UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
CAMILA DE JESUS SAQUELI
CARDIOMIOPATIA DISTRÓFICA: TERAPIA COMBINADA
DEFLAZACORTE E ÔMEGA-3
Campinas 2017
CAMILA DE JESUS SAQUELI
CARDIOMIOPATIA DISTRÓFICA: TERAPIA COMBINADA
DEFLAZACORTE E ÔMEGA-3
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de mestra em Biologia Celular e Estrutural, área de concentração: Anatomia.
Orientador: Profª. Drª. Maria Julia Marques
Campinas 2017
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA CAMILA DE JESUS SAQUELI E ORIENTADA PELA PROFª. DRª. MARIA JULIA MARQUES.
Campinas, 07 de Julho de 2017.
COMISSÃO EXAMINADORA
Profª. Drª. Maria Julia Marques
Prof. Dr. Bruno Rodrigues
Profª. Drª. Candida Luiza Tonizza de Carvalho
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
Dedico este trabalho aos pacientes com Distrofia muscular de Duchenne, em especial aqueles que foram meus pacientes e a toda equipe envolvida, em busca de uma melhor qualidade de vida na Distrofia muscular de Duchenne
Agradecimento Especial
À Prof. Dra. Maria Julia Marques pela confiança depositada na realização deste trabalho, pela amizade, pelo respeito e dedicação. Obrigada por compartilhar seu conhecimento.
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, pela dádiva da vida. E por ter me concedido força e fé para a conquista deste sonho, em meio de tantos obstáculos e pensamentos em desistir.
À Conceição Maria de Jesus Saqueli e Arly Bianucci Saqueli, meus pais. Com eles aprendi que os sonhos devem ser sonhados juntos e que os obstáculos estão presentes, porém com união e fé conseguimos vencer. Agradeço por viverem comigo os momentos de fracasso e também de vitórias. Vocês são minhas jóias valiosas, amo incondicionalmente e serei eternamente grata por fazerem dos meus sonhos, realidade.
Ao meu irmão Rafael de Jesus Saqueli, Finel, por me apoiar nos momentos de angústia e também festejar minhas vitórias. Na maioria das vezes, em silêncio, transcendendo a calma, me acalmava para que eu seguisse em frente.
As minhas estrelinhas Shirley Bianucci Saqueli, Alcino Saqueli e Ana Maria de Jesus. Onde quer que estejam, estão como sempre cheios de orgulho em dizer quem são seus netos e o que eles fazem. O meu eterno agradecimento em me apoiarem em todas as minhas decisões, prometo não desapontá-los.
A minha tia-avó e madrinha Neusa Bianucci, por sentar e escutar sobre meus estudos, mesmo em alguns momentos não entendendo. Agradeço por compartilhar seu conhecimento e estar comigo em todos os meus sonhos.
Ao meu afilhado Otávio Ferreira de Souza, por proporcionar momentos de lazer e me “incentivar” nos estudos.
Ao Wagner José Franco de Oliveira, por momentos de felicidade, amor e incentivar a prática de atividade física. Obrigada pelo incentivo e conversas quando pensei em desistir.
A todos os meus tios e primos, que de alguma forma contribuíram para realização deste sonho.
Aos professores e funcionários do curso de fisioterapia da PUC-MINAS Poços de Caldas, que acreditaram no meu potencial e incentivaram minha trajetória acadêmica.
À Profa. Solange Freitas por me proporcionar momentos de reflexão em qual área seguir no mestrado.
Ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Estrutural pela contribuição no meu desenvolvimento profissional.
Ao Prof. Dr. Humberto Santo Neto pela colaboração e convívio durante a execução deste trabalho.
Aos professores Prof. Dr. Humberto Santo Neto, Profa. Dra. Maria Julia Marques, Profa. Dra. Elaine Minatel, Prof. Dr. José Ângelo Camilli, Profa. Dra. Valéria Helena Alves
Cagnon Quitete, Profa. Dra. Luciana Bolsoni Lourenço Morandini por compartilhar seus
conhecimentos nas disciplinas oferecidas.
Às professoras Valéria Helena Alves Cagnon Quitete, Adriana Pertille e Carla Collares
Buzato pelas contribuições durante meu exame de qualificação.
À Sra. Lilian Alves Senne Panagio pela atenção, paciência durante o mestrado.
Aos funcionários do Departamento de Anatomia, à Sra. Rosalina de Fátima Telles, Sr.
Norivaldo Celestino, Sr. Marco Aurélio Ribeiro de Paula, Sr. Paulo Francisco dos Santos, Sr. Walter Ferreira pelo auxílio técnico durante os estudos, amizade, e pelos
cafezinhos para alegria e descontração.
Aos amigos do Laboratório de Plasticidade Muscular, Lab. Biologia de Reprodução,
Lab. Regeneração Nervosa, Lab. Plasticidade e Regeneração Óssea, Lab. Eletromiografia e Controle Motor e Lab. Carcinogênese Urogenital e Imunoterapia pela
amizade, companheirismo.
Aos amigos do Laboratório de Biologia Estrutural da Junção Neuromuscular, Marcos Maciel
Junior, Adriana Fogagnolo Maurício, Juliano Alves Pereira, Samara Camaçari de Carvalho, Jéssica Silva Ferreira, Renato Rissi, Stephanie Furlan, Renata Acunha e Paula Andrea Saenz, pelos bons momentos compartilhados.
Aos amigos do Laboratório de Plasticidade Muscular, Daniela Sayuri Mizobuti, Túlio
Hermes, Rafael Mancio pela amizade e pelo auxílio durante os experimentos.
Aos amigos Luciana Sobral Moreira, Patricia Ribeiro, Luciana Ramalho, Rodrigo
Scarpari Carraro, Julio Cesar Santini, Elisa Rolfini pelos dias de estudos e conhecimentos
Ao Prof. Dr. Miguel Arcanjo Áreas e ao Prof. Dr. Luiz Alberto Ferreira Ramos por disponibilizarem a utilização do equipamento para eletrocardiograma e por auxiliar na realização do mesmo
À Adriana Fogagnolo Maurício pela paciência e por disponibilizar o seu tempo para compartilhar seu conhecimento e acompanhar na grande maioria dos experimentos.
Ao Marcos Maciel Junior por ter me acolhido quando cheguei ao laboratório, por ter dividido a sala de estudos, por ser um excelente pesquisador e proporcionar momentos de discussão que contribuiu para minha pesquisa. E acima de tudo pela amizade construída e pelo incentivo no projeto fitness, que levarei para sempre em meu coração.
À Jessica Silva Ferreira por dividir seus conhecimentos adquiridos, mesmo não seguindo a mesmo linha de pesquisa ainda se preocupava com o caminhar do meu trabalho. Pela amizade, companheirismo e por cantar nossas músicas nas limpezas de biotério.
À Catharina Nucci Martins uma excelente pesquisadora, que me auxiliou nos momentos de dúvidas e reflexões. Agradeço por organizar nossos momentos de lazer, pela amizade, companheirismo e por dividir sua experiência profissional e pessoal.
Ao CEUA e aos camundongos concedidos para realização da pesquisa.
À CNPq, pela concessão da bolsa de mestrado.
À FAPESP, CNPq, CAPES, FAEPEX, CAPES/PROEX e CAPES/DS pelo apoio financeiro indispensável.
A todos vocês,
“A mente que se abre a uma nova ideia jamais voltará ao seu tamanho original.”
RESUMO
A distrofia muscular de Duchenne (DMD) é uma doença muscular caracterizada pela mutação no gene que codifica a proteína distrofina. Na ausência de distrofina há degeneração muscular progressiva, instabilidade sarcolema, aumento do influxo de cálcio e mionecrose. A deposição de fibrose levará à falência cardiorrespiratória em estágios tardios da doença. No camundongo mdx, modelo experimental da DMD, o músculo cardíaco é afetado tardiamente na doença, mostrando deposição de fibrose e alterações funcionais. Os corticóides retardam a progressão da doença, mas mostram efeitos secundários graves. Investigamos os efeitos de uma terapêutica combinada do corticoide deflazacorte (DFZ) e ômega-3 (O3) na cardiomiopatia distrófica, em comparação com a monoterapia com DFZ, numa fase posterior (13 meses de idade) da doença. Os camundongos mdx (8 meses de idade) receberam DFZ sozinho ou combinado com ômega-3 (DFZ + O3) por gavagem durante 5 meses. Os camundongos mdx não tratados receberam óleo mineral. Os principais efeitos da terapia combinada em relação à monoterapia com DFZ foram observados na deposição de fibrose. DFZ + O3 reduziu a área de fibrose cardíaca (redução de 38% na fibrose do ventrículo direito) concomitante com uma redução nos fatores pró-fibróticos TGF-β (diminuição de 28,58%; DFZ sozinho reduziu cerca de 15% de TGF-β) e fibronectina (45,27%, DFZ isolado não alterou a fibronectina). A análise eletrocardiográfica indicou que o DFZ + O3 foi mais eficaz do que a monoterapia na diminuição da amplitude da onda Q (normal: 9,6 ± 2,7, mdx: 94,8 ± 20, DFZ: 133 ± 39, DFZ+O3: 52 ± 44). Os fatores pró-inflamatórios (TNF-α e NF-kB) foram significativamente reduzidos por ambas as terapias (redução aproximada de 35% de TNF-α e redução em cerca de 33% de NF-kB). Outros aspectos da distrofia, como a composição molecular do sarcolema (níveis de β-distroglicana) e os níveis de proteínas relacionadas à regulação do cálcio (calsequestrina) e mionecrose (CK cardíaca e troponina) não foram afetados por ambas as terapias. Em conclusão, o presente estudo sugere que os pacientes com DMD que apresentam comprometimento cardíaco, em estágios mais avançados da doença e que estão sob terapia corticoide com deflazacorte, podem se beneficiar da suplementação de ômega-3, principalmente relacionada à diminuição da deposição de fibrose, possivelmente pelo efeito anti-fibrótico do ômega-3.
Palavras-chave: Camundongo mdx; Cardiomiopatia; Deflazacorte; Distrofia Muscular de
ABSTRACT
Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a muscular disease characterized by a mutation without a gene that encodes the protein dystrophin. In the absence of dystrophin there is progressive muscle degeneration, sarcolemma instability, increased influx of calcium and myonecrosis. Fibrosis deposition will lead to cardiorespiratory failure at later stages of the disease. In the mdx mice model of DMD, cardiac muscle is affected at later stages of the disease, showing fibrosis deposition and functional alterations. Corticoids retard the progression of the disease but show severe side effects. We investigated the effects of a combined therapy of the corticoid deflazacort (DFZ) and omega-3 on dystrophic cardiomyopathy, compared to DFZ monotherapy, at a later stage (13 months of age) of the disease. Mdx mice (8 months old) received DFZ alone or combined to omega-3 (DFZ+O3) by gavage for 5 months. Untreated-mdx mice received mineral oil. The main effects of the combined therapy compared to DFZ monotherapy were seen in fibrosis deposition. DFZ+O3 reduced cardiac fibrosis area (38% reduction in right ventricle fibrosis) concomitant to a reduction in the pro-fibrotic factors TGF-β (28,58% decrease; DFZ alone reduced about 15% TGF-β) and fibronectin (45,27% decrease; DFZ alone did not change fibronectin). Electrocardiogram analysis indicated that DFZ+O3 was more effective than monotherapy in decreasing Q wave amplitude (normal: 9.6±2.7; mdx: 94.8±20; DFZ: 133±39; DFZ/O: 52±44). Pro inflammatory factors (TNF-α and NF-kB) were significantly reduced by both therapies (approximately 35% reduction of TNF-α and 33% reduction of NF-KB). Other aspects of dystrophy, such as molecular composition of the sarcolemma (levels of β-dystroglycan), and the levels of proteins related to calcium regulation (calsequestrin) and to myonecrosis (cardiac CK and troponin), were not affected by both therapies. In conclusion, the present study suggests that DMD patients presenting cardiac involvement, at later stages of the disease and that are under corticoid therapy with deflazacort, may benefit from a supplementation with omega-3, mainly related to a decrease in fibrosis deposition, possibly due to an anti-fibrotic effect of omega-3.
Keywords: Cardiomyopathy; Deflazacort; Duchenne muscular Dystrophy; mdx mice;
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 -Organização molecular do complexo distrofina-glicoproteínas ... 19
Figura 2 - Representação esquemática da cardiomiopatia na DMD e camundongo mdx ... 22
Figura 3 - Estrutura química da cadeia de EPA e DHA ... 25
Figura 4 - Síntese de eicosanoides a partir do Ácido Aracdônico ... 26
Figura 5 - Traçados eletrocardiográficos e relação S/R ... 36
Figura 6- Médias das amplitudes e frequência cardíaca obtidas no eletrocardiograma ... 37
Figura 7- Médias dos intervalos e índice de cardiomiopatia obtidos no eletrocardiograma .... 38
Figura 8 - Média dos níveis de CK-MB. ... 39
Figura 9 - Cortes transversais do músculo cardíaco ao nível de ventrículos corados com HE 40 Figura 10 - Cortes transversais do coração ao nível dos ventrículos direito e esquerdo corados com Tricrômico de Masson para evidenciar fibrose ... 41
Figura 11 - Cortes transversais do músculo cardíaco ao nível de ventrículos corados com TM. ... 41
Figura 12 - Porcentagem da área de fibrose no ventrículo esquerdo (VE), septo e ventrículo direito (VD). ... 42
Figura 13 - Quantificação por Western Blotting da β-distroglicana no músculo cardíaco. ... 43
Figura 14 - Quantificação por Western Blotting da Calsequestrina no músculo cardíaco. ... 43
Figura 15 - Quantificação por Western Blotting da Troponina I no músculo cardíaco. ... 44
Figura 16 - Quantificação por Western Blotting do TNF-ALPHA no músculo cardíaco. ... 45
Figura 17 - Quantificação por Western Blotting do NF-kB no músculo cardíaco. ... 45
Figura 18 - Quantificação por Western Blotting do TGF-β no músculo cardíaco. ... 46
Figura 19 - Quantificação por Western Blotting de Fibronectina no músculo cardíaco. ... 47
Figura 20 - Quantificação por Western Blotting da MMP-2 e TIMP-1 no músculo cardíaco. 47 LISTA DE TABELA Tabela 1 - Médias com desvio padrão das massa corporais no início (pré) e no final (pós) dos tratamentos ... 36
LISTA DE ABREVIATURAS
AA – Ácido Araquidônico ALA – Ácido α-linoleico Ca2+ - Cálcio
CDG – Complexo distrofina-glicoproteína CK – Enzima Creatina Quinase
CK-BB – Enzima Creatina Quinase
CK-MB – Enzima Creatina Quinase Cardíaca
CK-MM – Enzima Creatina Quinase Músculoesquelética COXs – Ciclixigenases
CSQ – Calsequestrina DFZ – Deflazacorte
DFZ+O3 – Associação Deflazacorte e Ômega-3 DHA – Ácido de Decosahexanoíco
DMD – Distrofia muscular de Duchenne ECG – Eletrocardiograma
EPA – Ácido Eicosapentanóico HE – Hematoxilina e Eosina LTs – Leucotrienos
mdx – X chromossome-linked muscular dystrophy
MMP2 – Metaloproteinase 2 MMPs – Metaloproteinases NF-kB – Fator nuclear-kappa B O3 – Ômega-3
PGs – Prostaglandinas
TGF-β – Fator de crescimento transformador beta-1
TIMPs – Inibidores teciduais endógenos de metaloproteinases TM – Tricômico de Masson
TNF-α – Fator de necrose tumoral-alfa TXs – Tromboxanas
VD – Ventrículo Direito VE – Ventrículo Esquerdo
SUMÁRIO
1 – INTRODUÇÃO
1.1 DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE ... 18
1.2 CAMUNDONGO mdx ... 20 1.3 CARDIOMIOPATIA ... 21 1.4 DEFLAZACORTE ... 24 1.5 ÔMEGA 3 (O3) ... 25 2 - OBJETIVOS ... 28 2.1 OBJETIVO GERAL ... 28 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 28 3- MATERIAIS E MÉTODOS ... 29 3.1 ANIMAIS... 29 3.2 PROTOCOLO EXPERIMENTAL ... 29
3.2.1 Grupo tratado com Nujol... 29
3.2.2 Grupo tratado com Deflazacorte... 29
3.2.3 Grupo tratado com associação Ômega 3 e Deflazacorte ... 30
3.3 OBTENÇÃO DA MASSA CORPORAL ... 30
3.4 ELETROCARDIOGRAMA ... 30
3.5 ANÁLISE DE CREATINA QUINASE CARDÍACA (CK-MB) ... 30
3.6 OBTENÇÃO DO MÚSCULO CARDÍACO ... 31
3.7 PREPARO DO MÚSCULO CARDÍACO PARA COLORAÇÃO COM HEMATOXILINA E EOSINA ... 31
3.8 PREPARO DO MÚSCULO CARDÍACO PARA COLORAÇÃO COM TRICÔMICO DE MASSON ... 32
3.9 ANÁLISE MORFOMÉTRICA ... 32
3.10 WESTERN BLOT ... 33
3.10.1 Anticorpos ... 33
3.10.2 Preparo do extrato total ... 34
3.11.3 Análise de proteínas ... 34
3.11 ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 35
4– RESULTADOS ... 36
4.1 MASSA CORPORAL... 36
4.3 ANÁLISE DA CREATINA QUINASE (CK-MB) ... 39
4.4 ANÁLISE QUALITATIVA DO MÚSCULO CARDÍACO COM HE... 40
4.5 ANÁLISE QUALITATIVA E QUANTITATIVA DO MÚSCULO CARDÍACO COM TM ... 40 4.6 WESTERN BLOT ... 42 4.6.1 Integridade do CDG ... 42 4.6.2 Tamponamento de cálcio ... 43 4.6.3 Mionecrose ... 44 4.6.4 Inflamação ... 44 4.6.5 Fibrose ... 46 5 - DISCUSSÃO ... 48
5.1 AVALIAÇÃO DA β-DISTROGLICANA E CSQ CARDÍACA ... 48
5.2 MIONECROSE CARDÍACA: CK-MB E TROPONINA ... 49
5.3 INFLAMAÇÃO: HE, TNF-α e NF-kB ... 50
5.4 FUNÇÃO CARDÍACA E FIBROSE ... 51
6 – CONCLUSÃO ... 54
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 55
ANEXO A ... 65
1 – INTRODUÇÃO
1.1 DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE
As distrofias musculares são caracterizadas por um grupo heterogêneo de doenças degenerativas da fibra muscular, de herança autossômica recessiva (REED, 2002). Dentre as distrofias, a distrofia muscular de Duchenne (DMD) se apresenta em maior incidência, afetando um em cada 5000 meninos nascidos vivos (BRUNKLAUS et al., 2015).
Descrita pela primeira vez em 1968, pelo médico francês Guillame Bonjamin Amand Duchenne, a DMD foi caracterizada como uma paralisia pseudo-hipertrofia. O diagnóstico consiste em uma avaliação dos sintomas apresentados (fraqueza muscular, dificuldade na deambulação, sinal de Gowers), na mensuração dos níveis de creatina quinase (CK), na biópsia muscular seguida de testes genéticos direcionados (RAHIMOV; KUNKEL, 2013).
A DMD é causada por mutações do gene responsável por expressar a proteina distrofina. Este gene está localizado no cromossomo X, mais especificamente no braço curto no locus Xp21 (KUNKEL et al., 1985; HOFFMAN et al., 1988). Com a mutação do gene, a proteína distrofina pode ser expressa de forma incompleta (KOENIG et al, 1987; WAPENAAR et al, 1988; REED, 2002) ou estar completamente ausente (KOENIG et al, 1987; REED, 2002).
A distrofina (427 kD) é formada por 79 exons, situada na superfície interna do sarcolema. Em uma extremidade da proteína distrofina, denominada N-terminal, ocorre interação com a actina filamentosa (F-actina) e na porção oposta, denominada C-terminal, há interação com as sintrofinas, formando assim o complexo distrofina glicoproteínas (CDG – Figura 1) (YOSHIDA & OZAWA, 1990). As proteinas pertencentes a este complexo estão dispostas no intracelular (Sintrofinas e nNOS), transmembrana (Sarcoglicanas e β-distroglicana) ou no meio extreacelular (α-distroglicana e laminina) (MRAK, 1985; HOFFMAN et al., 1987; IBRAGHIMOV-BESKROVNAYA et al., 1992) e conferem integridade ao sarcolema permitindo que a fibra suporte o estresse mecânico gerado durante a contração muscular (PETROF et al., 1993).
Organização molecular do complexo distrofina-glicoproteínas representando a α- e β distroglicanas; α-, β-, γ-, δ - sarcoglicanas; α-, β1-sintrofinas; distrobrevina e a distrofina.A conexão do citoesqueleto intracelular com a matriz extracelular da fibra muscular é interrompida em consequência da ausência da proteína distrofina (Laboratório de junção neuromuscular-IB-UNICAMP).
A ausência da distrofina confere uma perda glicoproteica do CDG, como por exemplo a β-distroglicana que se encontra com níveis reduzidos (ERVASTI et al., 1990), consequentemente o sarcolema não se encontra integro com propensão a micro rupturas em decorrência das contrações musculares (MARQUES et al., 2008). O influxo de cálcio (Ca2+) favorecido pela ruptura do sarcolema ativa proteases, levando a degeneração de proteínas, degeneração muscular, seguido de infiltrado inflamatório, resultando em fibrose nos músculos esqueléticos e cardíaco (SEIXAS et al, 1997; MARIOL e SÉGALAT, 2001; DECONINCK; DAN, 2007; RAHIMOV, KUNKEL, 2013).
O músculo distrófico é progressivamente substituído por tecido adiposo e conjuntivo (RAHIMOV, KUNKEL, 2013) acarretando um aumento no músculo, denominado pseudo-hipertrofia. A pseudo-hipertrofia é caracterizada pelo aumento aparente do músculo, porém este aumento não proporciona contração eficaz. Inicialmente, ao deambular a criança apresenta quedas frequentes, dificuldade para correr e subir escadas, além de outras alterações como o levantar miopático (sinal de Gowers), decorrente do comprometimento dos músculos da coxa e quadril (REED,2002). Durante a adolescência a deambulação é perdida, o paciente necessita de cadeiras de rodas (HOFFMAN; BROWN; KUNKEL, 1987) e desenvolve
alterações posturais (REED, 2002). O óbito ocorre por volta da terceira década de vida em decorrência de complicações cardiorespiratórias (ENGEL et al., 1994).
1.2 CAMUNDONGO mdx
A ausência da distrofina também foi observada em outros animais, como peixes, aves, cães, gatos e camundongos (SEIXAS et al., 1997). Nos cães da raça Golden a doença se manifesta de forma mais severa e os cães exibem características genotípicas e fenotípicas muito próximas as da doença em humanos. A DMD no cão evolui rapidamente, entre 3 a 6 meses de vida. Alterações musculares e rigidez dos membros pélvicos são observadas desde o nascimento e as complicações cardíacas são observadas no cão adulto (MYAZATO, 2005).
Os camundongos mdx (X chromossome-linked muscular dystrophy) foram descobertos em uma colônia de C57BL10/ScSn, em decorrência dos altos níveis de creatina quinase, enzima que sinaliza degeneração muscular (BULFIELD et al., 1984). Posteriormente, Hoffman e colaboradores (1987) relataram que estes animais apresentam mutações ou deleção no gene que codifica a distrofina de maneira espontânea, constituindo o modelo de escolha para estudos experimentais pré-clínicos da DMD (GROUNDS et al., 2008).
No mdx, sinais clínicos da doença se iniciam por volta da 3-4 semanas de vida. Diferente dos humanos estes animais apresentam ciclos de degeneração e regeneração (TORRES e DUCHEN, 1987; SEIXAS et al., 1997). Por volta dos 4-6 meses de vida a degeneração torna-se menos pronunciada e será observada novamente no animal idoso (GROUNDS et al., 2008). Os músculos são afetados em diferentes fases da doença. Aos 21 dias pós natal, um alto índice de mionecrose é observado nos músculos do membro posterior, como gastrocnêmio (SEIXAS et al., 1997), tibial anterior (RADLEY e GROUNDS, 2006) e sóleo (PASSAQUIN et al., 2002). Animais com 8 meses de idade apresentam deposição de tecido adiposo e também cardiomiopatia (SEIXAS et al., 1997; MOREIRA et al., 2013). No segundo ano de vida, o animal apresenta doença semelhante ao humano distrófico (LEFAUCHEUR et al., 1995).
Alguns músculos são protegidos da mionecrose, destacando-se os músculos extraoculares (FISHER et al., 2005) e os músculos laríngeos (MARQUES et al., 2008). Apesar de não se conhecer a real razão para a proteção destes músculos da mionecrose, acredita-se que pode ser decorrente do aumento da expressão de proteínas ligadas ao cálcio (calsequestrinab) garantindo homeostase do cálcio e consequente ausência de mionecrose (FERRETTI et al., 2009).
O camundongo mdx é o modelo experimental mais utilizado para estudos da distrofinopatia devido ao baixo custo, maior disponibilidade e fácil manuseio dos animais. Apesar das diferenças fisiopatológicas e clínicas quando comparado ao humano, estudos no camundongo auxiliam no desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas e possível aplicação nos portadores de DMD (SEIXAS et al., 1997; MARQUES et al.,2004; GROUNDS et al., 2008).
1.3 CARDIOMIOPATIA
Na distrofia muscular, o acometimento do coração se dá pela deposição de tecido fibroso nas câmaras cardíacas, que leva ao aumento do volume das câmaras e redução da espessura da parede cardíaca, caracterizando assim uma cardiomiopatia dilatada (KASPAR et al., 2010). Na DMD, a cardiomiopatia é observada em cerca de 80% nos adultos jovens (HUNSAKER et al., 1982), sendo responsável por 10% dos óbitos (SANTOS et al, 2010).
A cardiomiopatia na DMD é mais evidente nos adolescentes e em adultos jovens (GILROY et al, 1963; NIGRO et al, 1990; ENGLISH & GIBBS, 2006). No camundongo
mdx, a cardiomiopatia está presente por volta do oitavo ou décimo mês de vida (QUINLAN et
al., 2004; TANIGUTI et al., 2011), sendo observada primeiramente por uma alteração morfológica na parede póstero-lateral do ventrículo esquerdo, ocorrendo hipertrofia dilatada do ventrículo decorrente da deposição de tecido fibroso (PERLOFF, 1984; FINSTERER; STOLLBERGER, 2003; QUINLAN et al, 2004).
No músculo estriado esquelético é observada deposição de tecido adiposo e fibroso. O músculo estriado cardíaco, entretanto, não apresenta deposição de tecido adiposo (JOHN GILROY et al, 1963). Os cardiomiócitos não se regeneram, favorecendo a deposição de tecido fibroso (JUNG et al, 2008). O surgimento de arritmias na DMD pode ser justificada pela deposição de fibrose nas células marca-passo, em específico nó sino atrial (GILROY et al, 1963; KOVICK et al., 1975).
Com a progressão da DMD, exames que demonstrem a funcionalidade do músculo cardíaco são de grande importância clínica. O eletrocardiograma (ECG – SANTOS et al., 2010) e o ecocardiograma (KADMAR & GARRY, 2016) são os exames de maior utilização. O raio X e ecocardiografia são utilizados, porém com menor frequência por apresentarem dificuldade de interpretação decorrente das alterações posturais e respiratórias (ENGLISH & GIBBS, 2006). O exame de ressonância magnética permite verificar alterações cardíacas antes de apresentar sintomas clínicos (SILVA et al, 2007; YILMAZ et al, 2008). O
ECG do paciente distrófico mostra diversas alterações, tais como o aumento da onda R, aprofundamento da onda Q e redução da razão S/R, sugerindo degeneração dos miócitos com consequente fibrose (JOHN GILROY et al, 1963; BIA et al., 1999; SANTOS et al, 2010). Os achados do ecocardiograma nos pacientes com DMD demonstram redução da função sistólica e da fração de ejeção no ventrículo esquerdo (KADMAR & GARRY, 2016).
A cardiomiopatia no camundongo mdx também se instala tardiamente. Por volta do oitavo mês de vida a fibrose se encontra moderada na musculatura cardíaca (TANIGUTI et al., 2011) Aos doze meses de idade a fibrose acarreta alterações cardíacas funcionais observadas no ECG (BOSTICK et al., 2008; BOSTICK et al., 2009; BURELLE et al., 2010; SPURNEY, 2011).
Ca2+: cálcio; CK-MB: creatina quinase cardíaca;Troponina I: troponina cardíaca I; TNF-α: fator de necrose tumoral; NF-kB: fator nuclear kappa B; MMPs: metaloproteinases de matriz; TIMPs: inibidores teciduais endógenos de metaloproteinases; TGF-β: fator de crescimento transformador beta-1 (Adaptado de KASPAR et FIGURA 2-REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DA CARDIOMIOPATIA NA DMD E CAMUNDONGO MDX
al., 2010).
Considerando que o músculo cardíaco apresenta ciclos de contração e relaxamento constantes, o fluxo de Ca2+ é ainda maior quando comparado ao músculo esquelético, o que contribui para uma deterioração mais rápida das células cardíacas quando se tem ausência da distrofina (Figura 2), que confere estabilidade para membrana (KASPAR et al., 2010). Porém, o comprometimento cardíaco se dá em uma fase avançada da DMD, sugerindo que haja ativação de mecanismos compensatórios, como ativação do sistema nervoso simpático (LU & HOEY, 2000) ou porque os pacientes com DMD encontram-se com habilidades físicas limitadas e a sintomatologia só aparece quando a cardiomiopatia se encontra grave (ENGLISH & GIBBS, 2006). Com a instabilidade da membrana, os canais de Ca2+ dependentes de voltagem são ativados desnecessariamente, favorecendo ainda mais o influxo do Ca2+ para o interior da célula dando início a cascata de degradação de proteínas (KASPAR et al., 2010), como a Troponina I, que favorece ainda mais o influxo de Ca2+ (FENG et al.,2001). O Ca2+ situado no retículo sarcoplasmático é sequestrado pela calsequestrina (CSQ), proteína responsável pelo tamponamento do Ca2+ (OHKURA et al., 1998; BEARD et al., 2002).
A degradação de proteínas culmina em morte de cardiomiócitos, com o objetivo de reparação tem início a um processo inflamatório (Figura 2), com migração de macrófagos para fagocitar as células danificadas. Os macrófagos e células inflamatórias secretam citocinas pró-inflamatórias, como o fator de necrose tumoral (TNF-α) (PORTER et al.,2002). O TNF-α ao se ligar em seu receptor, produzirá o fator nuclear kappa B (NF-kB) que, quando ativado, induz a produção de proteínas envolvidas na resposta inflamatória (BAGHDIGUIAN et al.,1999). As células inflamatórias também produzem fatores pró-fibróticos, como o fator de crescimento transformador beta 1 (TGF-β) (AU et al., 2011) que induzem a proliferação de matriz extracelular, com aumento de fibronectina e colágeno no tecido muscular (ENGEL et al., 1994). Fatores importantes na remodelação do músculo distrófico são as metaloproteinases (MMPs), proteases zinco-dependentes envolvidas na degradação da matriz extracelular. A atividade das MMPs é controlada por inibidores teciduais endógenos de metaloproteinases (TIMPs) (CARMELI et al., 2004; NAGASE et al., 2006; VARGOVÁ et al., 2012), sendo que o equilíbrio entre MMPs e TIMPs promove manutenção da integridade do tecido muscular (PAGE-McCAW et al., 2007).
1.4 DEFLAZACORTE
O deflazacorte, oxazolidina derivada da predinisona, é um anti-inflamatório esteroidal utilizado desde 1974 até o presente momento para tratamento temporário e paliativo dos indivíduos com DMD (DRACHMAN et al.,1974; WONG & CHRISTOPHER, 2002). A predinisona, outro anti-inflamatório esteroidal, promove resultados semelhantes aos do deflazacorte (BONIFATI et al., 2000; BALABAN et al., 2005). A preferência em usar o deflazacorte é devida ao menor risco do ganho de peso, quando comparado a predinisona (BONIFATI et al., 2000).
O início do tratamento com os esteroides depende dos resultados de avaliações funcionais, da idade do paciente e da existência de fatores de risco pré-existentes, tais como obesidade, atraso na puberdade e hipertensão (BUSHBY et al., 2010). Crianças com idade inferior a dois anos e que estejam adquirindo habilidades motoras não tem indicação para o uso de corticoides, uma vez que estas drogas podem comprometer o desenvolvimento motor (BROOKE et al., 1983).
Estudos demonstram que o deflazacorte melhora a força muscular e prolonga a deambulação (ANGELINI et al. 1994; BONIFATI et al. 2000; BIGGAR et al. 2001; HOUDE et al. 2008; MCADAM et al. 2012). Com a ausência de deambulação o tratamento com corticoide se continua, para que os membros superiores e a postura sejam preservados, além de trazer benefícios cardiorrespiratórios (BIGGAR et al., 2001; HOUDE et al., 2008). Assim como observado em humanos, o deflazacorte quando administrado por um longo prazo em camundongos mdx, retarda a progressão da cardiomiopatia (ACHER et al., 2006; MARQUES et al., 2009).
Acredita-se que os esteroides atuam na DMD na redução da mionecrose e na modulação da resposta inflamatória (SKLAR e BROWN, 1991; PASQUINI et al., 1995). Outros estudos demonstram que os esteroides atuam na redução da degeneração dos músculos (GAUD et al., 2004) e aumento da massa muscular mediada pela inibição da proteólise (RIFAI et al, 1995). A metilpredinisona aumentou a expressão de células satélites e promoveu aumento da expressão da utrofina, proteína que excerce função semelhante a distrofina (SKLAR e BROWN, 1991).
Entretanto, o uso prolongado do deflazacorte promove efeitos colaterais que afetam a qualidade de vida do indivíduo como a puberdade precoce, osteoporose, aumento do peso corporal, dentre outros (ANGELINI & PETERLE, 2012; DRACHMAN et al., 1974). Porém o DFZ ainda é apresentado como uma terapia que promove benefícios para cardiomiopatia (MARKHAM et al., 2008). Dessa forma, novos estudos são realizados com o
objetivo de desenvolver terapias alternativas para a DMD (MANZUR et al., 2008; BEYTÍA et al., 2012).
1.5 ÔMEGA 3 (O3)
O ômega-3 é um ácido graxo poli-insaturado essencial (JAMES et. al., 2000), caracterizado por apresentar dupla ligação no carbono 3, contando a partir da extremidade oposta da carboxila (Figura 3) (PROUDMAN et al., 2008; CALDER, 2008). Com grande importância no músculo esquelético (JAMES et al., 2010; BHULLAR et al., 2016) e sistema cardiovascular (SARAVANAN et al., 2010), porém o ômega-3 deve ser obtido a partir da dieta alimentar por não ser produzido pelo organismo (JAMES et. al., 2000; PROUDMAN et al., 2008). CO OH: ácid o carb oxílico (Adaptado de CALDER et al., 2008).
O ômega-3 pode ser encontrado na semente de linhaça ou castanhas e principalmente no óleo de peixe (JAMES et al., 2000). Diversos estudos demonstram a importância clínica da suplementação alimentar com ômega-3 em casos de artrite reumatoide (CLELAND et al., 2003), doença de Crohn (BELLUZZI et al., 1996), caquexia associada ao câncer (BABCOCK et al., 2000) e doenças cardiovasculares (SIMOPOULOS, 2002).
No músculo cardíaco, o ômega-3 produz diversos efeitos como a redução do risco de morte súbita cardíaca (BLOCK et al., 2008) e redução dos níveis de triglicérides (LEE et al., 2008).
O ácido ecosapentanóico (EPA) e o ácido docosaexaenóico (DHA) apresentam propriedades anti-inflamatórias, diminuindo a mionecrose, bem como reduzindo os níveis de citocinas pró-inflamatórias, como o TNF-α (CLELAND et al., 1988; BABCOCK et al., 2000; CALDER, 2011). O ácido α-linoleico (ALA), ácido graxo derivado de plantas (linhaça, canola, soja), demonstra capacidade de elevação dos níveis de EPA, mas não aumenta os níveis de DHA. Muito embora os níveis de EPA se encontram aumentados decorrente de uma FIGURA 3-ESTRUTURA QUÍMICA DA CADEIA DE EPA E DHA
ingestão de ALA, o EPA demonstra uma maior elevação com a ingesta de EPA em específico (JAMES et al.,2003). Os ácidos graxos pertencentes a família do ômega-6 (ácido linoleico e linolênico) apresentam atividade pró-inflamatória (CALDER, 2011).
Os eicosanoides são moléculas derivadas de ácidos graxos, ômega-3 e ômega-6, e atuam na redução de citocinas inflamatórias. A principal fonte de síntese para obtenção dos eicosanoides advêm do ácido aracdônico (AA). A dieta com ácido ecosapentanóico (EPA) também pode atuar na síntese de ecosanóides pares (Figura 4). Dentre os ecosanóides estão as prostaglandinas (PGs), os tromboxanos (TXs) e leucotrienos (LTs) (CALDER et al., 2008). As PGs e os TXs, também denominados prostanoides, são obtidos a partir da liberação de AA na membrana plasmática por fosfolipase e metabolizados por ciclooxigenases (COXs) e isomerases específicas (TILLEY et al., 2001).
COX: ciclo-oxigenases, LOX: lipo-oxigenases, HETE: ácido hidroxieicosatetraenóico, HPETE: ácido
hidroperoxieicosatetraenóico, PG: prostaglandinas, TX: tromboxanos, LT: leucotrienos (Adaptado de CALDER et al., 2008).
O ácido decosaexanóico (DHA) incorporado na membrana celular interferiu na membrana fosfolipídica, modificando a condução de canais iônicos e alterando o influxo de
cálcio (POUND et al., 2001; JUDÈ et al.,2006). Em nosso laboratório, estudos demonstraram que o ômega 3, contendo EPA e DHA, protegeu os músculos esqueléticos de animais mdx jovens contra a mionecrose e reduziu o infiltrado inflamatório (MACHADO et al., 2011; FOGAGNOLO MAURICIO et al., 2012), assim como melhorou a cardiomiopatia do camundongo mdx na fase tardia da doença (FOGAGNOLO MAURICIO et al., 2016).
Considerando os efeitos positivos do ômega-3 na distrofinopatia do mdx (FOGAGNOLO MAURICIO et al., 2012) e a utilização do deflazacorte como tratamento de escolha dos pacientes com DMD, no presente trabalho levantamos a hipótese de que a associação deflazacorte e ômega-3 poderia ser mais eficaz que a monoterapia com deflazacorte, no tratamento da cardiomiopatia do camundongo mdx, em fase tardia da doença.
2 - OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
O objetivo do presente trabalho foi verificar se a terapia combinada Ômega 3 + deflazacorte é mais efetiva em diminuir a cardiomiopatia do mdx, quando comparada a monoterapia deflazacorte.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Verificar se a terapia combinada (DFZ+O3) tem melhor eficácia quando comparada a monoterapia (DFZ) nas fases tardias da doença, nos seguintes fenômenos da cardiomiopatia:
Função cardíaca, através do exame de eletrocardiograma (ECG);
Níveis de mionecrose, através da mensuração dos níveis séricos da CK-MB e Troponina cardíaca I (cTnI);
Alterações dos componentes do CDG, através da mensuração da β-distroglicana;
Análise da calsequestrina cardíaca, relacionada a regulação do cálcio;
Alteração dos níveis de inflamação obtidos pela análise histológica qualitativa e níveis de mediadores inflamatórios como TNF-α e NF-kB;
Mensuração da fibrose obtida por meio da análise histomorfométrica e níveis de mediadores fibróticos como TGF-β, MMPs, TIMPs e Fibronectina.
3- MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 ANIMAIS
Foram utilizados camundongos com oito meses de idade, de ambos os sexos, da linhagem mdx (C57BL/10-Dmdmdx) e da linhagem controle C57BL/10 (C57BL/10ScCr). Os animais foram adquiridos do Biotério Central da UNICAMP e mantidos no Biotério do Departamento de Biologia Estrutural e Funcional, área de Anatomia, IB, UNICAMP, em caixas padrão (28,5cm de comprimento, 18cm de largura e 13cm de altura) em condições ambientais controladas (12 horas de ciclo claro/escuro, temperatura 23ºC) com ração Nuvilab CR-1 (Nuvital, Paraná, Brasil) e água ad libitum. O uso de animais para o presente trabalho está de acordo com os Princípios Éticos na Experimentação Animal, sob protocolo nº 4253-1, aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da Universidade Estadual de Campinas (CEUA – UNICAMP) (ANEXO A).
Os animais foram divididos em quatro grupos experimentais: Camundongos C57BL/10 tratados com nujol (n=10); Camundongos mdx tratados com nujol (n=10); Camundongos mdx tratados com DFZ (n=10);
Camundongos mdx tratados com associação de Ômega 3 e DFZ (n=10).
3.2 PROTOCOLO EXPERIMENTAL
3.2.1 Grupo tratado com Nujol
Os camundongos da linhagem C57BL/10 e da linhagem mdx foram tratados com óleo mineral (Nujol, Mantecorp, São Paulo, Brasil.) (FOGAGNOLO MAURÍCIO et al., 2012). O tratamento teve início quando os animais completaram oito meses de idade e foram tratados via gavagem três vezes por semana durante cinco meses.
3.2.2 Grupo tratado com Deflazacorte
Os animais mdx foram tratados com 1,2 mg/kg de DFZ (Libbs, Brasil) em meio aquoso via gavagem. O tratamento teve início quando os animais completaram oito meses de idade, com duração de cinco meses e frequência de três vezes na semana.
3.2.3 Grupo tratado com associação Ômega 3 e Deflazacorte
Os camundongos mdx foram tratados com óleo obtido das cápsulas de Omega-3 EPA 1000mg (Fabricado por FDC vitamins, Inc., Miami, Flórida, EUA. Importado e distribuído exclusivamente por Fedco Ind. Ltda.), recebendo 300mg/kg de ômega 3 contendo 0,4g de EPA, 0,2g de DHA, 2mg de vitamina E, 0,9g de proteínas, 2,0g de gorduras totais, 0,4g de gordura saturada, 0,0g de gordura trans, 0,0g de gordura monosaturada e 1,0g de gordura poliinsaturada (FOGAGNOLO MAURÍCIO et al., 2012). Associado ao ômega-3 foi administrado 1,2 mg/kg de DFZ (Libbs, Brasil) em meio aquoso (CARVALHO et al., 2013). O tratamento teve início quando os animais completaram oito meses de idade, com duração de cinco meses e frequência de três vezes na semana.
3.3 OBTENÇÃO DA MASSA CORPORAL
Em todos os grupos foi realizada a medida de massa corporal antes do início do tratamento para ajuste da dose da droga a ser administrada. Para obtenção da massa foi utilizada uma balança modelo AS2000C (Marte balanças e equipamentos®).
3.4 ELETROCARDIOGRAMA
Para a avaliação funcional do coração foi realizado o eletrocardiograma (ECG), tal como descrito anteriormente (MOREIRA et al., 2013; FOGAGNOLO MAURICIO et al., 2016). O ECG foi realizado ao término do tratamento, com 13 meses de idade. Camundongos C57BL10, mdx Nujol, mdx DFZ e mdx DFZ + Ômega-3 (n=5 para cada grupo) foram anestesiados com cloridrato de cetamina (0,09 ml/kg). Os registros foram feitos com eletrodos na forma de agulhas hipodérmicas conectadas a um eletrocardiógrafo computadorizado de quatro canais (MLS360/7 ECG Analysis Module, 14 AD Instruments – Austrália). Os eletrodos foram introduzidos subcutaneamente, dois na junção ventral entre a caixa torácica e os membros anteriores direito e esquerdo e um terceiro na junção do abdomen como membro posterior direito. Os traçados foram obtidos com o animal em decúbito dorsal. As amplitudes das ondas foram mensuradas em milivolts (mV) e as durações dos intervalos em milissegundos (ms), considerando-se a derivação em DII do plano frontal.
3.5 ANÁLISE DE CREATINA QUINASE CARDÍACA (CK-MB)
encontrada em músculos esqueléticos e outros tecidos, a CK-BB é encontrada no cérebro e a CK- MB encontra-se no músculo cardíaco (NANJI, 1983; WALLIMANN et al., 1992; KEMP et al., 2004). A CK-MB é um marcador utilizado para o músculo cardíaco, embora exista em pequena quantidade no músculo esquelético, níveis séricos aumentados indicam lesões no músculo cardíaco, tais como infarto agudo do miocárdio e miocardite (KEMP et al., 2004).
O sangue foi coletado sob aprofundamento de anestesia para eutanásia. Após a toracotomia e exposição do coração, com uma seringa heparinizada retirava-se o sangue (cerca de 1ml) do ventrículo direito. O sangue foi centrifugado (centrifuga refrigerada Sigma® 3-18k) nas seguintes condições: 3000 RCF (Força centrífuga relativa a aceleração da gravidade), 4°C por 10 minutos, sendo o sobrenadante utilizado para análise. Para quantificação da CK cardíaca foi utilizado o kit CK cardíaca-MB (CK Cinético Crystal, Bioclin, Quibasa, Brasil). As absorbâncias das amostras foram lidas a 25°C utilizando-se espectrofotômetro U.V. (Thermo Electron Corporation® Spectrophotometer Genesys 20) com comprimento de onda de 340 nm e cubetas de quartzo de 1cm de caminho óptico. Os valores foram expressos em U/L.
3.6 OBTENÇÃO DO MÚSCULO CARDÍACO
Os animais foram eutanasiados com anestesia intraperitoneal composta por uma mistura de cloridrato de cetamina (130mg/kg Francotar, Virbac, São Paulo, Brasil) e cloridrato de xilazina (6,8mg/kg, 2%, Virbaxyl, Virbac). Foi realizada toracotomia e em seguida o corações foram retirados, fixados em suportes de madeira com tragacanth gum, imersos em isopentano à -80ºC por 40 segundos e imediatamente colocados em nitrogênio líquido à -159ºC. Os músculos foram retirados do nitrogênio e armazenados à -70ºC em Biofreezer (BioFreezerJouan, VX380, Laboratório de Biologia Estrutural da Junção Neuromuscular, Departamento de Biologia Estrutural e Funcional, IB). Para obtenção dos cortes, os músculos foram descongelados por aproximadamente 30 minutos até atingirem a temperatura de -23ºC e seccionados transversalmente na espessura de 7μm utilizando criostato (Leica CM1860, Laboratório de Biologia Estrutural da Junção Neuromuscular, Departamento de Biologia Estrutural e Funcional, IB).
3.7 PREPARO DO MÚSCULO CARDÍACO PARA COLORAÇÃO COM
HEMATOXILINA E EOSINA
por 24 horas, em seguida lavadas em água corrente por dez minutos. Os cortes foram corados primeiro com hematoxilina de Harris por oito minutos e, em seguida, com eosina, por dois minutos. Após, os cortes foram desidratados em séries de etanol, diafanizados em xilol e as lâminas montadas em Entelan para posterior observação em microscopia de luz.
As lâminas coradas com HE foram observadas em fotomicroscópio (Nikon Eclipse E-400) com objetiva de 10X acoplado a um computador e vídeo câmera (Nikon Express Series, Shinagawa, Tokyo, Japão). Para cada músculo (n=5 para cada grupo) foram utilizados dois cortes aleatórios para análise qualitativa da área de inflamação/regeneração (áreas com aparente aumento da celularidade).
3.8 PREPARO DO MÚSCULO CARDÍACO PARA COLORAÇÃO COM TRICÔMICO DE MASSON
As lâminas permaneceram imersas no Bouin por um período de uma hora e em seguida lavadas no álcool 70% por 24 horas, após este período foram lavadas em água corrente por dez minutos. A coloração com hematoxilina de Harris foi de 8 minutos, em seguida as lâminas foram lavadas novamente em água corrente por dez minutos e imersas em solução de Masson por trinta minutos. A seguir, as lâminas foram lavadas três vezes em solução de ácido acético a 0,2%, mergulhadas em solução de azofloxina por onze minutos e, em seguida, em solução de verde luz (light green) por dezoito minutos. Após esta etapa, os cortes foram lavados três vezes em ácido acético a 0,2% e foram submetidos à desidratação em série de etanol e à diafanização com xilol. As lâminas foram montadas em Entelan® (Merck).
As lâminas coradas foram observadas com auxílio de objetiva de 10X no fotomicroscópio (Nikon Eclipse E-400) acoplado a um computador e vídeo câmera (Nikon Express Series, Shinagawa, Tokyo, Japão). Para quantificação manual da área total de secção transversa do músculo cardíaco e da área ocupada por tecido conjuntivo, indicativo de fibrose, foi utilizado o software Image Pro-Plus® Version 6.0.0.260.
3.9 ANÁLISE MORFOMÉTRICA
Foram escolhidos dois cortes inteiros de cada músculo (n=5 para cada grupo). Cortes transversais foram observados com auxílio de objetiva de 10X no fotomicroscópio (Nikon Eclipse E-400) acoplado a um computador e vídeo câmera (Nikon Express Series, Shinagawa, Tokyo, Japão). Os cortes foram fotografados em varredura, com a finalidade de
fotografar toda extensão do músculo. As fotos foram organizadas no Power Point 2013, individualizando o ventrículo esquerdo, septo interventricular e ventrículo direito. Para análise morfométrica da fibrose foi utilizado o software Image Pro-Plus® Version 6.0.0.260, sendo quantificados separadamente o ventrículo esquerdo, septo interventricular e ventrículo direito.
3.10 WESTERN BLOT
Para verificar se o tratamento proposto alterou a quantidade de proteínas relacionadas a inflamação (TNF-α e NFkB), mionecrose (Troponina 1), fibrose (TGF-β, MMP-2, TIMP-1 e Fibronectina), integridade do complexo distrofina-glicoproteína (β-distroglicana), tamponamento de cálcio (calsequestrina cardíaca – CSQ). A normalização das proteínas analisadas foi obtida a proteína gliceraldeído 3-fosfato dehidrogenase (GAPDH). Foram utilizados 3 pulls, contendo 3 animais em cada pull.
3.10.1 Anticorpos
Anticorpos primários:
CSQ cardíaca (Calsequestrina; rabbit polyclonal ntibody IgG - Thermo Scientific); Fibronectina (rabbit polyclonal - Abcam discover more, Cambridge);
MMP2 (metaloproteinase 2; polyclonal goat, R&D Systems, USA);
NF-kB (fator nuclear kB; rabbit/goat polyclonal – Santa Cruz Biotechnology, USA); TGF-β (transforming growth factor; mouse monoclonal – Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA);
TIMP1 (inibidor tecidual endógeno de metaloproteinase 1; rat monoclonal to TIMP1 – Abcam discover more);
TNF-α (tumor necrosis factor; Rabbit anti- mouse tumor necrosis factor –α, polyclonal antibody – Millipore);
cTnI (Troponina cardíaca I; mouse monoclonal to cardiac troponin I – Abcam discover more);
β-Distroglicana (Lyophilized mouse monoclonal antibody - Novocastra Laboratories Ltd.);
GAPDH (gliceraldeído-3-fosfato-dehidrogenase; rabbit polyclonal antibody – Santa Cruz Biotechnology INC, Santa Cruz, Califónia, USA).
Anticorpos secundários: IgG rabbit, mouse e goat conjugado à peroxidase correspondente ao anticorpo primário (H+L) (KPL, Gaithersburg, Maryland, USA).
3.10.2 Preparo do extrato total
Os músculos retirados após eutanásia, como descrito previamente, foram homogeneizados em tampão para homogeneização (Tris-HCl 100 mM, pirofosfato de sódio 100 mM, fluoreto de sódio 100 mM, 10 μg/ml aprotinin, PMSF 1 mM, e Na3VO 0,25 mM) a 4ºC usando o 18 Polytron PTA 20S (Brinkmann Instruments, Westbury, NewYork, EUA), operado em velocidade máxima por 30 segundos. Os extratos foram centrifugados a 11000 RCF (Força centrífuga relativa a aceleração da gravidade), 4°C por 20 minutos. O sobrenadante foi coletado e a concentração de proteínas foi determinado pelo método de Bradford et al. (1976).
3.11.3 Análise de proteínas
As amostras do extrato proteico foram tratadas com tampão Laemmli (azul de bromofenol 0,04 mg/ml eTris-HCl 0,12 M, glicerol 20%, SDS 2% e ß-mercaptoetanol 0,28 M) e aquecidas por 5 minutos a 100o C (Accus Block Digital Dry Bath, Labnet International,
Inc.). Em seguida, a quantidade de proteína determinada pelo Bradford foi pipetada em gel SDS poliacrilamida 12% e colocada em aparelho para eletroforese (mini-Protean, Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, EUA). A eletrotransferência do gel para a membrana de nitrocelulose foi realizada em 90 minutos a 120 V em aparelho de transferência (mini-Protean, Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, EUA). As membranas foram incubadas com solução basal (Trisma base 10 mM, cloreto de sódio 150 mM e Tween-20 0,02%) com os respectivos anticorpos primários a 4ºC, durante 12 horas. Após 12 horas, as membranas foram lavadas por 30 minutos com solução basal, e incubadas com anticorpos secundários, diluídos em 10 ml de solução basal por duas horas, em temperatura ambiente. Posteriormente, as membranas foram lavadas com solução basal por 30 minutos. As diluições dos anticorpos primários e secundários foram definidas de acordo com a marcação obtida.
Para detectar as bandas imunorreativas, as membranas foram expostas a solução de quimiluminescência (Super Signal West Pico Chemiluminescente Pierce Biotechnology, Rockford, Illinois, USA) por 5 minutos, seguida de exposição no G-Box Chemi (Syngene, Maryland-USA). A detecção das bandas imunofluorescentes e a quantificação foram feitas no
aparelho G-Box Chemi pelo software de aquisição de imagem GeneSnap (Syngene, Maryland-EUA). As densidades das bandas foram quantificadas pelo software de análise GeneTools (Syngene, Maryland-EUA). Após a quantificação no G-Box, os dados foram transferidos para o Excel.19 e normalizados com os valores obtidos do GAPDH da respectiva membrana. Todas as membranas foram coradas em Ponceau para certificação de que a quantidade de proteína foi a mesma em todas as amostras.
3.11 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados foram normalizados através do teste Kormogorov-Smirnov. Os resultados foram apresentados como média ± desvio padrão. O teste t de Student foi utilizado para comparação direta entre as médias de dois grupos experimentais. A comparação entre três grupos foi realizada através de análise de variância (ANOVA) de uma via, seguido pelo pós-teste de Newman-Keuls. Para todos os resultados obtidos, os valores de P foram considerados estatisticamente significantes apenas quando inferiores a 0,05 (P<0,05). Para todos os cálculos estatísticos foi utilizado o software GraphPad Prism versão 6.01 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA).
4– RESULTADOS
4.1 MASSA CORPORAL
A massa corporal (Tabela 1) dos animais em estudo não apresentou diferença significativa quando comparado ao mesmo grupo no pré- tratamento e pós-tratamento.
TABELA 1-MÉDIAS COM DESVIO PADRÃO DAS MASSA CORPORAIS NO INÍCIO (PRÉ) E NO FINAL (PÓS) DOS TRATAMENTOS
GRUPO PRÉ-TRATAMENTO PÓS-TRATAMENTO
C57BL10 28,92±3,54 30,31±2,7
Mdx nujol 32,88±3,55 32,22±3,34
Mdx DFZ 33,53±2,58 32,52±2,67
Mdx DFZ+O3 31,63±2,82 30,29±3,52
Grupos: C57BL10 (camundongos C57BL10 tratados com Nujol), mdx Nujol (camundongos mdx tratados com nujol), mdx DFZ (camundongos mdx tratados com deflazacorte) e mdx DFZ+O3 (camundongos mdx tratados com a associação de deflazacorte com o óleo contido nas cápsulas de Ômega 3). Estão representadas médias com desvio padrão das massas corporais mensuradas a partir de 10 animais. A significância estatística foi determinada pelo teste t de Student (Adaptado de Maciel Junior, 2017).
4.2 ANÁLISE FUNCIONAL: ELETROCARDIOGRAMA
A Figura 5 mostra traçados ECG representativos dos diferentes grupos, com o padrão das amplitudes e dos intervalos. No animal distrófico não tratado (mdx-nujol) verificou-se diminuição do intervalo PR e ondas de diferentes amplitudes e ausência da onda S, quando comparado ao animal controle.
FIGURA 5-TRAÇADOS ELETROCARDIOGRÁFICOS E RELAÇÃO S/R
Grupos: C57BL10 (camundongos C57BL10 tratados com Nujol), mdx Nujol (camundongos mdx tratados com nujol), mdx DFZ (camundongos mdx tratados com deflazacorte) e mdx DFZ+O3 (camundongos mdx tratados com a associação de deflazacorte com o óleo contido nas cápsulas de Ômega 3. a: diferença significativa quando comparado com o grupo C57BL/10. A significância estatística foi determinada pelo teste ANOVA de uma via, seguido pelo pós-teste de Newman-Keuls.
A análise da razão S/R (Figura 5) indica que as terapias levam a um aumento desta razão, de forma discreta, não atingindo valores próximos do normal (C57BL/10: 85% razão S/R versus mdx-DFZ+O3: 11% razão S/R, p<0,001). No grupo mdx nujol a razão S/R representou apenas 1,5%.
Grupos: C57BL10 (camundongos C57BL10 tratados com Nujol), mdx Nujol (camundongos mdx tratados com nujol), mdx DFZ (camundongos mdx tratados com deflazacorte) e mdx DFZ+O3 (camundongos mdx tratados com a associação de deflazacorte com o óleo contido nas cápsulas de Ômega 3). a: diferença significativa quando comparado com o grupo C57BL/10; b: diferença significativa quando comparado com o grupo mdx nujol; c: diferença significativa comparado com o grupo mdx DFZ. A significância estatística foi determinada pelo teste ANOVA de uma via, seguido pelo pós-teste de Newman-Keuls.
A análise quantitativa das amplitudes (Figura 6) permite observar que o animal distrófico (mdx-nujol) apresentou alterações significativas na amplitude da onda Q (9 vezes aumentada em relação ao controle – p<0,001) e da onda S (diminuída em cerca de 30 vezes – p<0,001). A frequência cardíaca do mdx estava aumentada em cerca de 33%, comparada a frequência do animal controle (C57BL/10).
FIGURA 6-MÉDIAS DAS AMPLITUDES E FREQUÊNCIA CARDÍACA OBTIDAS NO ELETROCARDIOGRAMA
Grupos: C57BL10 (camundongos C57BL10 tratados com Nujol), mdx Nujol (camundongos mdx tratados com nujol), mdx DFZ (camundongos mdx tratados com deflazacorte) e mdx DFZ+O3 (camundongos mdx tratados com a associação de deflazacorte com o óleo contido nas cápsulas de Ômega 3). a: diferença significativa quando comparado com o grupo C57BL/10; b: diferença significativa quando comparado com o grupo mdx nujol; c: diferença significativa comparado com o grupo mdx DFZ. A significância estatística foi determinada pelo teste ANOVA de uma via, seguido pelo pós-teste de Newman-Keuls.
A análise quantitativa dos intervalos (Figura 7) indica que no mdx todos os intervalos estavam alterados em comparação ao controle (C57BL10). O intervalo PR (figura 7) nos animais mdx nujol, apresentou uma redução de 12,88% (p<0,05). O intervalo QRS sofreu aumento de 29,59% (p<0,01), no intervalo QT o aumento representou 59,27% (p<0,001) e no intervalo QTc aumentou cerca de 86,04% (p<0,001). O mdx apresentou aumento do índice de cardiomiopatia (Figura 7), elevado em cerca de 68,51% (p<0,001) relação ao animal normal.
FIGURA 7-MÉDIAS DOS INTERVALOS E ÍNDICE DE CARDIOMIOPATIA OBTIDOS NO ELETROCARDIOGRAMA
Os efeitos do DFZ no ECG foi melhor observados na frequência cardíaca (Figura 6). O DFZ diminuiu a frequência cardíaca em 44% (Figura 6 – p<0,001). O tratamento com DFZ apresentou piora no intervalo QT e no índice de cardiomiopatia (Figura 7). No índice de cardiomiopatia o tratamento com DFZ, aumentou cerca de 70% (p<0,001) quando comparado ao grupo mdx nujol, bem como o intervalo QT (Figura 7) e a amplitude da onda Q (Figura 7). O intervalo PR apresentou uma tendência de redução (20,86%), mas não significativa, pelo DFZ quando comparado aos animais mdx nujol.
Quanto aos efeitos da terapia combinada, observamos que esta terapia foi mais eficaz que a monoterapia na redução da onda Q (Figura 6). A frequência cardíaca não foi afetada pela terapia combinada, que permaneceu aumentada em relação ao animal normal (Figura 6). O índice de cardiomiopatia (Figura 7) também foi aumentado pelo DFZ+O3, porém em níveis menores que aqueles observados com o DFZ. A terapia combinada apresentou uma redução em cerca de 30% (p<0,01) no índice de cardiomiopatia, quando comparado a monoterapia (DFZ).
4.3 ANÁLISE DA CREATINA QUINASE (CK-MB)
A CK-MB encontra-se aumentada 139% (p<0,001) no coração distrófico, quando comparado ao animal controle (C57BL/10). Ambas terapias reduziram a CK-MB, mas esta redução não foi significativa (Figura 8).
Grupos: C57BL10 (camundongos C57BL10 tratados com Nujol), mdx Nujol (camundongos mdx tratados com nujol), mdx DFZ (camundongos mdx tratados com deflazacorte) e mdx DFZ+O3 (camundongos mdx tratados com a associação de deflazacorte com o óleo contido nas cápsulas de Ômega 3). Cada coluna representa a média dos níveis de CK obtidas a partir de 5-6 animais. a: diferença significativa quando comparado com o grupo
C57BL/10. A significância estatística foi determinada pelo teste ANOVA de uma via, seguido pelo pós-teste de Newman-Keuls.
4.4 ANÁLISE QUALITATIVA DO MÚSCULO CARDÍACO COM HE
Na análise histopatológica do músculo cardíaco (Figura 9) do animal normal (C57BL10) observa-se que os cardiomiócitos apresentam aspecto alongado e possuem um ou dois núcleos localizados centralmente (Figura 9). Nos animais mdx o endomísio na célula cardíaca apresenta um aumento (Figura 9), sendo em maior quantidade nos animais mdx DFZ e mdx DFZ+O3. Não foi observado infiltrado inflamatório nos músculos cardíacos dos animais mdx com 13 meses de vida (Figura 9).
Representado em A, músculo do camundongo controle (C57BL10). Em B, músculo do camundongo mdx nujol. Em C, músculo do camundongo mdx tratado com DFZ. Em D, músculo do camundongo mdx tratado com DFZ+O3. Escala 100µm. Indicados pela cabeça de seta: núcleo central, Seta: célula com aspecto alongado, Asterisco: espessamento do endomísio.
4.5 ANÁLISE QUALITATIVA E QUANTITATIVA DO MÚSCULO CARDÍACO COM TM
Em uma análise qualitativa dos músculos cardíacos dos animais mdx (Figura 10) corados com TM é possível visualizar áreas de fibrose (representadas na cor verde) por toda extensão de ventrículos e septo interventricular.
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FIGURA 9-CORTES TRANSVERSAIS DO MÚSCULO CARDÍACO AO NÍVEL DE VENTRÍCULOS CORADOS COM HE
Músculo de camundongo mdx tratado com nujol. Músculo de camundongo mdx tratado com DFZ. Músculo de camundongo mdx tratado com DFZ+O3. Área de fibrose representada pela cor verde. Escala 100μm. VE: ventrículo esquerdo; VD: ventrículo direito; SEPTO: septo interventricular.
Em uma análise qualitativa do músculo cardíaco normal (C57BL10), na idade estudada (13 meses), não foram observadas áreas de fibrose (Figura 11). O coração distrófico do animal não tratado (mdx-nujol) bem como o coração distrófico dos animais tratados com DFZ ou com a terapia combinada por outro lado, apresentou aumento aparente da fibrose.
Representado em A, músculo do camundongo controle (C57BL10). Em B, músculo do camundongo mdx nujol. Em C, músculo do camundongo mdx tratado com DFZ. Em D, músculo do camundongo mdx tratado com DFZ+O3. Área de fibrose representada pela cor verde-luz. Escala 100µm.
Em uma análise quantitativa (Figura 12), a porcentagem total de fibrose no músculo cardíaco distrófico representou cerca de 40%. A partir dessa porcentagem, a fibrose no ventrículo esquerdo (VE, Figura 12) foi diminuída em 20,6% pelo DFZ e 32% pela terapia ESQUERDO CORADOS COM TRICRÔMICO DE MASSON PARA EVIDENCIAR FIBROSE
FIGURA 11-CORTES TRANSVERSAIS DO MÚSCULO CARDÍACO AO NÍVEL DE VENTRÍCULOS CORADOS COM TM.
combinada, em relação ao mdx nujol. O septo interventricular (Figura 12) não apresentou diferença significativa entre os grupos mdx. Entretanto, foi observado uma tendência na redução da porcentagem de fibrose nos animais submetidos a terapia (DFZ e DFZ+O3), representando uma redução de 4,19% nos animais mdx DFZ e 20,75% nos animais mdx DFZ+O3.
Os níveis de fibrose observados no ventrículo direito (VD, Figura 12) reduziram em 27,47% (p<0,05) nos animais mdx DFZ+O3, quando comparado aos animais mdx nujol. Uma redução de 38,06% (p<0,001) foi observada, quando comparada a terapia combinada com a terapia DFZ. Portanto a terapia DFZ apresentou um aumento de 17,09% na fibrose do VD, quando comparado aos animais mdx nujol.
Grupos: mdx nujol (camundongos mdx tratados com nujol), mdx DFZ (camundongos mdx tratados com deflazacorte) e mdx DFZ+O3 (camundongos mdx tratados com a associação de deflazacorte com o óleo contido nas cápsulas de Ômega 3). a: diferença significativa quando comparado com o grupo mdx nujol; b: diferença significativa quando comparado com o grupo mdx DFZ. A significância estatística foi determinada pelo teste ANOVA de uma via, seguido pelo pós-teste de Newman-Keuls.
4.6 WESTERN BLOT
4.6.1 Integridade do CDG
Os níveis de β-distroglicana (Figura 13) estavam significativamente diminuídos (38%) nos animais mdx nujol quando comparados aos animais controle (C57BL/10). Apesar de não apresentar diferença significativa, o grupo mdx DFZ apresentou um aumento de 19,23% quando comparado aos animais mdx nujol. Ainda é possível observar um discreto aumento (3,84%) nos animais mdx DFZ+O3, quando comparado aos animais mdx nujol. FIGURA 12-PORCENTAGEM DA ÁREA DE FIBROSE NO VENTRÍCULO ESQUERDO (VE), SEPTO E VENTRÍCULO DIREITO (VD).
Grupos: C57BL10 (camundongos C57BL10 tratados com Nujol), mdx Nujol (camundongos mdx tratados com nujol), mdx DFZ (camundongos mdx tratados com deflazacorte) e mdx DFZ+O3 (camundongos mdx tratados com a associação de deflazacorte com o óleo contido nas cápsulas de Ômega 3). Os níveis representativos no gráfico foram normalizados pelo GAPDH, expressos em unidade arbritária. a: diferença significativa quando comparado com o grupo C57BL10. A significância estatística foi determinada pelo teste ANOVA de uma via, seguido pelo pós-teste de Newman-Keuls.
4.6.2 Tamponamento de cálcio
Os níveis de CSQ cardíaca (Figura 14) estavam reduzidos em 42,13% (p<0,001) nos animais mdx nujol em relação aos animais controle. As terapias farmacológicas não apresentaram diferença significativas.
Grupos: C57BL10 (camundongos C57BL10 tratados com Nujol), mdx Nujol (camundongos mdx tratados com nujol), mdx DFZ (camundongos mdx tratados com deflazacorte) e mdx DFZ+O3 (camundongos mdx tratados com a associação de deflazacorte com o óleo contido nas cápsulas de Ômega 3). Os níveis representativos no gráfico foram normalizados pelo GAPDH, expressos em unidade arbritária. a: diferença significativa quando comparado com o grupo C57BL10. A significância estatística foi determinada pelo teste ANOVA de uma via, FIGURA 14-QUANTIFICAÇÃO POR WESTERN BLOTTING DA CALSEQUESTRINA NO
MÚSCULO CARDÍACO.
FIGURA 13-QUANTIFICAÇÃO POR WESTERN BLOTTING DA Β-DISTROGLICANA NO MÚSCULO CARDÍACO.
seguido pelo pós-teste de Newman-Keuls.
4.6.3 Mionecrose
Os níveis de Troponina I (Figura 15) não apresentaram modificações significativas entre os grupos. Ainda que não apresente diferença significativa, é possível observar uma redução de 22,65% nos animais mdx nujol, quando comparado aos animais C57BL10. Um aumento de 4,87% é observado nos animais mdx DFZ, quando comparado aos animais mdx nujol. Uma redução de 9,76% é encontrada nos animais DFZ+O3, quando comparado aos animais mdx nujol.
Grupos: C57BL10 (camundongos C57BL10 tratados com Nujol), mdx Nujol (camundongos mdx tratados com nujol), mdx DFZ (camundongos mdx tratados com deflazacorte) e mdx DFZ+O3 (camundongos mdx tratados com a associação de deflazacorte com o óleo contido nas cápsulas de Ômega 3). Os níveis representativos no gráfico foram normalizados pelo GAPDH, expressos em unidade arbritária. A significância estatística foi determinada pelo teste ANOVA de uma via, seguido pelo pós-teste de Newman-Keuls.
4.6.4 Inflamação
Os níveis de TNF-α (Figura 16) estavam aumentados no mdx nujol (84,61%, p<0,01), quando comparado aos animais controle (C57BL10). Ambas terapias reduziram os níveis de TNF-α, sendo observado uma redução de 33,34% (p<0,05) nos animais tratados com DFZ e uma redução de 37,5% (p<0,05) nos animais tratados com terapia combinada (DFZ+O3), quando comparado aos animais mdx nujol. Não foi observado diferença significativa entre os animais controle e animais tratados com DFZ e DFZ+O3.
FIGURA 15-QUANTIFICAÇÃO POR WESTERN BLOTTING DA TROPONINA I NO MÚSCULO CARDÍACO.
Grupos: C57BL10 (camundongos C57BL10 tratados com Nujol), mdx Nujol (camundongos mdx tratados com nujol), mdx DFZ (camundongos mdx tratados com deflazacorte) e mdx DFZ+O3 (camundongos mdx tratados com a associação de deflazacorte com o óleo contido nas cápsulas de Ômega 3). Os níveis representativos no gráfico foram normalizados pelo GAPDH, expressos em unidade arbritária. a: diferença significativa quando comparado com o grupo C57BL10; b: diferença significativa quando comparado com o grupo mdx nujol. A significância estatística foi determinada pelo teste ANOVA de uma via, seguido pelo pós-teste de Newman-Keuls.
O mdx-nujol apresentou níveis elevados de NF-kB (Figura 17) em relação aos animais controle (65,83%, p<0,01). As terapias reduziram o NF-kB a níveis semelhantes ao do animal controle, com diminuição de 41,2% (p<0,01) na terapia DFZ e redução de 28,09% (p<0,05) na terapia combinada.
Grupos: C57BL10 (camundongos C57BL10 tratados com Nujol), mdx Nujol (camundongos mdx tratados com nujol), mdx DFZ (camundongos mdx tratados com deflazacorte) e mdx DFZ+O3 (camundongos mdx tratados com a associação de deflazacorte com o óleo contido nas cápsulas de Ômega 3). Os níveis representativos no gráfico foram normalizados pelo GAPDH, expressos em unidade arbritária. a: diferença significativa quando comparado com o grupo C57BL10; b: diferença significativa quando comparado com o grupo mdx nujol. A significância estatística foi determinada pelo teste ANOVA de uma via, seguido pelo pós-teste de Newman-Keuls.
FIGURA 17-QUANTIFICAÇÃO POR WESTERN BLOTTING DO NF-KB NO MÚSCULO CARDÍACO. FIGURA 16-QUANTIFICAÇÃO POR WESTERN BLOTTING DO TNF-ALPHA NO MÚSCULO CARDÍACO.
