Determinação da Concentração de Glicose – Método Enzimático

O método enzimático para determinação da concentração de glicose é bastante sensível e específico. Gera pouco volume de resíduo e é de baixa complexidade.

O fundamento é simples. Tem-se um reativo de trabalho onde estão as enzimas glicose oxidase e a peroxidase. A glicose foi determinada após a oxidação enzimática na presença de glicose oxidase. O peróxido de hidrogênio formado reagia sob catalise da peroxidase com fenol e 4-aminofenazona originando a quinimina que é um cromógeno vermelho-violeta. A absorção era proporcional à concentração de glicose na amostra.

Glicose + O2→ ácido glucônico + H2O2

Adicionava-se 2,0 mL do reativo de trabalho, descrito no protocolo do fabricante, em um tubo de ensaio com 20 µL da amostra contendo glicose, adequadamente diluída, de modo que a concentração de glicose esteja em torno de 3,0 g/L. Incubou-se o tubo por 10 minutos a 37ºC. Após a reação, a amostra aparentava um aspecto rosada que tende a se intensificar com a concentração de glicose. A leitura da absorbância era realizada a 505 nm.

3.11.4. Determinação da Concentração de Aminoácidos

A concentração de aminoácidos foi determinada pelo método Pico-tag descrito por Cohen et al., 1989. Esta metodologia baseia-se na separação por cromatografia de fase reversa, utilizando pré-coluna para derivatização das amostras. O reagente de derivatização consistia de uma solução de etanol, trietilamina, fenil-isotiocianato e água na proporção 7:1:1:1. A separação utilizava como eluentes acetato de sódio tri-hidratado a pH 6,4 – fase móvel A e acetonitrila 60% v/v – fase móvel B, eluindo a uma vazão de 1,0 mL/min.

3.11.5. Determinação da Concentração de Proteínas

3.11.5.1. Método de Lowry

As concentrações de proteínas foram avaliadas quantitativamente segundo o método modificado de Lowry (Hartree, 1972).

Este método baseia-se na reação do cobre com a proteína, em meio alcalino, e posteriormente redução do reagente de fosfomolibdato-fosfotungstenato no reagente folin. Quando o reagente folin é adicionado à proteína tratada com o cobre, ocorre a redução do reagente folin que resulta em uma cor mais intensa, com absorção máxima em 660 nm. A concentração de proteínas é determinada através de uma curva padrão previamente construída para a soroalbumina bovina, com concentrações na faixa de 0,2-0,8 g/L.

Em tubos de ensaios, adicionou-se 1 mL de amostra e 5 mL de solução contendo Na2CO3 2% p/v em NaOH 0,1 N, CuSO4 1% p/v em água destilada e tartarato de

sódio potássico 1% p/v em água destilada. Esperava-se 15 minutos e adicionava-se 0,5 mL do reagente Folin Ciocalteau diluído na proporção de 1:2 na hora do uso. Após 30 minutos lia-se a absorbância em espectrofotômetro à 660nm.

3.11.5.2. Método de Bradford

Este método é baseado na interação entre o corante BG-250 e macromoléculas de proteínas que contém aminoácidos de cadeias laterais básicas ou aromáticas. No pH de reação, a interação entre a proteína de alto massa molecular e o corante BG-250 provoca o deslocamento do equilíbrio do corante para a forma aniônica, que absorve fortemente em 595 nm.

O procedimento utilizado corresponde ao método descrito por Bradford, 1976. O reativo foi preparado dissolvendo-se 100 miligramas de Coomassie Brilliant Blue G 250 em 50 mL de etanol e 95% v/v sob vigorosa agitação. A esta solução adicionavam-se 100 mL de ácido fosfórico a 85% p/v, diluindo-se em balão volumétrico até 1,0 L com água destilada. Esta solução era filtrada sob vácuo em sistema Millipore com papel de fitlro Wathman 113, e armazenada em frascos na geladeira, permanecendo estável por duas a três semanas.

Em tubos de ensaios, adicionavam-se 5 mL do reativo e 100 µL da amostra. A amostra era convenientemente diluída quando necessário, de forma que a concentração de proteína total não ultrapasse a 660 mg/L. Agitava-se em vórtice, deixando-se em repouso por 5 minutos. Fazia-se a leitura da absorbância das amostras em espectrofotômetro no comprimento de onda de 595 nm.

3.11.5.3. Distribuição de Massas Moleculares

As concentrações de proteínas e peptídeos foram determinadas via cromatografia por exclusão de tamanho em HPLC Shimadzu utilizando-se coluna Superdex Peptide 10/300 GL:100-7000 Da (GE Biosciences) como fase estacionária e como fase móvel, tampão fosfato sódico 0,02 M pH 7,2, contendo 0,25 M de NaCl, a uma vazão de 0,25 mL/min. O volume de amostras injetado na coluna de peptídeos era de 25 µL, sendo a detecção feita no UV a 214 nm.

Para isto foi necessário definir procedimentos de calibração, utilizando padrões adequados, para que se pudesse obter a distribuição mássica de peptídeos para cada amostra considerada, foram injetados cinco padrões (dois peptídeos e 3 proteínas) para que se pudesse relacionar a massa molecular de peptídeos com o tempo de retenção na coluna. A Tabela 3.5 apresenta os padrões utilizados para a calibração do método, com suas respectivas massas moleculares e tempo de retenção na coluna utilizada.

Tabela 3.5: Padrões utilizados para a calibração da coluna Superdex Peptide 10/300 GL:100-7000 Da

utilizada na distribuição de massas moleculares

Amostra Padrão Massa Molecular (Da) Tempo de Retenção (min)

Leucine (peptídeo) 555,6 78,2

Neurotensin (peptídeo) 1672,9 57,3

Insulina 5807,6 43,8

α-Lactalbumina 14146,0 37,6

Soro Albumina Bovina 67000,0 30,4

Estabeleceu-se, em seguida, uma curva de calibração (área versus concentração mássica) para cada um dos padrões. Estes pontos experimentais foram ajustados a uma reta para determinar os coeficientes angulares para cada caso. Logo, foi levantada a curva de tempo de retenção (TR) médio versus coeficientes angulares, mostrada na Figura 3.2, onde foi observando que os pontos se ajustaram a uma reta.

Obteve-se, então, uma equação geral que correlaciona concentração mássica (g/L) à área no cromatograma (volts versus min) em função do tempo de retenção da proteína na coluna. C= (1,55001x10-8 – 1,00495x10-10 x tempo) x área (3.7) 30 40 50 60 70 80 7,0x10-9 8,0x10-9 9,0x10-9 1,0x10-8 1,1x10-8 1,2x10-8 1,3x10-8 Y=1,55001x10-8 -1,00495x10-10 *X R = 0,986 C o ef icie nt e An g u la r ( g /( L V min ))

Tempo de Retenção (min)

B

TR Vs Coeficiente Angular

Figura 3.2: Ajuste linear dos coeficientes angulares em função do tempo de retenção médio para cada

3.11.6. Determinação da Concentração de Sulfato de Amônio – Método de Kjeldahl

A concentração de sulfato de amônio presente nas amostras de fermentação foi determinada pelo método de Kjeldahl, seguindo o protocolo estabelecido no boletim técnico da Micronal, 1985. Nesses ensaios utilizava-se uma unidade de destilação de amônia, onde todo nitrogênio presente na amostra era quantificado.

Para a destilação das amostras, em erlenmeyers contendo 100 mL de solução de ácido ácido bórico 2% v/v foram adicionadas 3 gotas de indicador misto, sendo então os erlenmeyers posicionados na unidade de destilação juntamente com os tubos contendo as amostras de interesse. A estes tubos, adicionava-se 30 mL de água destilada e solução de NaOH p/v até que fosse atingida uma coloração marrom escuro. A partir daí, as amostras eram destiladas por um período de sete minutos. Posteriormente, o destilado coletado no erlenmeyer era submetido à etapa de titulação. Nessa etapa, o conteúdo dos erlenmeyers era titulado com HCl padronizado na concentração de 0,1 N. A concentração de sulfato de amônia presente nas amostras era quantificada através da seguinte equação:

CN (g/L) = VHCl * CHCl * 14 Vamostra

(3.8)

Onde:

CN = concentração de nitrogênio total (g/L)

VHCl = volume de ácido gasto na titulação (mL)

CHCl = concentraçãodo ácido usado na titulação (N)

14 = massa molecular do nitrogênio (g/mol)

Vamostra = volume da amostra analisada (mL)