Análises dos dados sequenciados

Após o sequenciamento, os dados foram gerados no formato FASTQ e as análises foram feitas utilizando a plataforma BaseSpace. De acordo com a Tabela 13, os números totais de reads por amostras foram em torno de 400 mil a 600 mil. Em nível de gênero, o banco Greengenes pôde identificar de 81,8% a 93,4 % dos reads por amostras. (Tabela 11). O índice de diversidade de Shannon deduziu que existe de 1841 à 2737 espécies nas amostras avaliadas (Tabela 12), todavia, o número de espécies identificada pelo banco Greengenes corresponde a menos de 30% do número de espécies estimadas. Embora estimado pelo índice de Shannon várias espécies por amostras, não foi encontrada diferença estatística em relação ao nível de diversidade de espécies entre o grupo (Figura 13).

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Tabela 11 - Número de reads gerados e a porcentagem de bactérias identificadas a nível de gênero

Grupos Amostras Número de Reads %Gênero Identificado

SDP 1 674059 82.63 % 5 581491 81.87 % 9 602550 88.80 % 13 686436 90.22 % 17 441072 91.00 % TDP 2 590029 90.30 % 6 613980 84.36 % 10 572521 88.79 % 14 475548 90.71 % 18 639530 85.24 % SDRC 3 537103 84.65 % 7 588662 82.38 % 11 600956 88.18 % 15 620274 90.14 % 31 479809 93.63 % TDRC 4 634613 87.09 % 12 670725 90.05 % 20 492978 91.08 % 24 554173 87.73 % 28 529709 82.81 %

Sedentário Dieta Padrão (SDP); Treinado Dieta Padrão (TDP); Sedentário Dieta Rica em Carboidratos Simples (SDRC); Treinado Dieta Rica em Carboidratos Simples (TDRC).

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Tabela 12- Números de espécies estimado pela Diversidade de Shannon nas amostras e número de espécies identificadas pelo banco Greengenes

Grupos Amostras Número de espécies por Diversidade de Shannon

Número de espécies Identificadas SDP 1 2.495 666 5 2.453 656 9 2.650 591 13 2.661 568 17 2.132 440 TDP 2 2.097 452 6 2.583 613 10 2.737 589 14 2.126 468 18 2.390 551 SDRC 3 2.566 583 7 2.579 689 11 2.553 553 15 2.509 526 31 1.841 367 TDRC 4 2.628 573 12 2.292 449 20 2.282 472 24 2.479 509 28 2.115 547

Sedentário Dieta Padrão (SDP) n=5 amostras 1, 5, 9, 13 e 17; Treinado Dieta Padrão (TDP) n=5 animais amostras 2, 6, 10, 14 e 18, Sedentário Dieta Rica em Carboidratos Simples (SDRC) n=5 animais amostras 3, 7, 11, 15 e 31; Treinado Dieta Rica em Carboidratos Simples (TDRC) n=5 animais amostras 4, 12, 20, 24 e 28.

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Figura 13- Estimativa da riqueza de diversidade de espécies encontrada nas amostras fecais calculadas pelo índice de diversidade de Shannon D iv e r s id a d e d e S h a n n o n S T 1 0 0 0 1 5 0 0 2 0 0 0 2 5 0 0 3 0 0 0 D P D R C

Sedentário Dieta Padrão (SDP) n=5; Treinado Dieta Padrão (TDP) n=5, Sedentário Dieta Rica em Carboidratos Simples (SDRC) n=5 animais; Treinado Dieta Rica em Carboidratos Simples (TDRC) n=5 animais. S= Sedentário, T=Treinado, DP= Dieta Padrão e DRC= Dieta Rica em Carboidratos simples ( P>0,05).

O Dendograma (Figura 14) mostrou que as amostras se subdividem em 3 clusters, sendo que o cluster 1 compreende as amostras 10 TDP, 11 SDRC, 12 TDRC, 20 TDRC, 14 TDP, 18 TDP, 9 SDP, 13 SDP, 15 SDRC, 2 TDP, 31 SDRC, 1 SDP, 6 TDP, 17 SDP, 3 SDRC, 1SDRC, 1 SDP, 6 TDP, 17 SDP, 3 SDRC, 4 TDRC e 24 TDRC. O cluster 2 corresponde as amostras 5 SDP e 7 SDRC, e o cluster 3 corresponde a amostra 28 TDRC. As amostras fecais da região do cluster 1, 4 TDRC e 24 TDRC; 9 SDP e 13 SDP; 12 TDRC e 20 TDRC possuem um grau de similaridade quanto a sua composição e igualdade de abundância relativa a nível de gênero, e a comparação foi favorável pois são animais de mesmo agrupamento. As amostras do cluster 1, 6 TDP e 17 SDP tem alta similaridade, todavia as mesmas amostras analisadas tem em comum o consumo da mesma dieta padrão. Amostras 28 TDRC, 5 SDP e 7 SDRC foram as que apresentaram uma maior diferenciação no grau de similaridade na composição da microbiota ao nível de gênero comparada com o restante das demais amostras avaliadas, uma característica marcante dessas três amostra é uma baixa da abundância de Prevotella que está presente em todas as amostras correspondente ao cluster 1.

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Figura 14- Dendrograma referente as amostras fecais dos ratos Wistars

O dendograma é um agrupamento hierárquico de amostras baseado em classificações no nível de gênero. Sedentário Dieta Padrão (SDP) n=5 amostras 1, 5, 9, 13 e 17; Treinado Dieta Padrão (TDP) n=5 animais amostras 2, 6, 10, 14 e 18; Sedentário Dieta Rica em Carboidratos Simples (SDRC) n=5 animais amostras 3, 7, 11, 15 e 31; Treinado Dieta Rica em Carboidratos Simples (TDRC) n=5 animais amostras 4, 12, 20, 24 e 28.

Legenda:

52 Ao nível de Reino, Figura 15, nas subclassificações Bacteria e Archaea não ocorreram variações estatísticas entre os grupos, porém a dieta rica em carboidratos simples foi capaz diminuir a taxa do reino Viruses (p< 0,05). O gene 16S RNAr se apresenta universal na identificação de bactéria, porem é importante destacar que vários bacteriófagos possuem regiões no DNA que codificam para região ribossomal assim como para proteínas do ribossoma (JASKUNAS; LINDAHL; NOMURA, 1975; LUND et al., 1976), por isso, foi possível a identificação do reino Viruses.

Ao nível de Filo, Figura 16, a dieta rica em carboidratos simples reduziu a abundância de Actinobacteria ( p<0,05) e Fibrobacteres ( p<0,01). O treinamento foi capaz de aumentar Bacteroidetes (p<0,05) e diminuir a razão Firmicutes/ Bacteroidetes ( p<0,05), ou seja a taxa de Bacteroidetes aumentou a ponto de sobressair sobre o filo Firmicutes que é o segundo mais abundante nos dados analisados. Também, o treinamento reduziu Synergistetes (p<0,01), Fibrobacteres (p<0,001) e Actinobacteria (p<0,05).

S = Sedentário, T= Treinado, (●) = Dieta padrão , (■) = Dieta Rica em Carboidrato Simples. a= Significativo SDRC X SDP; b= Significativo TDPX SDP, c= significativo TDRC X SDRC; d= Significativo TDRC X TDP . * P<0,05, ** P<0,01 e *** P<0,001. Estatística utilizada foi Two way ANOVA comparação pós-teste Bonferroni.

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Figura 16- Análises estatísticas da abundância ao nível Filo

S = Sedentário, T= Treinado, (● ) = Dieta padrão, (■ ) = Dieta Rica em Carboidratos Simples. a = Significativo SDRC X SDP; b = Significativo TDP X SDP , c= significativo TDRC X SDRC; d= Significante TDRC X TDP . * P<0,05, ** P<0,01 e *** P<0,001. Estatística utilizada foi Two way ANOVA comparação pós-teste Bonferroni.

No nível de Classe, Figura 17, tanto a dieta rica em carboidratos simples quanto o treinamento induziram uma diminuição na abundância de Actinobacteria (p<0,05), Fibrobacteria (p<0,01 DRC; e p<0,001 Treinamento). A interação dieta rica em carboidratos simples e treinamento aumentou a abundância de Gammaproteobacteria (p< 0,05).

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Figura 17- Análises estatística da abundância ao nível Classe

S = Sedentário, T= Treinado, (● ) = Dieta padrão , (■ ) = Dieta Rica em Carboidratos Simples. a = Significativo SDRC X SDP; b = Significativo TDP X SDP , c= significativo TDRC X SDRC; d= Significativo TDRC X TDP . * P<0,05, ** P<0,01 e *** P<0,001. Estatística utilizada foi Two way ANOVA comparação pós-teste Bonferroni.

No nível de Ordem, Figura 18, a dieta rica em carboidratos simples aumentou a abundância de Enterobacteriales (p<0,05) e o treinamento foi capaz de reduzi-la (p<0,05). Tanto a dieta rica em carboidratos simples quanto o treinamento diminuiram a abundância de Fibrobacterales (p<0,01 DRC; e p<0,001 Treinamento). O treinamento e a interação treinamento e dieta aumentaram a abundância de Aeromonadales (p<0,05).

Figura 18- Análises estatísticas da abundância ao nível Ordem

S = Sedentário, T= Treinado, (●) = Dieta padrão, ( ■) = Dieta Rica em Carboidratos Simples. a = Significativo SDRC X SDP; b = Significativo TDP X SDP , c= significativo TDRC X SDRC; d= Significativo TDRC X TDP . * P<0,05, ** P<0,01 e *** P<0,001. Estatística utilizada foi Two way ANOVA comparação pós-teste Bonferroni.

55 No nível Família, Figura 19, a dieta rica em carboidratos simples aumentou a abundância de Enterobacteriaceae (p<0,05), Helicobacteriaceae (p<0,01), Odoribacteriaceae (p<0,05) e diminuiu Fibrobacteriaceae (p<0,01). O treinamento de natação aróbico foi capaz de aumentar a abundância de Bacteroidaceae (p<0,05), Porphyromonadaceae (p<0,05), Lactobacillaceae (p<0,05), Succivibrionaceae (p<0,05) e diminuiu a abundância Enterobacteriaceae (p<0,05) e Fibrobacteriaceae (p<0,001). A interação da dieta rica em carboidratos simples e Treinamento de Natação Aeróbico aumentou Veillonellaceae (p<0,05), Succinovibrionaceae (p<0,05) e diminuiu Lactobacillaceae (p<0,05).

No nível Gênero, Figura 20, a dieta rica em carboidratos simples aumentou a abundância de Escherichia (p<0,05), Porphyromonas (p<0,01), Butyricimonas (p<0,01) e diminuiu a abundância de Lachnospira (p<0,01), Pediococcus (p<0,05) e Fibrobacter (p<0,01). O treinamento de natação aeróbico aumentou Parabacteroides (p<0,01) e diminuiu a abundância Escherichia (p<0,05), Lachnospira (p<0,001) e Fibrobacter (p<0,001). A interação dieta e treinamento aumentou Anaerovibrio (p<0,05), Anaerobiospirillum (p<0,05) e diminuiu Parabacteroides (p<0,001).

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Figura 19- Análises estatísticas da abundância ao nível Família

S = Sedentário, T= Treinado, (●) = Dieta padrão , (■ ) = Dieta Rica em Carboidratos Simples. A = Significativo SDRC X SDP; b = Significativo TDP X SDP, c= significativo TDRC X SDRC; d= Significativo TDRC X TDP . * P<0,05, ** P<0,01 e *** P<0,001. Estatística utilizada foi Two way ANOVA comparação pós-teste Bonferroni.

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Figura 20- Análises estatísticas da abundância ao nível Gênero

S = Sedentário, T= Treinado, (● ) = Dieta padrão, (■ ) = Dieta Rica em Carboidratos Simples. A = Significativo SDRC X SDP; b = Significativo TDP X SDP, c= significativo TDRC X SDRC; d= Significante TDRC X TDP. * P<0,05; ** P<0,01 e *** P<0,001. Estatística utilizada foi Two way ANOVA comparação pós-teste Bonferroni.

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