Em uma análise qualitativa dos músculos cardíacos dos animais mdx (Figura 10) corados com TM é possível visualizar áreas de fibrose (representadas na cor verde) por toda extensão de ventrículos e septo interventricular.
*
*
FIGURA 9-CORTES TRANSVERSAIS DO MÚSCULO CARDÍACO AO NÍVEL DE VENTRÍCULOS CORADOS COM HE
Músculo de camundongo mdx tratado com nujol. Músculo de camundongo mdx tratado com DFZ. Músculo de camundongo mdx tratado com DFZ+O3. Área de fibrose representada pela cor verde. Escala 100μm. VE: ventrículo esquerdo; VD: ventrículo direito; SEPTO: septo interventricular.
Em uma análise qualitativa do músculo cardíaco normal (C57BL10), na idade estudada (13 meses), não foram observadas áreas de fibrose (Figura 11). O coração distrófico do animal não tratado (mdx-nujol) bem como o coração distrófico dos animais tratados com DFZ ou com a terapia combinada por outro lado, apresentou aumento aparente da fibrose.
Representado em A, músculo do camundongo controle (C57BL10). Em B, músculo do camundongo mdx nujol. Em C, músculo do camundongo mdx tratado com DFZ. Em D, músculo do camundongo mdx tratado com DFZ+O3. Área de fibrose representada pela cor verde-luz. Escala 100µm.
Em uma análise quantitativa (Figura 12), a porcentagem total de fibrose no músculo cardíaco distrófico representou cerca de 40%. A partir dessa porcentagem, a fibrose no ventrículo esquerdo (VE, Figura 12) foi diminuída em 20,6% pelo DFZ e 32% pela terapia ESQUERDO CORADOS COM TRICRÔMICO DE MASSON PARA EVIDENCIAR FIBROSE
FIGURA 11-CORTES TRANSVERSAIS DO MÚSCULO CARDÍACO AO NÍVEL DE VENTRÍCULOS CORADOS COM TM.
combinada, em relação ao mdx nujol. O septo interventricular (Figura 12) não apresentou diferença significativa entre os grupos mdx. Entretanto, foi observado uma tendência na redução da porcentagem de fibrose nos animais submetidos a terapia (DFZ e DFZ+O3), representando uma redução de 4,19% nos animais mdx DFZ e 20,75% nos animais mdx DFZ+O3.
Os níveis de fibrose observados no ventrículo direito (VD, Figura 12) reduziram em 27,47% (p<0,05) nos animais mdx DFZ+O3, quando comparado aos animais mdx nujol. Uma redução de 38,06% (p<0,001) foi observada, quando comparada a terapia combinada com a terapia DFZ. Portanto a terapia DFZ apresentou um aumento de 17,09% na fibrose do VD, quando comparado aos animais mdx nujol.
Grupos: mdx nujol (camundongos mdx tratados com nujol), mdx DFZ (camundongos mdx tratados com deflazacorte) e mdx DFZ+O3 (camundongos mdx tratados com a associação de deflazacorte com o óleo contido nas cápsulas de Ômega 3). a: diferença significativa quando comparado com o grupo mdx nujol; b: diferença significativa quando comparado com o grupo mdx DFZ. A significância estatística foi determinada pelo teste ANOVA de uma via, seguido pelo pós-teste de Newman-Keuls.
4.6 WESTERN BLOT
4.6.1 Integridade do CDG
Os níveis de β-distroglicana (Figura 13) estavam significativamente diminuídos (38%) nos animais mdx nujol quando comparados aos animais controle (C57BL/10). Apesar de não apresentar diferença significativa, o grupo mdx DFZ apresentou um aumento de 19,23% quando comparado aos animais mdx nujol. Ainda é possível observar um discreto aumento (3,84%) nos animais mdx DFZ+O3, quando comparado aos animais mdx nujol. FIGURA 12-PORCENTAGEM DA ÁREA DE FIBROSE NO VENTRÍCULO ESQUERDO (VE), SEPTO E VENTRÍCULO DIREITO (VD).
Grupos: C57BL10 (camundongos C57BL10 tratados com Nujol), mdx Nujol (camundongos mdx tratados com nujol), mdx DFZ (camundongos mdx tratados com deflazacorte) e mdx DFZ+O3 (camundongos mdx tratados com a associação de deflazacorte com o óleo contido nas cápsulas de Ômega 3). Os níveis representativos no gráfico foram normalizados pelo GAPDH, expressos em unidade arbritária. a: diferença significativa quando comparado com o grupo C57BL10. A significância estatística foi determinada pelo teste ANOVA de uma via, seguido pelo pós-teste de Newman-Keuls.
4.6.2 Tamponamento de cálcio
Os níveis de CSQ cardíaca (Figura 14) estavam reduzidos em 42,13% (p<0,001) nos animais mdx nujol em relação aos animais controle. As terapias farmacológicas não apresentaram diferença significativas.
Grupos: C57BL10 (camundongos C57BL10 tratados com Nujol), mdx Nujol (camundongos mdx tratados com nujol), mdx DFZ (camundongos mdx tratados com deflazacorte) e mdx DFZ+O3 (camundongos mdx tratados com a associação de deflazacorte com o óleo contido nas cápsulas de Ômega 3). Os níveis representativos no gráfico foram normalizados pelo GAPDH, expressos em unidade arbritária. a: diferença significativa quando comparado com o grupo C57BL10. A significância estatística foi determinada pelo teste ANOVA de uma via, FIGURA 14-QUANTIFICAÇÃO POR WESTERN BLOTTING DA CALSEQUESTRINA NO
MÚSCULO CARDÍACO.
FIGURA 13-QUANTIFICAÇÃO POR WESTERN BLOTTING DA Β-DISTROGLICANA NO MÚSCULO CARDÍACO.
seguido pelo pós-teste de Newman-Keuls.
4.6.3 Mionecrose
Os níveis de Troponina I (Figura 15) não apresentaram modificações significativas entre os grupos. Ainda que não apresente diferença significativa, é possível observar uma redução de 22,65% nos animais mdx nujol, quando comparado aos animais C57BL10. Um aumento de 4,87% é observado nos animais mdx DFZ, quando comparado aos animais mdx nujol. Uma redução de 9,76% é encontrada nos animais DFZ+O3, quando comparado aos animais mdx nujol.
Grupos: C57BL10 (camundongos C57BL10 tratados com Nujol), mdx Nujol (camundongos mdx tratados com nujol), mdx DFZ (camundongos mdx tratados com deflazacorte) e mdx DFZ+O3 (camundongos mdx tratados com a associação de deflazacorte com o óleo contido nas cápsulas de Ômega 3). Os níveis representativos no gráfico foram normalizados pelo GAPDH, expressos em unidade arbritária. A significância estatística foi determinada pelo teste ANOVA de uma via, seguido pelo pós-teste de Newman-Keuls.
4.6.4 Inflamação
Os níveis de TNF-α (Figura 16) estavam aumentados no mdx nujol (84,61%, p<0,01), quando comparado aos animais controle (C57BL10). Ambas terapias reduziram os níveis de TNF-α, sendo observado uma redução de 33,34% (p<0,05) nos animais tratados com DFZ e uma redução de 37,5% (p<0,05) nos animais tratados com terapia combinada (DFZ+O3), quando comparado aos animais mdx nujol. Não foi observado diferença significativa entre os animais controle e animais tratados com DFZ e DFZ+O3.
FIGURA 15-QUANTIFICAÇÃO POR WESTERN BLOTTING DA TROPONINA I NO MÚSCULO CARDÍACO.
Grupos: C57BL10 (camundongos C57BL10 tratados com Nujol), mdx Nujol (camundongos mdx tratados com nujol), mdx DFZ (camundongos mdx tratados com deflazacorte) e mdx DFZ+O3 (camundongos mdx tratados com a associação de deflazacorte com o óleo contido nas cápsulas de Ômega 3). Os níveis representativos no gráfico foram normalizados pelo GAPDH, expressos em unidade arbritária. a: diferença significativa quando comparado com o grupo C57BL10; b: diferença significativa quando comparado com o grupo mdx nujol. A significância estatística foi determinada pelo teste ANOVA de uma via, seguido pelo pós-teste de Newman- Keuls.
O mdx-nujol apresentou níveis elevados de NF-kB (Figura 17) em relação aos animais controle (65,83%, p<0,01). As terapias reduziram o NF-kB a níveis semelhantes ao do animal controle, com diminuição de 41,2% (p<0,01) na terapia DFZ e redução de 28,09% (p<0,05) na terapia combinada.
Grupos: C57BL10 (camundongos C57BL10 tratados com Nujol), mdx Nujol (camundongos mdx tratados com nujol), mdx DFZ (camundongos mdx tratados com deflazacorte) e mdx DFZ+O3 (camundongos mdx tratados com a associação de deflazacorte com o óleo contido nas cápsulas de Ômega 3). Os níveis representativos no gráfico foram normalizados pelo GAPDH, expressos em unidade arbritária. a: diferença significativa quando comparado com o grupo C57BL10; b: diferença significativa quando comparado com o grupo mdx nujol. A significância estatística foi determinada pelo teste ANOVA de uma via, seguido pelo pós-teste de Newman- Keuls.
FIGURA 17-QUANTIFICAÇÃO POR WESTERN BLOTTING DO NF-KB NO MÚSCULO CARDÍACO. FIGURA 16-QUANTIFICAÇÃO POR WESTERN BLOTTING DO TNF-ALPHA NO MÚSCULO CARDÍACO.
4.6.5 Fibrose
Os níveis de TGF-β (Figura 18) estavam aumentados nos animais mdx nujol (90,90%, p<0,001), quando comparados aos níveis de TGF-β dos animais controle (C57BL10). Apenas a terapia DFZ+O3 foi capaz de reduzir significativamente os níveis de TGF-β (redução de 28,58% (p<0,01)), em relação aos animais mdx nujol, levando a níveis
próximos do animal normal.
Grupos: C57BL10 (camundongos C57BL10 tratados com Nujol), mdx Nujol (camundongos mdx tratados com nujol), mdx DFZ (camundongos mdx tratados com deflazacorte) e mdx DFZ+O3 (camundongos mdx tratados com a associação de deflazacorte com o óleo contido nas cápsulas de Ômega 3). Os níveis representativos no gráfico foram normalizados pelo GAPDH, expressos em unidade arbritária. a: diferença significativa quando comparado com o grupo C57BL10; b: diferença significativa quando comparado com o grupo mdx nujol. A significância estatística foi determinada pelo teste ANOVA de uma via, seguido pelo pós-teste de Newman- Keuls.
Os níveis de fibronectina (Figura 19) estavam aumentados nos animais mdx nujol em 106,52% (p<0,01), quando comparada aos animais C57BL10. A terapia combinada (DFZ+O3) mostrou-se eficaz na redução dos níveis de fibronectina, apresentando uma redução de 82,69% (p<0,01), quando comparado aos animais mdx nujol. A terapia DFZ apresentou um discreto aumento (7,36%) quando comparado aos animais mdx nujol, embora não seja significativo. Ao observar a eficácia da terapia combinada (DFZ+O3) com relação a terapia DFZ, é possível observar uma redução de 96,15% (p<0,05).
Grupos: C57BL10 (camundongos C57BL10 tratados com Nujol), mdx Nujol (camundongos mdx tratados com nujol), mdx DFZ (camundongos mdx tratados com deflazacorte) e mdx DFZ+O3 (camundongos mdx tratados com a associação de deflazacorte com o óleo contido nas cápsulas de Ômega 3). Os níveis representativos no gráfico foram normalizados pelo GAPDH, expressos em unidade arbritária. a: diferença significativa quando comparado com o grupo C57BL10; b: diferença significativa quando comparado com o grupo mdx nujol; c: diferença significativa quando comparado com o grupo mdx DFZ. A significância estatística foi determinada pelo teste ANOVA de uma via, seguido pelo pós-teste de Newman-Keuls.
Os níveis de MMP-2 e TIMP-1 (Figura 20) não apresentaram diferença significativa em nenhum dos grupos analisados no presente estudo.
Grupos: C57BL10 (camundongos C57BL10 tratados com Nujol), mdx Nujol (camundongos mdx tratados com nujol), mdx DFZ (camundongos mdx tratados com deflazacorte) e mdx DFZ+O3 (camundongos mdx tratados com a associação de deflazacorte com o óleo contido nas cápsulas de Ômega 3). Os níveis representativos no gráfico foram normalizados pelo GAPDH, expressos em unidade arbritária. A significância estatística foi determinada pelo teste ANOVA de uma via, seguido pelo pós-teste de Newman-Keuls.
FIGURA 19-QUANTIFICAÇÃO POR WESTERN BLOTTING DE FIBRONECTINA NO MÚSCULO CARDÍACO.
FIGURA 20-QUANTIFICAÇÃO POR WESTERN BLOTTING DA MMP-2 E TIMP-1 NO MÚSCULO CARDÍACO.
5 - DISCUSSÃO
O objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos da terapia combinada do corticoide DFZ ao suplemento alimentar ômega-3 na cardiomiopatia distrófica, no estágio tardio da doença. Os efeitos foram comparados aos observados com a monoterapia com deflazacorte. Como descrito anteriormente, a ausência de distrofina leva a instabilidade do sarcolema, com alteração de componentes do CDG, aumento do influxo de cálcio, mionecrose, inflamação e fibrose.
Investigamos alguns aspectos relacionados a fisiopatologia da distrofia muscular, quais sejam: avaliação da β-distroglicana, importante componente do CDG; análise da calsequestrina, relacionada a regulação do cálcio; mionecrose; análise funcional do coração; inflamação e fibrose. Estes aspectos serão discutidos a seguir.