A região codificante V5 epitope e a sequencia co totalizando 105 aminoácid 11.8 kDa e a mesma deve
Compute pI/Mw tool (figura
Figura 10 – Análise da seque realizada pela ferramenta Com molecular de 11829.62 Da e um
nto do DNA.
a sequencia codificante para a toxina LTx5 enco berta de leitura), os DNA’s plasmidiais das o do fragmento de 448 pb na orientação c
método descrito por Sanger e colaboradores (S ltados obtidos nos permitiu identificar o códon de ra a toxina madura LTx5 inseridos no frame corre codificante para o V5 epitope, a cauda de poli-
quencia de aminoácidos da LTx5 recombinante
nte para a LTx5 recombinante, mais a região codi codificante para a cauda de histidina possui 315 p
idos. A massa molecular da proteína é de apro ve apresentar um pI 8.25, simulados utilizando ura 10) disponível em www.expasy.org.
uencia primária de aminoácidos da LTx5 recombinan ompute pI/Mw (www.expasy.org) nos mostra uma prote
m pI de 8.25. 43 ncontrava-se no s colônias que correta foram (Sanger et al., de iniciação e a reto, bem como -histidina e o nte. dificante para o 5 pares de base, roximadamente o a ferramenta ante. A predição oteína com massa
4.6 Expressão da p
Para análise da expr indução foram submetidas condições desnaturantes. A galactose. Em uma das can (Amersham Biosciences) e total. Nestas condições não recombinante nos diferente
Figura 11 - SDS-Tricina-PAG proteína total foram aplicados µL de Low Molecular Weight utilizado extrato protéico de W da proteína recombinante com
proteína recombinante LTx5 com 2% de galac
pressão da LTx5 as amostras protéicas de diferen as à separação eletroforética em gel de poliac . A figura 11 refere-se ao processo de indução
analetas foram aplicados 2 µL do padrão de mas e nas demais canaletas foram aplicados 30 µg ão foi possível identificar diferença de expressã tes tempos de indução.
GE dos diferentes tempos de indução com 2% de gala os em cada canaleta. Como padrão de massa molecular t (Amersham Biosciences). Como controle da expressão W303-1A não transformada. A seta azul indica a poss m massa molecular de 11.8 kDa.
44 lactose. entes tempos de liacrilamida em ão com 2% de assa molecular g de proteína são da proteína lactose. 30 µg de lar foi utilizado 2 são heteróloga foi ssível localização
4.7 Dot Blot.
Com o objetivo de i induzidos com 2% de gala nitrocelulose foi sensibiliza tempos de indução. Como tagged Protein Standard (In extrato protéico de W303-1 expressão da proteína rec galactose.
Figura 12 - Dot Blotting d nitrocelulose foi sensibilizada c a vácuo, em um sistema Bio-Do em solução PBS-T 0,05% con (Novagen) diluído 1:2000 e com 1:2000 (Zymed/Invitrogen). controle positivo foi utilizado Como controle negativo foi uti expressão da proteína recomb em baixo nível de expressão, a
e identificar a expressão da proteína recombinante lactose foi realizado um Dot Blotting no qual a izada com 100 µg de proteínas dos extratos totais d
o controle positivo foi utilizado 1 µL de Bench (Invitrogen), e como controle negativo foi utiliza
1A não transformada. Na figura 12 observamos ecombinante a partir de 48 horas de indução
das amostras induzidas com 2% de galactose. A a com extratos protéicos dos diferentes tempos de induç Dot™ Apparatus (Biorad). Posteriormente, a membran ontendo 5% de leite em pó e incubada com anticorp om anticorpo anti IgG de camundongo conjugado à per Foram aplicados 100 µg de proteína total em cada o 1 µL de Benchmark™ His-tagged Protein Standar utilizado 100 µg de extrato protéico de W303-1A não tr binante contendo a cauda de histidina pode ser identi a partir de 48 horas de indução com 2% de galactose.
45 nte nos extratos a membrana de is dos diferentes chmark™ His- zado 100 µg de os uma possível o com 2% de membrana de ução, por sucção ana foi bloqueada rpo anti His-Tag eroxidase diluído da ponto. Como ard (Invitrogen). transformada. A ntificada, embora
4.8 Expressão da p
Na tentativa de ob tentamos expressá-la em m se observar uma possível p kDa sendo expressa princ quando aplicados 50 µg de assim uma maior separaçã nível, a expressão de uma p
Figura 13 – SDS-Tricina-PAGE indução, com 4% de galactose padrão de massa molecular foi Para controle da expressão het A seta em azul indica uma prot indução.
proteína recombinante LTx5 com 4% de galac
obter uma melhor expressão da LTx5 recom meio SD-URA contendo 4% de galactose. Na fig l proteína com uma massa molecular aparente pr
ncipalmente no tempo 60 horas de indução. N de proteína total em um gel de maior dimensão, p ção das proteínas, observamos sutilmente, embo a proteína a partir de 36 horas de indução com 4%
GE dos extratos protéicos obtidos em culturas em difere se. Foram aplicados 30 µg de proteína total em cada c foi utilizado 2 µL de Low Molecular Weight (Amersham eteróloga foi utilizado extrato protéico de W303-1A não roteína com massa proxima a 11.8 kDa sendo expressa c
46 lactose. ombinante, nós figura 13 pode- próxima a 11.8 Na figura 14, , possibilitando bora em baixo % de galactose. erentes tempos de a canaleta. Como am Biosciencess). ão transformada. com 60 horas de
Figura 14 - SDS-Tricina-PAGE indução, com 4% de galactose molecular foi utilizado 2 µL de expressão heteróloga foi utiliza indica uma proteína com mass de indução.
4.9 Dot Blot.
A figura 15 nos mos de galactose. A figura nos m 0h) e um pequeno aument proteína na presença da ra GAL1 não estar reprimido n Benchmark™ His-tagged utilizado extrato protéico de
GE dos extratos protéicos obtidos em culturas em difere e. Foram aplicados 50 µg de proteína total. Como pa de Low Molecular Weight (Amersham Biosciencess). Co izado extrato protéico de W303-1A não transformada. ssa molecular proxima a 11.8 kDa sendo expressa a par
ostra o Dot Blotting referente ao processo de ind s mostra uma expressão basal da proteína recombi ento da expressão ao longo do tempo. A expres rafinose como fonte de carbono se deve ao fato o nesta condição. Como controle positivo foi utili d Protein Standard (Invitrogen). Como controle
de W303-1A não transformada.
47 erentes tempos de padrão de massa Como controle da a. A seta em azul artir de 36 horas ndução com 4% binante (tempo ressão basal da to do promotor tilizado 1 µL de le negativo foi
48 Figura 15 - Dot Blotting. A membrana de nitrocelulose foi sensibilizada com 30 µg de extratos protéicos dos diferentes tempos de indução, com 4% de galactose, por sucção a vácuo em sistema Bio-Dot™ Apparatus (Biorad). Posteriormente a membrana foi bloqueada em solução PBS-T 0,05% contendo 5% de leite em pó, e incubada com anticorpo anti His-Tag (Novagen) diluído 1:2000 e com anticorpo anti IgG de camundongo conjugado à peroxidase diluído 1:2000 (Zymed/Invitrogen). Como controle positivo foi utilizado 1 µL de Benchmark™ His-tagged Protein Standard (Invitrogen). Como controle negativo foi utilizado 30 µg de extrato protéico de W303-1A não transformada. A expressão da proteína recombinante LTx5 pode ser identificada, embora em baixo nível de expressão, a partir de 36 horas de indução.