de Acinetobacter, e de
Pseudomonas (ALVES, et. al., 2013).
Carbapenemases são enzimas plasmídio-mediados resistentes a todos antibióticos betalactâmicos. As bactérias que possuem o gene blaKpC, responsável pela codificação da produção de carbapenemases, apresentam resistência aos antibióticos betalactâmicos, impedindo a ação destes antibióticos contra infecções (ALVES, et. al., 2013).
A transmissão das carbapenemases a diferentes cepas de enterobactérias se dá através de plasmídeos, que são pequenas moléculas circulares de DNA, com a capacidade de se replicarem, independentemente do DNA cromossômico, permitindo a troca de material genético entre gêneros e espécies diferentes de enterobactérias. O rápido desenvolvimento de surtos em ambientes hospitalares é explicado por essa disseminação plasmidial (COTRIM, et. al., 2012).
De acordo com o critério de interpretação do Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI, 2009), a maioria das KPC isoladas não apresenta
resistência completa aos carbapenêmicos (Imipenem e Meropenem apresentam uma Concentração Inibitória Mínima (CIM) de 2-8 μg/mL) (COTRIM, et. al., 2012).
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Os mecanismos de resistência capazes de impedir a ação dos carbapenêmicos são vários. Porém, a degradação de antibióticos por enzimas principalmente as carbapenemases, constituem o principal mecanismo de resistência aos antibióticos β-lactâmicos (DIAS, 2009). Devido a ampla atividade hidrolítica à maioria dos antibióticos β-lactâmicos, estes grupos de enzimas possuem alta versatilidade (QUEENAM, et. al., 2007).
Existem três grandes classes moleculares de Ambler, a qual as carbapenemases pertencem denominadas: classe A (serino-carbapenemases, os quais incluem membros designados SME, IMI, NMC, GES e a família das KPCs); classe B(as metalo-β-lactamase incluem os tipos IMP e VIM) e classe D (oxacilinases, similares as da classe A, e incluem as OXA e PSE) (DIAS, 2009).
Dentre estes, as mais importantes e prevalentes encontradas em plasmídeos de Klebsiella pneumoniae são as KPC (DIENSTMANN, et. al., 2010). Por meio de estudos moleculares, a enzima KPC já foi documentada em diferentes bactérias e diferenciada em KPC-1 a 13 (NETIKUL, et. al., 2011). No ano de 2009, foi realizada uma pesquisa onde descreveram as seguintes carbapenemases: KPC-1 em isolados de Klebsiella pneumoniae; KPC-2 em K. pneumoniae, K. oxytoca, Salmonella
enterica e em Enterobacter sp e KPC-3 em K. pneumoniae e Enterobacter cloacae
(MONTEIRO, et. al., 2009). As enzimas KPC-4 e KPC-5 foram encontradas em isolados de Pseudomonas aeruginosa (PEIRANO, et. al., 2009).
Foi observada uma correção da seqüência KPC-1 indicando que o gene blaKPC-1 e blaKPC-2 são idênticos. Três novas variantes blaKPC-3, blaKPC-4 e blaKPC-5, são resultados de mutações do gene estrutural da enzima KPC-2 (WOLTER, et. al., 2008), apresentando diferentes perfis de hidrólise. As enzimas KPC-2 e KPC-3 possuem alta eficiência em hidrolisar cefalotina, cefaloridina e nitrocefin, porém possuem uma menor eficiência contra carbapenêmicos e cefotaxima (ALBA, et. al., 2005). As enzimas KPC-5 e KPC-4 apresentam menor hidrólise de carbapenêmicos é do que em KPC-2. Em contrapartida, possuem melhor eficiência contra ceftazidima e uma maior inibição pelo ácido clavulânico (WOLTER, et. al., 2008).
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1.3. Análise genética de microrganismos
É de extrema importância prática, não só no aspecto clínico, mas também na fitopatologia, biotecnologia e estudos ambientais; a correta identificação e classificação de microrganismos. Os métodos usados na diferenciação de gêneros, espécies e estirpes de microrganismos podem ser divididos em métodos fenotípicos (baseados em fenômenos bioquímicos, fisiológicos e biológicos) e genotípicos (detectam polimorfismos ao nível dos ácidos nucléicos, ou variação alélica ao nível de enzimas) (ALVES, et. al., 2003).
Para este tipo de estudo, existem alguns métodos como o RFLP’s - “Restriction Fragment Length Polymorphisms” (polimorfismos de tamanho de fragmentos de restrição); rep-PCR (Método de tipagem baseado na amplificação via PCR de elementos de DNA repetitivos presentes em genomas bacterianos); análise de seqüências nucleotídeas (discriminação e/ou identificação através de seqüências de DNA); PFGE - "Pulsed-Field Gel Electrophoresis" (Eletroforese em campo pulsado) ( A L V E S, et. al., 2003).
A diferenciação clara da cepa e principalmente a alta reprodutibilidade, devem ser características de qualquer método de tipagem genética. Porém, nem todos os métodos moleculares de tipagem são igualmente eficazes. Sendo assim, de acordo com a finalidade pretendida (identificação, diferenciação, custo, reprodutibilidade, etc.), é feita a escolha do método a ser aplicado (A L V E S, et. al., 2003).
O processo de identificação fenotípica de KPC entre os membros da família
Enterobacteriaceae ainda é difícil, e os métodos para a sua identificação devem ser
revistos e ajustados. Mesmo com o avanço tecnológico, não existem ensaios que combinam alta especificidade e sensibilidade na detecção destas enzimas. São diversas as metodologias usadas para rastreamento de KPC; como por exemplo, a focalização isoelétrica, a técnica de disco-difusão, E-test, teste de Hodge modificado, dentre outros. Além disso, a pesquisa do gene blaKPC pode ser feita pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Os sistemas de automação existentes, no entanto, podem não identificar com precisão os isolados KPC positivos (COTRIM, et. al., 2012).
A identificação blaKPC pelo PCR é um método rápido, preciso, sensível e altamente específico; no entanto, a PCR exige equipamento e conhecimentos
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especializados em diagnóstico molecular, dificultando ainda a utilização dele na rotina dos laboratórios de microbiologia (COTRIM, et. al., 2012).
Em estudo de infecções hospitalares, identificação molecular de patógenos bacterianos é bastante utilizada. Para diferenciar carbapenemases tipo KPC a partir de outros tipos como SME, NMC-A-IMI, e GES; é necessário um exame molecular. As identificações do microrganismo, juntamente com a triagem molecular, irão definir um resultado mais específico, podendo ser usado para identificar o antibiótico mais adequado para o tratamento. Porém, a principal desvantagem de alguns exames baseados em PCR, por exemplo, é que devido à sua limitada capacidade de multiplexação, eles distinguem apenas algumas variações (MOREIRA, et. al., 2014).
Estão descritas para a identificação molecular de patógenos pertencentes à família Enterobacteriaceae as técnicas de PFGE, RAPD (randomly amplified polymorphic DNA) e ERIC-PCR (Enterobacterial Repet it ive Intergenic Consensus). A PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) é considerada padrão ouro devido sua alta capacidade de diferenciação, baseada na análise do perfil de restrição do DNA genômico por meio de eletroforese. Como desvantagem, para a sua execução é necessários vários dias, impedindo a tipagem de algumas cepas bacterianas devido à degradação do DNA, além do alto custo empregado (MOREIRA, et. al., 2014).
O método baseado em ERIC-PCR tem sido bastante utilizado como uma alternativa para a técnica de PFGE. Esta técnica consiste na análise do padrão de amplificação de elementos repetidos encontrados no genoma bacteriano. Isto permite uma maior rapidez na obtenção de resultados quando comparada com o PFGE, além de alta reprodutibilidade, simples execução e implementação, baixo custo e não sem problemas com a degradação do DNA (MOREIRA, et. al., 2014).
A PCR é considerada uma técnica de biologia molecular revolucionária, que consiste na síntese enzimática de cópias de ácidos nucléicos. Ela permitiu o rápido desenvolvimento do estudo de seqüências de ácidos nucléico. Foi desenvolvida por Kary Banks Mullis, que ganhou o prêmio Nobel de química de 1993 devido ao desenvolvimento dessa técnica em abril de 1983 (CAMARGO, et. al., 2014).
Por meio de etapas de variação de temperatura, a técnica de PCR promove a duplicação de cadeias de DNA in vitro. A reação de amplificação de DNA por PCR envolve o emprego de seqüências iniciadoras (primers), quatro nucleotídeos
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(dNTP’s) do DNA e uma DNA polimerase termoestável; podendo assim, obter-se a partir de uma fita molde, muitas cópias de uma seqüência específica de ácido nucléico. O princípio da PCR consiste na variação de temperatura por ciclo, envolvendo três etapas básicas: desnaturação, pareamento e amplificação (CAMARGO, et. al., 2014).
A desnaturação da fita molde de DNA é uma etapa com duração entre 30 segundos a 1 minuto a temperatura entre 92 ºC a 96 ºC. Após isso, o pareamento de dois iniciadores sintéticos de composições distintas, que funcionam como os iniciadores da reação de polimerização, liga-se à região complementar da fita de DNA alvo que sofrerá a duplicação. Esta etapa tem duração de 30 segundos a 1 minuto a temperatura entre 58 ºC e 65 ºC. Por último, a amplificação por meio da enzima Taq DNA polimerase das novas fitas de DNA, se dá a partir de cada um dos iniciadores, utilizando os quatro dNTP’s como substrato da reação de polimerização. Esta etapa possui duração entre 45 segundos e 1 minuto a 72 ºC. Cada ciclo é repetido em torno de 30 a 35 vezes e promove a amplificação da região alvo determinada conforme o anelamento dos iniciadores sintéticos de DNA (CAMARGO, et. al., 2014). Estas etapas estão demonstradas na figura 4.
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2. JUSTIFICATIVA
No ano de 2010 no Distrito Federal foram identificados 111 pacientes com suspeita de infecção por Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) e a Secretaria de Saúde do Distrito Federal confirmaram ainda a morte de 18 pacientes dentre os hospitais públicos e particulares. Um desafio encontrado por ocasião do surto infeccioso no Distrito Federal foi o de confirmar as KPCs por Reação da Polimerase em Cadeia, sendo que as amostras foram enviadas com esta finalidade para a Fiocruz, no Rio de Janeiro.
Pesquisas que possam contribuir na elaboração de estratégias preventivas e de intervenção para infecções causadas por enterobactérias, bem como, contribuir para gerar uma integração benéfica entre a equipe acadêmica e os serviços de saúde, devem ser estimuladas. Neste sentido, o presente estudo permitiu escrutinar os genes envolvidos na expressão de carbapenemases presentes em espécies de enterobactérias isoladas em ambiente hospitalar, visto que elucidar genes de resistência de enterobactérias aos antibióticos carbapenêmicos é o primeiro passo para garantir um controle epidemiológico efetivo para estes tipos de microorganismo, assim como sua associação com surtos fatais, particularmente em pacientes com baixa imunidade.
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3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo geral: Caracterizar os genes de resistência das Enterobactérias produtoras de carbapenemases e os aspectos epidemiológicos de pacientes internados em um hospital público do Distrito Federal.
3.2. Objetivos Específicos:
Identificar genotipicamente a enzima KPC (Klebsiella pneumoniae
carbapenemase) de isolados de Klebsiella pneumoniae.
Investigar aspectos epidemiológicos dos pacientes portadores de Enterobactérias produtoras de carbapenemases.
Identificar quais variáveis relativas à infecção bacteriana influenciaram para o desfecho óbito ou alta.
Avaliar a susceptibilidade das Enterobactérias aos antibióticos carbapenêmicos dos pacientes em ambiente hospitalar.
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4. MATERIAIS E MÉTODOS
Trata-se de um estudo transversal onde foi realizado o teste de susceptibilidade das enterobactérias aos antibióticos carbapenêmicos, a partir dos materiais biológicos coletados dos pacientes internados no Hospital Regional da Asa Norte (HRAN) e enviados ao Laboratório de Análises Clínicas da mesma Instituição. Os materiais biológicos investigados foram sangue, aspirado traqueal ou brônquico, urina e cultura semi quantitativa de ponta de cateter venoso central. O HRAN é um hospital público do Distrito Federal com 395 leitos, sendo as clínicas de internação: Berçário, Cirurgia Geral, Cirurgia Plástica, Clínica Médica, Ginecologia, Maternidade, Pediatria, Queimados, UTI; com atendimento a pacientes portadores de doenças de caráter clínico e cirúrgico.
4. 1. Coleta e transporte das amostras biológicas
As amostras foram coletadas de pacientes internados no Hospital Regional da Asa Norte (HRAN) com suspeitas de infecção por KPC. A identificação primária foi realizada pelo Laboratório de Microbiologia do hospital de origem dos pacientes e os demais procedimentos que foram utilizados na identificação encontram-se descritos abaixo.
4. 2. Procedimentos para confirmação de resistência bacteriana por disco de ertapenem (adaptado CDC, 2004)
Para diagnosticar amostra como portadora de bactéria produtora de carbapenemase foi realizado o teste com disco de ertapenem, como forma de triagem. Inicialmente utilizou-se o swab contaminado com a amostra que foi distribuída em uma pequena área da placa de ágar MacConkey para após o crescimento ser realizada a pesquisa de colonização por enterobactérias resistentes aos carbapenêmicos (Pesquisa de CRE). Procedeu-se a semeadura por técnica semi-quantitativa/esgotamento com alça bacteriológica na diluição de 1:100. O disco de Ertapenem foi colocado na superfície da placa de MacConkey na junção dos dois primeiros campos de semeadura conforme demonstrado na figura 5. Incubou a placa
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em estufa aeróbia a 35ºC por 24 e 48 horas e observou-se o halo de difusão do disco de Ertapenem na placa para proceder à leitura.
O teste deixou de ser obrigatório após a modificação dos critérios interpretativos para carbapenêmicos para enterobactérias publicados no suplemento do CLSI 2010 M100-S20-U.
Figura 5: Mecanismo de semeamento de material biológico oriundos de pacientes com suspeita de infecção por KPC. Fonte: adaptado CDC, 2004.
4. 2. 1. Interpretação dos resultados
Na ausência de crescimento até 24 horas (MacConkey) ou halo de difusão >27 mm na placa deve-se reincubar as placas por mais 24 horas. Quando for ausente o crescimento após 48 horas ou halo de difusão >27 mm na placa libera-se como enterobactérias resistentes a carbapenêmicos (KPCNEG).Havendo crescimento de colônias na placa de MacConkey com halo < 27 mm (apenas para colônias com crescimento dentro do halo), deve-se reisolar e realizar identificação e antibiograma automatizado, teste de sensibilidade por disco-difusão e Teste de Hodge Modificado (THM). Os isolados de enterobactérias cujos testes comprovarem a resistência aos carbapanêmicos testados (KPCPOS), foram reportado a Comissão de Controle de Infecção Hospitalar (CCIH). Já osbacilos Gram-negativos não fermentadores não foram reportados (KPCNEG). Para interpretaçãodos resultados foram utilizados os valores conforme demonstrados na tabela 1.
Tabela 1. Critérios Interpretativos para testes de sensibilidade ENTEROBACTÉRIAS
34 Antibiótico Sigla S I R S I R Ertapenem 10 µg ETP 22 19-21 18 0.5 1 2 Meropenem 10 µg MEM 23 20-22 19 1 2 4
Fonte: Manual Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), 2013
Os resultados que apresentaram resistência ao antibiótico Ertapenem, foram considerados como suspeitos de contaminação por KPC. Fez-se o teste de susceptibilidade aos antibióticos (TSA) em aparelho automatizado; MicroScan Walk Away 96sl, Dade Behring.
4. 3. Teste de susceptibilidade aos antibióticos (adaptado CDC, 2004) A determinação da susceptibilidade dos isolados foi feita pelo teste de susceptibilidade aos antibióticos (TSA), após cultura em meio de gelose simples (INSA) para avaliação da sua pureza e obtenção de colônias isoladas. Para preparação de uma suspensão bacteriana com turvação aproximada de 0,5 McFarland (Dade Behring,MicroScan®Turbidity Meter) ressuspendeu duas a cinco colônias em 2ml de soro fisiológico estéril diluindo a 1:100 em soro fisiológico num volume total de 10ml; em seguida, foi feita uma semeadura em duas placas quadradas (120mm x 120mm) de Muller-Hinton Agar (INSA) por inundação.
Os discos de antibiótico carbapenêmicos, imipenem, meropenem e ertapenem (Biorad) foram aplicados com o auxílio de um dispensador automático. A susceptibilidade das Enterobactérias aos carbapenêmicos foi definida de acordo com o protocolo Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI, 2011).
Para aquelas Enterobactérias que apresentaram resistência ao ertapenem foram realizados o Teste de Hodge Modificado para Detecção de Enterobactérias Produtoras de Carbapenemases, conforme descrito pelo Centers for Disease Control and Prevention (CDC, 2004).
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4. 4.Teste de Hodge Modificado (THM) (adaptado CDC, 2004)
Preparou-se uma suspensão em salina estéril com a cepa Escherichia coli ATCC 25922 (padrão 0.5 de McFarland). Após isto, diluiu a suspensão 1:10 em salina (0.5 ml da solução de E.coli ATCC 25922 + 4.5 ml salina).Foi então, semeado na superfície de uma placa de Agar Muller-Hinton com a suspensão diluída de E.coli ATCC 25922 com auxilio de swab seco, assegurando que houvesse uma distribuição uniforme cobrindo toda a superfície do Agar. Deixou secar por 3 a 5 minutos em temperatura ambiente.Colocou-se o disco de ertapenem 10µg no centro da placa, e após isto, fez-se uma estria linear da cepa a ser testada, da borda do disco até a borda da placa utilizando uma alça calibrada 10 µl ou um swab. Incubou a placa na estufa em atmosfera aeróbia a 35 ± 2ºC por 16 a 24 horas.
4.4.1 Controle de qualidade (C.Q)
Foi utilizado um C.Q todos os dias em que se realizou o teste, tendo como controle Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1705- teste de Hodge modificado positivo; Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1706- teste de Hodge modificado negativo.
4.4.2 Interpretação/Resultados
Após 16–24 horas de incubação, examinar as placas para verificar a presença de uma distorção no halo de inibição do disco de ertapenem devido ao crescimento realçado da cepa ATCC na intersecção do organismo teste e a E.coli ATCC 25922 dentro dos limites do halo. O THM positivo apresentará presença de distorção no halo de inibição de ertapenem devido ao crescimento da cepa E.coli ATCC 25922 ao longo da estria da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibição. Já o THM negativo, terá ausência de crescimento da cepa E.coli ATCC 5922 ao longo da estria da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibição do disco de ertapenem. Este resultado está representado na figura 6.
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Figura 6: Interpretação resultado do Teste de Hodge Modificado (adaptado CDC, 2004). Teste positivo na estria da cepa teste na parte superior da placa; teste negativo na estria da cepa teste na parte inferior da placa.
Tendo positivo como resultado, o paciente era um provável contaminado por KPC. As amostras então foram encaminhadas para a Fundação Osvaldo Cruz (FIOCRUZ) para confirmação final. As amostras finalmente confirmadas como positivas para KPC foram isoladas e guardadas no banco de cepas clínicas do hospital. Após a autorização do CEP, amostras das cepas foram transferidas para meio de transporte Stuard em caixa térmica fechada em baixa temperatura e levadas para o laboratório de microbiologia clínica da universidade.
No laboratório da universidade, as amostras foram separadas e realizadas repiques em meios MacConkey e incubadas por 24h. As colônias características forão isoladas em caldo BHI e mantidas em shaker a 37oC por 2h. Após isto, foram executadas as análises a seguir.
Os isolados de Enterobactérias produtoras de carbapenemases foram submetidos à extração de DNA e posterior seqüenciamento para identificação dos genes de resistência blaKPC de 1 a 13 e identificação do gene universal. Os pacientes de onde os materiais biológicos contendo as Enterobactérias produtoras de carbapenemases foram os isolados foram investigados quanto aos aspectos epidemiológicos e clínicos.
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4. 5. Extração de DNA bacteriano
A extração de DNA bacteriano foi realizada utilizando o kit NucleoSpin Plasmid® (MN). Antes de iniciar a extração foi feito a preparação das soluções/ reagentes, materiais e amostras (vortexando), colocou-se em banho-maria à 50ºC o tampão AW. Partiu-se de colônias isoladas cultivadas, que sofreram passagem em meio LB líquido por 12h. Adicionou-se 1,5 mL da amostra no tubo eppendorf, centrifugou por 5 minutos, descartou o sobrenadante (com cuidado para não descartar o Pellet). Repetiu-se este procedimento por mais três vezes, completando-se o volume de 6mL. Foram adicionados 250µL do tampão Resuspension Buffer A1, encostando a ponteira no Pellet e misturando (este tampão tem como função separar a formação de grumos celulares). Após isso, homogeneizou e vortexou os tubos eppendorfs. Após isso, foram adicionados 250µL do tampão Lysis Buffer A2, homogenizou e deixou descansar por 5 minutos (esta etapa é importante para a lise da parede e da membrana celulares, e liberação do conteúdo da célula).
Passado o tempo de descanso, foi adicionado 300µL do tampão Neutralization Buffer A3, homogeneizou e centrifugou por 10 minutos (este tampão irá retirar as proteínas que envolvem o DNA e voltará com o pH para próximo de 8, impedindo que a solução de lise facilite a quebra das ligações covalentes do ácido nucléico). Em seguida, enumeraram-se os tubos contendo filtros com sílica; transferiu-se o sobrenadante para o filtro e centrifugou por 5 minutos. Descartou-se o que foi filtrado, adicionou 500µL do tampão AW (banho-maria); centrifugou por 2 minutos. Novamente, foi descartado o filtrado. Adicionou-se 600µL do tampão A4, centrifugou por 2 minutos e descartou o filtrado (os tampões AW e A4 contêm isotiocianato de guanidina, em concentrações crescentes, para facilitar a adsorção do DNA na sílica e retirada das outras biomoléculas da amostra). Foi feita outra centrifugação com o tubo vazio. Após isto, o filtro foi trocado para outro eppendorf definitivo, onde foi adicionado 50µL do tampão Elution Buffer AE (este tampão favorece a eluição do DNA), centrifugou por 2 minutos, descartou o filtro e armazenou as amostras em freezer -20ºC.
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4. 6. Iniciadores e reação de PCR
Os iniciadores universais para o gene blaKPC foram desenhados baseados em seqüências conservadas apresentadas pelos sub-grupos de genes que codificam a enzima carbapenemase de klebsiella pneumoniae (YIGIT, et. al, 2001).
Baseado na seqüência para o blakpc-1 depositada no GenBank (AF297554.1), o oligonucleotídio (oligo) iniciador direto (5'-ATGTCACTGTATCGCCGTC-3’) foi desenhado para reconhecer a seqüência blaKPC na posição (131..149), enquanto que o iniciador reverso (5'-TTACTGCCCGTTGACGCC-3’) foi reconhecido na posição (995..1012). As análises baseadas em alinhamento de seqüências mostraram que o par de iniciadores blaKPC podem detectar os alelos de 1 a 13 do gene blaKPC conforme a tabela 2.
Tabela 2: Número de acesso ao GenBank dos alelos blaKPC e seus microrganismos originais. Número de Acesso GenBank Microrganismo Alvo AF297554.1 Klebsiella pneumoniae blaKPC-1 GU086225.1 Klebsiella pneumoniae blaKPC-2 HQ258934.1 Klebsiella pneumoniae blaKPC-2-like AB557734.1 Klebsiella pneumoniae blaKPC -3 EU447304.1 Klebsiella pneumoniae blaKPC-4 EU400222.2 Pseudomonas aeruginosa blaKPC-5 EU555534.1 Klebsiella pneumoniae blaKPC-6 EU729727.1 Klebsiella pneumoniae blaKPC-7
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FJ234412.1 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-8
FJ624872 Escherichia coli blaKPC-9
GQ140348.1 Acinetobacter baumannii blaKPC-10 HM066995.1 Klebsiella pneumoniae blaKPC-11
HQ342889.1 Enterobacter cloacae blaKPC-12
HQ342890.1 Enterobacter cloacae blaKPC-13
As reações de PCR para a detecção de blaKPC foram realizadas em um
primeiro tempo de desnaturação, em que foi 94ºC por 5 minutos; seguido de 30 ciclos utilizando nos passos de desnaturação, anelamento e polimerização com os respectivos comandos: 94 ºC por 60 s, 58 ºC por 60 s e 72 ºC por 90 s. Por último, no processo de extensão, 78ºC por 8 minutos. Além das amostras, foi utilizado um controle negativo
A PCR do blaKPC foi realizada utilizando os componentes para o volume da reação de 25 µL citados na tabela 3. A banda do tamanho do produto de PCR foi de 881 pares de bases (pb), o que corresponde ao plasmídeo.
Tabela 3: Reagentes utilizados para realização da reação de PCR do gene blaKPC.
Reagente Volume
DNA molde 4 µL
Tampão Taq 2,5 µL
MgCl2 0,75 µL
Mistura dos 4 nucleotídeos- dNTP
2 µL
Oligo F 1 µL
Oligo R 1 µL
Taq DNA polimerase 0,5 µL
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Total (em cada ependorff) 25 µL * * Todos exceto o Controle Negativo (CN).
Baseado na seqüência para o gene 16S rRNA, em que o oligonucleotídio Universal iniciador direto/ foward (5'-CCAGCAGCCGCCGTAATACG-3’) foi desenhado para reconhecer a seqüência universal na posição 1513, enquanto que o iniciador reverso (5'-ATCGGYTACCTTGTTACGACTTC-3’) foi reconhecido na posição 1491, foram realizadas PCR’s. As reações de PCR para a detecção deste gene foram realizadas nos seguinte tempos: separação, 94ºC por 10 minutos; 30 ciclos utilizando nos passos de desnaturação, anelamento e polimerização com os respectivos comandos: 94 ºC por 60 s, 55 ºC por 60 s e 72 ºC por 120 s. Por último, no processo de extensão, 72ºC por 10 minutos.
A PCR do gene 16S rRNA foi realizada utilizando os componentes para o volume da reação de 25µL, citados na tabela 4. A banda do tamanho do produto de PCR foi de 996 pb, correspondente á região ribossomal, capaz de amplificar todas as espécies.
Tabela 4:Reagentes utilizados para realização da reação de PCR do gene universal. Reagente (quantidade/ concentração do estoque) Volume DNA molde 10 ng 4 µL Tampão Taq 10 x 2,5 µL MgCl2 50mM 1,25 µL
Mistura dos 4 nucleotídeos- dNTP 2,5 mM
1,25 µL
Oligo F 10µM 0,5 µL
Oligo R 10µM 0,5 µL
Taq DNA polimerase 5U/µL 0,4 µL
Água Miliq 14,6 µL
Total (em cada ependorff) 25 µL * * Todos exceto o Controle Negativo (CN).
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O termociclador utilizado para os experimentos foi o LifeTouch da BIOER.
4. 7. Digestão
Para realização da digestão, foi utilizada a enzima BshF I (Hae III), EN- 1105; tamanho 7000 units; concentração 10 units/µL; fonte Bacillus sphaericus, empresa Jena bioscience.Utilizaram-se os componentes para o volume de 50µL da reação citados na tabela 5.
Tabela 5: Reagentes utilizados para realização da digestão do gene universal. Reagente Volume Produto de PCR 10 µL Enzima BshF I 0,1 µL Tampão (10x) 5 µL Água Miliq 34,9 µL
Total (em cada ependorff) 50 µL Valores para 1 digestão
Os ependorffs foram colocados por 30 minutos em banho-maria a 37ºC. Após isso, fez-se a corrida das amostras em gel de agarose para verificação do resultado. (LU, et. al., 2000)
4. 8. Eletroforese em gel de agarose
Os produtos de DNA, PCR e digestão foram analisados em gel de agarose 2%. O tempo de corrida do gel é de aproximadamente 1hora e 30minutos, sendo que no começo foi usada à voltagem de 50 V e após começar a correr o gel, aumentou a voltagem para 100 v. Utilizou-se o marcador de 100pb (pares de bases). Foi adicionado 3µL de corante Bromophenol (que tem a função de fazer uma ligação na amostra de DNA e permitir a visualização da corrida no gel de agarose) em 7µL de amostra, tanto de DNA quanto de PCR. Para o preparo do gel foi utilizado TBE
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(Tris- Ácido Bórico), agarose e brometo de etídio (sua função é de corante para o gel e permitir a visualização do DNA, quando colocado à luz ultravioleta). Para o oligo blaKPC, a banda da amplificação foi em 881ppb, correspondendo ao plasmídeo. Já o oligo Universal foi em 996 pb.
4. 9. Descarte de resíduos
Todos os materiais utilizados nos ensaios foram de uso único e manipulados em câmaras de segurança biológica classe II. Após o uso, foram colocados em solução desinfetantes (hipoclorito a 1%), e em seguida, autoclavados a 127oC por 20 min em sacos apropriados para autoclavação. Após a finalização do ciclo de esterilização, os sacos contendo o material descartável foram colocados em recipientes de coleta da empresa responsável pela coleta de materiais biológicos produzidos no laboratório de microbiologia. Todos os procedimentos seguiram a normativa RDC-ANVISA 306/2004 sobre o descarte de resíduos de serviço de saúde.
4. 10. Aspectos epidemiológicos e clínicos
Os aspectos clínicos e epidemiológicos foram investigados por meio de prontuários dos pacientes portadores de enterobactérias produtoras de carbapenemases e envolveram topografia mais provável do foco infeccioso, a enfermidade motivadora da internação, o desfecho clínico, a idade e o tempo de internação.
4. 12. Análises eepidemiológicas
As análises foram realizadas com o pacote estatístico SPSS versão 20.0. Para verificar quais variáveis referentes aos dados epidemiológicos e microbiológicos influenciaram no desfecho, verificou- se a diferença média das variáveis idade e tempo de internação em cada grupo. O teste estatístico utilizado foi o teste t de Student, após se executar o teste de normalidade de Shapiro-Wilk. Para as variáveis sexo, perfil microbiológico das enterobactérias produtoras de
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carbapenemases, foi avaliada a associação com o desfecho por meio do teste Exato de Fisher. O nível de significância adotado foi de 5%.
4. 13. Preceitos éticos
Este projeto está inserido em um projeto maior denominado “Epidemiologia clínica e caracterização molecular do Acinetobacter Baumannii resistente a antibioticoterapia em pacientes internado em hospitais do Sistema Único de Saúde”, que foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa da Secretaria do Estado de Saúde do Distrito Federal (SES/DF) e emitido parecer aprovado pelo protocolo nº 231/09 (anexo).
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5. RESULTADOS
5.1. Análise molecular
Para a amplificação com o oligo blaKPC, foram amplificadas amostras, que devolveram bandas de amplificação na altura de 881 pb, correspondente ao plasmídeo. A análise da amplificação da região do gene blaKPC mostrou que apenas a amostra A10 não amplificou, isso demonstra que esta amostra não possuía o gene de resistência.
5. 1. 1. Gene blaKPC
Figura 7: Gel de agarose a 2% da amplificação do gene blaKPC das amostras dos 17 pacientes estudados. A banda amplificada corresponde a uma região de 881 pb . Marcador = Marcador de 100pb, CN= controle negativo
A amostra A3 não amplificou no primeiro momento, então, foi realizado
novamente a PCR e corrida de gel, obtendo então, a amplificação da amostra, como apresentado na figura 8.
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Figura 8: Gel de agarose a 2% da amplificação do gene blaKPC da mostra A3 estudada. A banda amplificada corresponde a uma região de 881
pb. Marcador = Marcador de 100pb, CN= controle negativo.
5. 1. 2. Gene 16S rRNA
Para a amplificação do gene 16S rRNA, utilizou-se o oligo universal. Foram amplificadas amostras, que devolveram bandas de amplificação na altura de 996 pb.
Figura 9: Gel de agarose a 2% da amplificação do gene 16S rRNA das amostras dos 17 pacientes estudados. A banda amplificada corresponde a uma região de 996 pb . Marcador = Marcador de 100pb, CN= controle negativo
