Influência da Concentração de Oxigênio Dissolvido na Produção de PGA com a Nova Linhagem de B megaterium

A Tabela 4.33 apresenta as diferentes estratégias utilizadas para o estudo da influência da concentração de oxigênio no cultivo da nova linhagem de B. megaterium. As composições dos meios suplementares estão descritas na discussão de cada ensaio.

Tabela 4.33: Descrição resumida dos ensaios realizados em biorreator de bancada para estudos da

influência do oxigênio dissolvido na produção de PGA por B. megaterium 2 conservado em meio

sólido a 4oC – “slants”. Ensaio Concentração de Oxigênio Dissolvido (% saturação) Velocidade de Agitação (rpm) Meio de Produção 1 20 – 5 após 9 horas de cultivo Variável Padrão pHinicial= 7,0 2 20% Variável Padrão pHinicial= 7,0 3 Variável 300 Padrão pHinicial= 7,0

Adição de 1 pulso de alimentação

4 10 Variável Padrão

pHinicial= 7,0

5 10 Variável

Padrão

pHinicial= 7,0

Adição de 3 pulsos de alimentação

6 5 – 10 após 17 horas de

cultivo Variável

Padrão

pHinicial= 7,0

Adição de 5 pulsos de alimentação

As condições de processo fixadas para todos os ensaios em biorreator de 2,0 L com meio de cultivo padrão foram: aeração com 1,0 vvm, temperatura mantida a 30°C e ausência de controle de pH, ajustado inicialmente no valor de 7,0, diferentemente dos ensaios com a linhagem tradicional, cujo cultivo iniciava-se a pH 8,0.

Paralelamente a cada cultivo realizado em biorreator foi feito um ensaio em shaker – com temperatura controlada em 30°C e agitação de 300 rpm - para verificar se haveria diferença na produção de PGA entre esses dois modos e também, para se ter um controle do nível máximo da atividade enzimática e da variabilidade do inóculo. Ressaltando que as concentrações celulares atingidas na etapa de inóculo de todos os experimentos realizados em biorreator atingiram 2,80 ± 0,05 g/L de células após 24 horas de incubação.

As evoluções do crescimento do microrganismo e produção da enzima para cada diferente concentração de oxigênio dissolvido estudada estão ilustradas individualmente nas Figuras e Tabelas apresentadas no Anexo 4.

A seguir a Figura 4.14 A e B apresenta um comparativo entre os ensaios realizados em biorreator para investigar a influência das diferentes concentrações de oxigênio dissolvido na produção da enzima (A) e crescimento do microrganismo (B), partindo de células dormentes da nova linhagem de B. megaterium conservadas em meio sólido a 4oC.

0 5 10 15 20 25 -50 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 Ensaio 6 - 5% OD Ensaio 5 - 10% OD Ensaio 4 - 10% OD Ensaio 3 - 300 rpm Ensaio 1 - 20% OD/ 5% OD AE (U I/ L ) Tempo (h) Ensaio 2 - 20% OD (A)

0 5 10 15 20 25 0 1 2 3 4 5 6 Ensaio 6 - 5% OD Ensaio 5 - 10% OD Ensaio 4 - 10% OD Ensaio 3 - 300 rpm Ensaio 1 - 20% OD/ 5% OD Ensaio 2 - 20% OD C x (g/ L ) Tempo (h) (B)

Figura 4.14: Comparação entre os ensaios em biorreator a diferentes concentrações de oxigênio

dissolvido e inoculados com esporos da nova linhagem de B. megaterium conservadas em meio sólido

a 4oC – (A) Valores de atividade enzimática (AE) e (B) concentração celular (Cx).

Limitar a concentração de oxigênio dissolvido de 20 para 5% da saturação, Ensaio 1, havia se mostrado como a melhor estratégia no trabalho de Visnardi, 1997, contudo, para a nova linhagem de B. megaterium, embora se tenha uma massa celular pronunciada, com pico de 4,29 g/L e velocidade específica de crescimento de 0,34 h-1, essa condição conduziu a concentração de enzima inferior à dos frascos agitados, alcançando 217 UI/L, apenas 66% do valor obtido em câmara rotativa, 331 UI/L. A atividade específica máxima para este ensaio foi de 54,0 UI/gcélula.

Para o ensaio com manutenção da concentração de oxigênio dissolvido em 20 % da saturação durante todo cultivo, Ensaio 2, novamente observa-se que a máxima concentração de enzima em frascos agitados, 427 UI/L, foi maior que a máxima atividade enzimática alcançada em biorreator, 212 UI/L. No entanto, o crescimento celular parece ter sido favorecido nessa condição, atingindo 5,27 g/L com células crescendo a uma velocidade específica de 0,32 h-1 e máxima atividade específica ainda menor se comparada ao ensaio anterior, 43,09 UI/gcélula.

Uma vez que a maior produção de enzima vinha sendo observada em frascos agitados, decidiu-se reproduzir em biorreator a condição de agitação fixada em mesa incubadora, velocidade de agitação controlada em 300 rpm, Ensaio 3. Analisando-se os resultados até 24 horas (momento em que foi adicionado o pulso de nutrientes), verifica-se uma velocidade específica de crescimento igual a 0,24 h-1 com uma concentração celular máxima igual a 4,20 g/L em 24 horas de cultivo, e um pico de atividade enzimática, 223 UI/L, em 22 horas. Após 24 horas de cultivo, observa-se uma pequena queda nos níveis de atividade enzimática, o que poderia estar sendo causada pelo esgotamento de algum nutriente no meio. Optou-se, então, por adicionar 300 mL de um meio suplementar na forma de pulso, cuja composição era semelhante à do meio de produção. Após a suplementação do cultivo ocorre um pico na atividade da enzima, chegando a 247 UI/L, mas ainda não alcançando a produção em frascos agitados, 407 UI/L. A adição de nutrientes na forma de pulso conduziu a um aumento na atividade específica máxima, passando de 54,26 UI/gcélula para 64,80 UI/gcélula.

A observação da Figura 4.14 (A) mostra que nos cultivos com oxigênio dissolvido em 10% da saturação, Ensaios 4 e 5, a produção da PGA foi a mais elevada comparando-se todas as concentrações estudadas, chegando em torno de 450 e 360 UI/L, respectivamente. Além disso, a concentração de enzima em biorreator, alcançou valores semelhantes ou superiores aos obtidos em ensaios padrão em frascos agitados. Essa estratégia parece assim ser a mais adequada para promover um crescimento satisfatório do microrganismo, a uma velocidade específica de 0,26 h-1, e conduzir no Ensaio 5 a uma atividade específica de 98,90 UI/gcélula, a mais alta produtividade da enzima obtida nesse

estudo.

Além de confirmar os resultados do Ensaio 4, no Ensaio 5 investigou-se também a adição de pulsos de alimentação, de forma a acrescentar possíveis nutrientes esgotados no decorrer do cultivo. Esses pulsos tinham composição e concentração semelhante ao meio inicial de produção e foram adicionados em três etapas de 100 mL a 24, 30 e 40 horas de cultivo. A suplementação era feita quando se observava uma queda na concentração celular, sinal que algum nutriente importante para o crescimento do microrganismo havia se exaurido. O efeito da adição de pulso sobre o crescimento do microrganismo e produção da enzima está ilustrado no Anexo 5a. A estratégia mostrou-se bastante eficiente, pois a cada pulso adicionado houve uma elevação nos níveis de crescimento celular e atividade enzimática, que permaneceram praticamente constantes, em torno de 490 UI/L, em 42 horas de cultivo.

Limitando-se a concentração de oxigênio dissolvido em 5% de saturação, Ensaio 6, provocou-se uma restrição no crescimento do microrganismo, com células crescendo a uma velocidade de 0,12 h-1, enquanto que a velocidade de crescimento característica de Bacillus megaterium 2 é em torno de 0,30 h-1. A observação da Figura 4.14 (B) mostra que após 12 horas de cultivo, os níveis de crescimento celular diminuem após alcançarem apenas 2,42 g/L, enquanto se esperava uma concentração de células em torno de 3,50 g/L, tal como nos demais ensaios. A produção da enzima foi também afetada negativamente por essa limitação. A concentração de oxigênio dissolvido foi então aumentada para 10% da saturação após 17 horas de cultivo, conduzindo a uma retomada no crescimento celular, chegando 4,34 g/L de células e 202 UI/L de enzimas. Essa menor produção quando comparada ao ensaio com manutenção da concentração de oxigênio em 10% da saturação desde o início do cultivo, mostra que embora do ponto de vista do crescimento do microrganismo tenha ocorrido apenas um pequeno atraso, houve uma perda irrecuperável na síntese e expressão da enzima com a limitação de oxigênio em 5% da saturação. A adição de pulsos foi também investigada nesse ensaio como uma tentativa de favorecer a produção da PGA. Foram adicionados cinco pulsos, sendo que os quatro primeiros, de 100 mL, tinham composição e concentração iguais ao meio de produção inicial e foram adicionados em 30, 42, 50 e 54 horas de cultivo. O último pulso, de 300 mL, por sua vez, era composto por 2,0 g/L de sulfato de amônio e 3,5g/L de fenilacetato de potássio, adicionada ao meio após 56 horas de cultivo.

A adição dos 4 pulsos (30, 42, 50 e 54 horas), de composição semelhante ao meio padrão, permitiram a manutenção do crescimento celular e aumento na produção da enzima, que alcançou o pico (252 UI/L) em 56 horas, resultados apresentados no Anexo 5a. Uma última tentativa de favorecimento da produção da PGA foi realizada adicionando-se, em 56 horas de cultivo, um pulso de 300 mL composto por sulfato de amônio 2,0 g/L e fenilacetato de potássio 3,5 g/L ao meio de produção. Comparando-se as concentrações celulares após o último pulso, verifica-se que há um aumento até 64 horas. A atividade enzimática atinge o máximo, 250 UI/L, em 62 horas de cultivo, valor este praticamente igual ao alcançado com os primeiros pulsos. A baixa concentração de enzimas nesse cultivo, mesmo após a adição dos pulsos parece estar mais relacionada com a limitação na concentração de oxigênio na fase de crescimento exponencial do microrganismo do que com os requerimentos nutricionais, pois a cada suplementação do meio observava-se uma retomada na concentração de células.

É interessante notar, pela observação das Figuras 4.14 (A) e 4.14 (B), que nem sempre um crescimento celular mais pronunciado leva a uma maior produção de enzima, ou seja, a concentração de oxigênio dissolvido ótima para o crescimento celular é diferente da concentração ótima para a produção da PGA. Apesar dos Ensaios 4 e 5 apresentarem maior produção da enzima, os Ensaios 1 e 2 com oxigênio dissolvido em 20% na fase exponencial, mostraram crescimento celular mais acentuado neste período.

Comparando-se, então, todos os ensaios com diferentes concentrações de oxigênio dissolvido, pode-se concluir que a condição de 10% é a mais favorável na produção de PGA por Bacillus megaterium 2 armazenado como células dormentes em meio sólido a 4oC. Resultado este que pode ser também confirmado comparando-se as atividades específicas, em UI/gcélula, apresentadas na Figura 4.15.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Ensaio 6 - 5% OD Ensaio 5 - 10% OD Ensaio 4 - 10% OD Ensaio 3 - 300 rpm Ensaio 2 - 20% OD Ensaio 1 - 20/5% OD A ti v id ad e es p ecí fi ca (U I/ g cé lu la ) Ensaios 1 2 3 4 5 6

Figura 4.15: Valores máximos de atividade específica nos ensaios com diferentes concentrações de

oxigênio dissolvido em biorreator inoculados com células dormentes da nova linhagem de Bacillus

megaterium conservadas em meio sólido a 4oC – slants.

4.3.2.2. Influência da Concentração de Oxigênio Dissolvido na Produção de PGA com a