Na tentativa de fracionamento do extrato protéico contendo a proteína recombinante, foi utilizado o sistema Microcon® YM-50K. O sistema YM-50K, segundo informações do fabricante, possibilita o fracionamento de 90% de proteínas com massa molecular em torno de 12.4 kDa, e retenção de 10% das mesmas. Entretanto, a utilização de extrato total impossibilita a utilização deste recurso, uma vez que a alta concentração protéica satura os poros da membrana, impossibilitando assim, o fracionamento das proteínas. Uma alternativa criada foi a diluição do extrato protéico, entretanto, não obtivemos um melhor resultado devido ao baixo nível de expressão da proteína LTx5 recombinante neste sistema de expressão.
53 5. DISCUSSÃO.
Com o advento comercial de pesticidas sintéticos, a partir da década de 40, os produtos químicos se tornaram a principal forma de controle de pragas urbanas, em produtos agrícolas, e do controle de pragas de importância médica (Tedford et al., 2004). No entanto, o desenvolvimento de resistência das pragas aos pesticidas, juntamente com a maior conscientização dos impactos que esses produtos químicos trazem à saúde e ao meio ambiente, tem estimulado a busca de compostos bioinseticidas. Atualmente, os bioinseticidas constituem apenas de 2 a 3% dos pesticidas disponíveis para comercialização (Whetstone et al., 2007).
O estudo de toxinas presentes em venenos de animais para utilização como bioinseticidas é muito promissor (Gershburg et al., 1998; Regev et al., 2003). A alta toxicidade e principalmente, a seletividade de peptídeos tóxicos presentes no veneno de diversos organismos como aranhas (Rash et al., 2002), escorpiões (Gurevitz et al., 2007), cobras (Gomes et al., 2005) e caracóis (Terlau et al., 2004) torna cada vez mais atrativo o uso de biopesticidas de origem animal para controle biológico de pragas. O estudo de toxinas animais vem apresentando crescimento contínuo (Moran et al., 2009). O veneno da aranha do gênero Lasiodora sp, objeto deste trabalho, ainda é pouco explorado. Alguns trabalhos publicados na literatura científica mostram a ação do veneno total da aranha Lasiodora sp em organismos vertebrados e invertebrados (de Deus, 2003; Kalapothakis et al., 2003; Kushmerick et al., 2001). A varredura de uma biblioteca de cDNA construída a partir do mRNA da glândula de veneno da aranha
Lasiodora sp permitiu a identificação de quatro peptídeos tóxicos presentes no veneno
desta aranha, que foram nomeados LTx1, LTx2, LTx3 e LTx5 (Vieira, 2005). A toxina LTx5, alvo de nosso estudo, é sintetizada como um pré-pró-peptídeo composto por um peptídeo hidrofóbico composto por 17 resíduos de aminoácidos, um peptídeo intermediário com 28 resíduos de aminoácidos e o peptídeo maduro composto por 71 resíduos de aminoácidos. Escoubas e Rash, em 2004, caracterizaram o perfil molecular de peptídeos presentes no veneno de 55 tarântulas utilizando espectrometria de massa MALDI-TOF e encontraram uma distribuição bimodal de massa molecular, com peptídeos pertencentes à classe central, com massa molecular entre 3000-5500 Da e
54 com peptídeos pertencentes à classe secundária, com massa molecular entre 6500-7000 Da (Escoubas et al., 2004). De acordo com o perfil de massa molecular descrito por Escoubas e Rash, a LTx5 pertence à classe secundária de peptídeos encontrados no veneno de tarântulas, representando os peptídeos longos, formados por cadeias maiores de aminoácidos e estabilizados por várias pontes dissulfeto.
A manipulação genética de linhagens hospedeiras de Escherichia coli e
Saccharomyces cerevisiae permite a expressão heteróloga de proteínas de interesse em
larga escala, facilitando o estudo de genes, seja de interesse farmacológico, seja de interesse comercial, ou de interesse terapêutico (Huang et al., 2008). Diversos atrativos tornam as Saccharomyces cerevisiae um excelente modelo para expressão de proteínas heterólogas, uma vez que seguem o padrão geral de modificações pós traducionais de organismos eucariotos, apresentando correta formação de pontes dissulfeto, glicosilação, e alterações em aminoácidos, como fosforilação e acetilação, possibilitando maior atividade e estabilidade à proteína de interesse, quando comparadas com a expressão em sistema procarioto (Gellissen et al., 1992).
Em nosso trabalho, o gene codificante para a toxina madura LTx5 foi amplificado por PCR e inserido no vetor pYES2.1/V5-His-TOPO® (Invitrogen) para expressão da proteína utilizando células de Saccharomyces cerevisiae (W303-1A). O sistema TOPO® utilizado em nosso trabalho, inclui um vetor linearizado com uma timina (T) livre nas extremidades 5’ de ambas as fita do DNA. Em uma reação de PCR, a Taq polimerase insere uma deoxiadenosina (A) nas extremidades 3’ do produto de PCR, facilitando a ligação do gene ao vetor. O gene de interesse foi inserido no vetor TOPO em fusão com um V5 epitope e uma cauda de poli histidina (His6) em sua porção
C-terminal para facilitar a detecção e purificação da proteína recombinante. O vetor possui um sítio de origem de replicação bacteriano e um gene de resistência à ampicilina para seleção das células de E. coli transformadas. A seleção das células de levedura é feita pelo gene marcador URA3, que seleciona as células que expressam o aminoácido uracila em meio sem a presença deste aminoácido. Após transformarmos células de Escherichia coli TOP10F’ com a construção pYES2.1/V5-His-TOPO-LTx5, a eficiência da clonagem foi confirmada por PCR de colônias e cortes do DNA plasmidial com endonucleases de restrição. Após confirmarmos a clonagem, realizamos
55 o sequenciamento de ambas as fitas do DNA plasmidial, e verificamos que a sequencia codificante para a LTx5 estava inserida no frame correto. Procedemos então a expressão da proteína recombinante. A indução da proteína recombinante neste sistema de expressão é controlada pelo promotor GAL1 que é reprimido na presença de glicose (West, Jr. et al., 1984) e induzido quando é fornecido galactose como fonte de carbono às células (Giniger et al., 1985). Inicialmente, as células de S. cerevisiae W303-1A transformadas com a construção contendo a sequencia codificante para a LTx5 foram crescidas em meio seletivo SD-URA contendo glicose, e então transferidas para novo meio de cultura contendo rafinose como fonte de carbono, uma vez que, na presença de rafinose, o promotor GAL1 não está reprimido e nem induzido, o que possibilita uma expressão mais rápida da proteína recombinante após a adição de galactose ao meio de cultura. O processo de indução inicialmente foi realizado conforme recomendações do fabricante do sistema de expressão, que sugere trabalhar com 2% de galactose para expressão da proteína e com densidade ótica entre 0.4 e 0.6 no momento da indução (tempo 0h). Os resultados obtidos do perfil eletroforético dos diferentes tempos de indução, não mostraram indução da proteína com massa molecular de 11.8 kDa, como seria esperado. Para a detecção da proteína recombinante LTx5 em ensaios de Dot Blotting, inicialmente foram utilizados 30 µg de proteína total. Entretanto, a detecção da LTx5 recombinante induzida com 2% de galactose só foi possível quando utilizamos 100 µg de proteína total para sensibilizar a membrana de nitrocelulose. Procedemos então com um novo processo de indução, utilizando 4% de galactose e iniciando a expressão com uma densidade ótica 10 vezes maior do que a recomendada pelo fabricante (entre 4 e 6), no intuito de obter um melhor nível de expressão. O perfil eletroforético dos diferentes tempos de expressão da proteína recombinante nestas condições, sugere a expressão de uma proteína com massa aparente de 11.8 kDa, sobretudo, a partir de 36 horas de indução. Nesta condição, identificamos uma expressão basal (tempo 0h) da proteína LTx5 em ensaio de Dot Blot, uma vez que o promotor GAL1 não está reprimido, devido ao fato das células terem sido cultivadas em meio contendo rafinose como fonte de carbono.
Com o objetivo de purificar e caracterizar a LTx5 recombinante, inicialmente, as células foram lisadas utilizando pérolas de vidro e/ou ruptura por ultra som, em tampões contendo inibidores de proteases. Inibidores de metaloproteases, como EGTA e EDTA,
56 que possivelmente nos trariam problemas no processo de purificação por afinidade à resina de Ni-NTA não foram utilizados. Na expectativa de melhorar o rendimento na extração protéica, optamos por utilizar um tampão de extração de proteínas de células de leveduras, conforme descrito no item 3.16. Obtivemos aproximadamente o dobro de rendimento protéico na extração das proteínas totais, entretanto, a alta concentração iônica do tampão utilizado (cerca de 250 mM) tornou necessária a diálise das amostras antes de procedermos com as análises do perfil protéico em eletroforese.
Para análise eletroforética do perfil protéico dos diferentes tempos de indução, utilizamos o método clássico de eletroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes (SDS-PAGE), descrito por Laemmli. Entretanto, a visualização de proteínas com baixa massa molecular (<10 kDa) não estava sendo eficiente nas condições experimentais estabelecidas. Utilizamos então o método de SDS-PAGE proposto por Schagger e colaboradores, que utiliza tampão contendo tris e tricina, o que possibilitaria uma melhor visualização de proteínas abaixo de 30 kDa (Schagger et al., 1987). Este método se mostrou mais eficiente para visualização das proteínas de baixa massa molecular.
Com o intuito de identificar a proteína recombinante por imunoblotting, utilizamos 100 µg de extrato protéico proveniente da cultura com 60 horas de indução em 4% de galactose em um ensaio de Western Blotting. Apenas o padrão de proteínas recombinante com cauda de histidina reagiu à imunodetecção. A possibilidade de perda de proteínas com baixa massa molecular no momento da transferência foi descartada utilizando-se de duas membranas sobrepostas na transferência das proteínas e testando tempos menores de transferência (30 a 60 minutos). Para avaliar se o tratamento de desnaturação ao qual as amostras protéicas são submetidas na eletroforese poderia estar influenciando na ligação antígeno-anticorpo, procedemos um Dot Blotting nas mesmas condições desnaturantes de um Western Blotting. O resultado nos mostrou que, as condições em que os extratos protéicos foram submetidos (tratamento com tampão da amostra contendo agente redutor, SDS e alta temperatura) interferiram no reconhecimento da proteína recombinante pelo anticorpo anti His-Tag. Dimitriadis relata que a ligação antígeno-anticorpo, na presença do detergente iônico SDS em concentrações acima de 0.2%, é inibida em até 90%, enquanto que a ação de detergentes não-iônicos não interfere nesta ligação (Dimitriadis, 1979). Visando investigar se o SDS
57 estaria interferindo na ligação do anticorpo com a cauda de histidina da proteína recombinante, procedemos com novos ensaios de imunoblotting (Dot e Western Blot), submetendo os extratos protéicos a tratamento com tampão da amostra 1X e desnaturação a 95°C, e lavando as membranas com solução contendo 2.5% de Triton-X 100 por 2 horas, antes da incubação com solução de bloqueio, na expectativa de retirar o SDS das amostras. Os resultados obtidos nos sugerem que o tratamento ao qual as amostras protéicas foram submetidas (SDS, agentes redutores e alta temperatura) impediu o reconhecimento da cauda de histidina pelo anticorpo anti His-Tag.
A expressão de proteínas recombinantes em fusão com caudas de afinidade é uma ferramenta útil para a detecção e purificação de proteínas. A cauda de poli histidina (His6) está entre as caudas de afinidade mais utilizadas na expressão de proteínas
recombinantes (Debeljak et al., 2006; Lichty et al., 2005). A purificação de proteínas por afinidade se baseia na interação de determinados resíduos de aminoácidos por íons metálicos imobilizados em um suporte sólido (Porath, 1992). A estratégia de utilização de caudas de histidina nas extremidades N-terminal e C-terminal para facilitar a purificação de proteínas de interesse expressas em diferentes sistemas como, bactérias (Liu et al., 2009; Kwon et al., 2005), leveduras (Wetterholm et al., 2008; Lanfermeijer
et al., 1998), células de mamíferos (Janknecht et al., 1992) e células de insetos
(Andersen, 2004), vem sendo empregada com sucesso. Embora universalmente aplicável, a purificação de proteínas com cauda de His6 apresenta limitações,
especialmente a ligação não específica de proteínas ricas em resíduos de cisteína e histidina (Westra et al., 2001). Com o intuito de purificar a proteína recombinante LTx5 contendo a cauda de histidina, realizamos uma cromatografia de afinidade utilizando uma resina acoplada ao ácido nitrilotriacético (NTA) carregada com íons níquel (Ni2+).
O extrato total do melhor tempo de indução (60 horas) em 4% de galactose foi incubado com a resina e as eluições foram feitas em tampão com concentrações crescentes do quelante imidazol. Não obtivemos sucesso neste processo de purificação, principalmente devido à ligação inespecífica de proteínas da levedura à resina Ni-NTA e à baixa concentração da proteína alvo no extrato protéico. Realizamos então novas etapas de purificação, no intuito de enriquecer o extrato protéico com a proteína LTx5, antes de submetê-la à nova cromatografia de afinidade. Obtivemos sucesso na separação das proteínas nos dois métodos cromatográficos testados (dados não mostrados),
58 entretanto, não foi possível identificar a proteína alvo em ensaios de Dot Blot, devido ao baixo nível de expressão da proteína recombinante neste sistema de expressão.
As caudas de afinidade podem trazer efeitos positivos nas propriedades bioquímicas da proteína alvo. A literatura nos relata que caudas de afinidades podem melhorar a expressão da proteína (Rajan et al., 1998; Sun et al., 2005), evitar proteólise (Tang et al., 1997), facilitar a renaturação da proteína (Kou et al., 2007) e aumentar a solubilidade da proteína (Chen et al., 2005; Dyson et al., 2004; Hammarstrom et al., 2002; Nallamsetty et al., 2006). Por outro lado, a inserção de uma cauda de afinidade pode trazer efeitos negativos à proteína alvo, como mudanças na conformação (Chant et al., 2005), afetar negativamente a expressão (Goel et al., 2000), inibir a atividade enzimática (Kim et al., 2001; Cadel et al., 2004), alterar a atividade biológica (Fonda et al., 2002; Halliwell et al., 2001) e conferir toxicidade à proteína (de Vries et al., 2003).
Diversos trabalhos relatam dificuldades na expressão de proteínas recombinantes com cauda de histidina na porção C-terminal da proteína alvo. No entanto, a decisão sobre qual o melhor posicionamento da cauda de afinidade depende da sequencia primária e de conhecimento prévio a respeito da conformação da proteína a ser estudada (Goel et al., 2000).
A maioria dos aminoácidos são codificados por mais de um códon. Entretanto, a utilização de códons raros para transcrição de certos aminoácidos, como arginina (AGA, AGG, CGG e CGA), isoleucina (AUA), leucina (CUA), glicina (GGA) e prolina (CCC), pode diminuir o rendimento de expressão de proteínas heterólogas, devido a baixa disponibilidade de tRNA para a transcrição dos respectivos códons (Kurland et al., 1996; Kurland, 1991). Dados da literatura nos mostram que o uso freqüente de códons raros codificando para o aminoácido arginina, pode trazer graves efeitos no rendimento da expressão de proteínas heterólogas, e o impacto parece ser maior quando estes códons aparecem consecutivamente e presentes junto à extremidade N-terminal da proteína (Brinkmann et al., 1989; Calderone et al., 1996; Hua et al., 1994; Schenk et al., 1995; Zahn, 1996). A proteína recombinante LTx5 possui 105 aminoácidos, e apresenta 8 códons raros em sua sequencia de nucleotídeos, sendo que quatro códons raros codificam para o aminoácido arginina, um códon raro codifica para o aminoácido isoleucina e três códons raros codificam para o aminoácido glicina, sendo que, sete destes códons estão presentes na toxina madura, portanto, mais próximos à extremidade
59 N-terminal da proteína, o que possivelmente afeta a expressão da proteína LTx5. Diversos trabalhos mostram que o rendimento na expressão de proteínas heterólogas pode ser aumentado, quando códons raros são trocados por códons mais freqüentes na população de tRNA (Brinkmann et al., 1989; Rosenberg et al., 1993; Seidel et al., 1992).
Geralmente o processo de indução de proteínas heterólogas causa um estresse às células de levedura devido às interferências metabólicas causadas pelas condições desfavoráveis ao seu crescimento, o que possivelmente traz efeitos negativos ao processo de produção da proteína de interesse (Mattanovich et al., 2004). Embora a
Saccharomyces cerevisiae seja utilizada como modelo de diferentes estudos
fisiológicos, devido à abundância de informações disponíveis a respeito da sua genética e fisiologia, outros microorganismos se mostram mais eficientes para a expressão de proteínas heterólogas (Mattanovich et al., 2004)
60 6. CONCLUSÕES.
Diante das evidências experimentais obtidas neste trabalho, concluímos que:
• O procedimento de clonagem da sequencia codificante para a toxina madura no vetor de expressão eucarioto pYES2.1/V5-His-TOPO® foi realizado com sucesso;
• A expressão da proteína recombinante LTx5 é mais eficiente quando se utiliza galactose em concentração 4% (p/v) e quando o pré-cultivo ocorre em meio contendo rafinose;
• A imunodetecção da proteína recombinante só foi possível em condições nativas (Dot Blot);
• O baixo rendimento de expressão da proteína recombinante neste sistema de expressão impossibilita sua purificação.
61 7. COMENTÁRIOS FINAIS.
Embora na literatura científica haja relatos de sucesso na obtenção de proteínas heterólogas utilizando organismos eucariotos para expressão do peptídeo alvo, a expressão da toxina recombinante LTx5 utilizando o sistema pYES2.1/V5-HIS-TOPO® e células de Saccharomyces cerevisiae W303-1A não foi obtida em rendimento satisfatório para a sua purificação. Sugerimos assim, que os estudos futuros com este peptídeo sejam realizados utilizando sistema procarioto para expressão heteróloga em células de Escherichia coli, uma vez que este tipo de sistema já vem sendo empregado com sucesso na literatura.
62 8. BIBLIOGRAFIA.
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