Análises das Amostras para Acompanhamento do Crescimento Celular e Produção de PGA por B megaterium

Inicialmente, as amostras retiradas em intervalos definidos de tempo de cultivo eram avaliadas com respeito ao crescimento celular. Em seguida, a análise das amostras para acompanhamento da produção de enzima e consumo dos substratos iniciava-se pela separação do microrganismo do meio de cultura, através de centrifugação a 4ºC e 11000 rpm por 20 minutos. Os sobrenadantes obtidos da centrifugação eram utilizados para quantificação da atividade enzimática, determinação da concentração de proteínas, lactose, aminoácidos, fenilacetato de potássio e sulfato de amônia.

3.9.1. Determinação da Concentração Celular

A concentração de células foi acompanhada através de medidas de densidade ótica a 600 nm, das amostras coletadas em caldos fermentativos, convenientemente diluídas (FD) em uma solução salina NaCl 0,8 % p/v, de modo que o valor da absorbância fosse inferior a 0,6. A concentração celular expressa em grama de célula seca por litro, foi determinada pela curva de calibração, equação 3.1, obtida através da relação entre concentração de células secas em função da densidade ótica:

Cx (gcélula seca/L) = (0,3 * D.O600nm) * Fdiluição (3.1)

Onde:

Cx =Concentração celular;

D.O600 nm. = Densidade ótica a 600 nm;

Fdiluição = Fator de diluição.

3.9.2. Contagem de Esporos e células vegetativas – Método TCID50

Este método, descrito originalmente por Reed e Muench, 1938, permite determinar um título viral em doses infecciosas 50% em cultura de tecidos (TCID50). O

TCID50 é o inverso da diluição da suspensão viral que infecta 50% das culturas de células

(diluição limite de 50%). A diluição limite 50% é determinada pela interpolação das freqüências cumulativas de respostas positivas e negativas que ocorram numa diluição viral

para a qual se antecipe 50% de respostas positivas e 50% de respostas negativas. Uma vez que este último resultado deverá ocorrer entre as diluições virais em que se observem 100% de resultados negativos e 100% de resultados positivos, é fundamental que se analise uma gama de diluições virais que inclua os resultados extremos (100% de resultados positivos e 100% de resultados negativos).

O método TCID50 pode ser aplicado à contagem de bactérias, sendo a

concentração dada diretamente pelo TCID50. Neste caso utilizam-se placas de 96 poços, de

acordo com o procedimento seguinte:

1. Preparação das placas de 96 poços (ver exemplo no Anexo 1):

a. Colocar em cada um dos poços a2 a a? da linha a, 180 µL de meio de cultura apropriado. Neste estudou-se, utilizou o meio líquido LB, cuja composição foi previamente descrita na Tabela 3.4. O número de poços deverá ser igual ao número de diluições preliminares

b. Colocar em cada um dos poços b a g das colunas 1 a 11 180 µL de meio de cultura apropriado;

2. Preparação das diluições:

a. Colocar no poço a1 a amostra a titular: alíquotas de caldos fermentados retiradas en intervalos definidos de tempo de cultivo;

b. Retirar 20 µL do poço a1 e colocar no poço a2. Homogenizar a amostra utilizando a micropipeta;

c. Trocar a ponta da micropipeta, e repetir o passo anterior nos poços da linha a até uma diluição antes da primeira diluição a colocar nos poços teste.

d. Trocar a ponta da micropipeta e retirar 20 µL do último poço das diluições preliminares (a?) e colocar no poço b1. Homogenizar a amostra utilizando a micropipeta;

e. Trocar a ponta da micropipeta, e retirar 20 µL do poço b1 e colocar no poço c1. Homogenizar a amostra utilizando a micropipeta;

f. Repetir o passo anterior até concluir todas as diluições requeridas. 3. Inoculação dos poços teste:

a. Com uma pipeta multicanal, retirar 10 µL de cada uma das diluições dos poços b1 a g1, e colocar nos poços b2 a g2;

b. Repetir o passo anterior e inocular sucessivamente os poços das colunas seguintes

4. Incubação da placa

Incubar a placa pelo período de tempo apropriado, à temperatura ótima de crescimento do microrganismo.

5. Contagem

Contar o número de poços contaminados e não contaminados em cada uma das diluições. Os poços contaminados são normalmente diferenciados dos não contaminados a olho nu desde que o tempo de incubação seja suficiente, visto apresentarem turbidez. Para as amostras de caldos fermentados, as placas permaneceram incubadas por 48 horas a 30ºC.

6. Cálculo do título

O TCID50 é utilizado para determinação do título. Para contagens de bactérias

o valor do TCID50/mL, corresponde à concentração de células por mL Em termos matemáticos a diluição limite 50% é dada por:

log10 (diluição limite 50%)= log10 (diluição imediatamente > 50%) + (-PD) (3.2)

PD é a distancia proporcional entre as duas diluições em que se esperaria encontrar 50% de respostas positivas. Esta distância é inferida por interpolação linear de acordo com a seguinte fórmula:

PD= ((% positivos imediatamente >50%) - 50%)/

((%positivos imediatamente > 50%) - % positivos imediatamente < 50%)

(3.3)

O recíproco desta diluição corresponde ao título viral em número de doses infecciosas (TCID50) por unidade de inóculo.

Diluição limite 50%= 10(log10(diluição imediatamente >50%) + (-PD)) (3.4)

O título viral em termos de TCID50 é dado por:

TCID50=1

Diluição limite50%

(3.5)

TCID50=1 * 1

mL Diluição limite50% V

(3.6)

Onde V é o volume de amostra aplicada em cada ensaio (mL).

3.9.3. Determinação da Atividade Enzimática – Método PDAB

O método consiste em determinar a atividade amidase da PGA utilizando o reagente p-dimetilamino benzaldeído (PDAB) de acordo com o protocolo proposto por Balashingham et al., 1972. O grupo amino presente no ácido 6-amino penicilânico (6-APA) produzido na reação de hidrólise da penicilina G catalisada pela PGA, reage com o grupo aldeído presente no PDAB, gerando um produto colorido que foi acompanhado espectrofotometricamente em um comprimento de onda de 415 nm. A leitura foi relacionada à concentração de 6-APA por meio de uma curva de calibração obtida com soluções padrões de 6-APA com concentrações na faixa de 200-1000 µg/mL.

Uma unidade internacional (UI) foi definida como a quantidade de enzima que catalisa a formação de 1 µmol de 6-APA por minuto, na hidrólise de penicilina G potássica a 37ºC e pH 8,0.

Em um reator encamisado, com capacidade para 50 mL, com temperatura conrolada em 37ºC por meio de banho termostatizado, colocou-se um volume conhecido de penicilina G 4% p/v, dissolvida em tampão fosfato 0,1 M e pH 8,0. Ao estabilizar a temperatura, adicionou-se, sob agitação, o caldo enzimático. Tomaram-se alíquotas de 0,5 mL em diferentes tempos de reação, as quais foram adicionadas em cubetas previamente preparadas com o reagente PDAB (0,5 mL de PDAB 0,5% p/v diluído em metanol; 1,0 mL de hidróxido de sódio 0,05 M e 2,0 mL de ácido acético 20% v/v), após reagir por 2,5 minutos, tomava-se a medida da absorbância.