A microbiota apresenta uma grande importância na saúde do hospedeiro, sendo que sua composição pode estar diretamente envolvida no funcionamento do metabolismo do organismo, assim como na disfunção metabólica que pode contribuir para o desenvolvimento de patologias. (RIAZ RAJOKA et al., 2017). Os nossos resultados mostraram que a dieta modulou a microbiota intestinal dos ratos Wistar no intervalo de 15 semanas, atento ao fato de que uma dieta rica em carboidrato é utilizada como fonte energética por muitos táxons de bactérias assim como para produção de seus metabólitos (RIAZ RAJOKA et al., 2017). O treinamento de natação aeróbico também foi uma variável que interferiu na composição da microbiota intestinal. Hoje já se sabe que o treinamento aeróbico de alta performance interfere na microbiota por produção de metabólitos por parte do hospedeiro como os neurotransmissores liberados pela ativação do sistema parassimpático, mediadores das respostas inflamatórias, hipo-oxigenação intestinal e diminuição da absorção no intestino (BARTON et al., 2018; CRONIN et al., 2015).
Nosso modelo experimental mostrou que a dieta rica em carboidratos simples induziu aumento da massa corpórea nos animais sedentários na 15° semana, assim como o aumento dos estoques de coxins dos adiposos inguinal, epididimal e retroperitoneal (Tabela 7). Dados anteriores do nosso grupo de pesquisa LBBM/DECBI/NUPEB demonstraram que a partir da 4° semana de consumo da dieta rica em carboidratos simples já se observa um aumento da massa corporal e os índices biométricos dos animais comparados aos animais dieta controle. Outros estudos com 8 e 12 semanas se manteve significativo os mesmos efeitos da dieta (BARBOSA DE QUEIROZ et al., 2017; BOONE et al., 2017; DE QUEIROZ et al., 2012, 2014). O alto consumo de carboidratos simples pode estar induzindo um aumento na produção de insulina que propícia a sínteses de novo de triglicérides (TG) o qual também teve um aumento significativo no grupo SDRC (Tabela 5). O nível elevado da síntese de TG leva ao seu armazenamento nas células dos tecidos adiposos justificando também o aumento dos coxins adiposos observados no grupo SDRC (BASARANOGLU; BASARANOGLU; BUGIANESI, 2015; MAKI et al., 2017; MARDINOGLU et al., 2018; MOCK et al., 2017; PARKS, 2001; PARKS et al., 1999; STANHOPE, 2016; WONG et al., 2016; YKI-JÄRVINEN, 2014).
59 As dosagens glicêmicas dos animais eutanasiados (Tabela 5), revelou que não há diferença estatística entre os grupos, porém foi observado que os animais do grupo SDRC apresentaram uma maior média na dosagem (132,2 ± 10,2 mg/dL). Estudo realizado com ratos Wistar saudáveis, n=110 animais, mostrou que a média de glicemia desses animais eram 117, 06 ± 1,96 mg/dL (DANIELA BRĂSLAŞU et al., 2007). Em outro estudo realizado com ratos Wistar em diferentes idades, animais com 16 semanas de vida apresentaram a média glicêmica 109 ± 8 mg/dL, n=8 animais (GHEZZI et al., 2012). Por estes estudos, poderíamos inferir que os animais pertencentes aos grupos SDP, TDP e TDRC estão com os valores próximos com que já foram descritos na literatura. Em nosso experimento foi realizado a dosagem de insulina com o kit Rat Insulin ELISA, Thermofisher/ Brasil, porém o mesmo deverá ser repetido uma vez que algumas amostras por animal não deram leitura.
Foi observado que a dieta e o treinamento de natação aeróbico não variaram significativamente os níveis de creatinúria: SDP 113,7 ± 19,63 mg/dL (n=3), TDP 97,5 ± 28,83 mg/dL (n=4), SDRC 155,62 ± 31,91 mg/dL (n=4), e TDRC 113,75 ± 26,3 mg/dL (n=4). Contudo, os níveis de creatinúria estão aumentados no grupo SDRC. Indivíduos que apresentam quadro diabetes tem maior propensão de desenvolver disfunção renal (DINICOLANTONIO; BERGER, 2016; WONG et al., 2016).
Durante a experimentação houve uma perda de 3 animais do grupo TDP e junto com a diretoria do CCA, levantamos a hipótese de que alguns ratos estariam com infecção por Mycoplasma, uma bactéria causadora de infecção pulmonar (BARRETO et al., 2002), e que isso teria ocasionado à morte dos animais. Ao nível de espécie, o sequenciamento identificou as bactérias patogênicas do gênero Mycoplasma e Mycobacterium nas fezes dos animais como mostrado no Suplementar 6. Dessa forma foram realizadas as análises hematológicas para averiguar a saúde dos animais (Tabela 6). Foi observado no hemograma que as séries brancas dos animais não estão alteradas, e de acordo com os dados obtidos estão dentro dos valores de referência para ratos Wistar machos encontrado nos biotérios das Universidades Federais da Paraíba e Ceará e Canadian Council Animal Care (CCAC), (CAMILLO SILVEIRA CASTELLO BRANCO et al., 2011) mostrando assim que o modelo experimental não apresentou sintomas de infecção.
60 A dieta rica em carboidratos simples apresentou efeito na modulação de algumas classificações taxonômicas que podem ter contribuído para o aumento do armazenamento dos coxins adiposos. A dieta rica carboidratos simples proporcionou o aumento da abundância de táxons pertencentes ao filo Proteobactéria (Suplementar 2), sendo que o mesmo está associado com desenvolvimento de patologias (ZIJLMANS et al., 2015). A classificação da ordem Enterobacteriales e sua subclassificação família Enterobacteriaceae são definidas por serem bactérias aeróbicas facultativas, podendo realizar fermentação da glicose e gerando como produto da fermentação: fumarato, lactato, acetato, etanol, gás hidrogênio e gás carbônico (WÜST; HORN; DRAKE, 2011), sendo que os produtos dessa fermentação pode induzir ativação da adipogênese (MORAES et al., 2014; RIAZ RAJOKA et al., 2017). Foi observado que a família Helicobacteriaceae, RONG et al., 2016 apresentou um aumento da sua abundância em ratos submetidos a uma dieta high-fat , os quais desenvolveram obesidade. O gênero Escherichia, em condições anaeróbica, é capaz de realizar fermentação de carboidrato e, assim, os seus produtos gerados pela fermentação, podem estar envolvidos na ativação da via da adipogêneses, (ZHU et al., 2013). A dieta rica em carboidratos simples reduziu a taxa da abundância do gênero Pediococcus que são bactérias ácido-láticas e, de modo geral, em animais vertebrados este gênero está relacionado na melhora da microvilosidade e morfologia do intestino e também na redução da gordura visceral (FERGUSON et al., 2010; HIGASHIKAWA et al., 2016). As espécies Pediococcus acidilactici possuem atividades contra Escherichia (RODRIGUEZ-PALACIOS et al., 2009), mais uma vez corroborando com o resultado de Escherichia estarem aumentadas no grupo SDRC.
O aumento das Bactérias pertencentes ao filo Proteobacteria no grupo SDRC, pode ter ocorrido pela baixa taxa na abundância de Viruses induzido pela dieta (Figura 15). Nos dados gerados no Illumina BaseSpace a nível espécie foi possível identificar o bacteriofago Microvirus Enterobacteria phage PhiX174 sendo que o mesmo é capaz de controlar o crescimento das Enterobacteria uma vez que, ao se replicar, o bacteriófago pode levar a lise das bactérias (LEUNG; WU, 2015; MICHEL et al., 2010; ŚLIWA-DOMINIAK et al., 2013). Ou seja, esses resultados corroboram com nossa hipótese, a dieta diminui a taxa de bacteriófago o que, por sua vez, levou ao maior número de Enterobacteriaceae.
61 Em relação ao filo Bacteroidetes, (Suplementar 2) a dieta rica em carboidratos simples aumentou a abundância relativa da família Odoribacteriaceae e o gênero Porphyromonas. Tanto em humanos quanto em camundongos, um aumento da família Odoribacteriaceae está associado com inflamação do intestino (LIU et al., 2016; MORENO-INDIAS et al., 2016; OMER; ATASSI, 2017; WADE, 2013). O gênero das Butyricimonas é conhecido pelo fato de serem produtoras de butirato, sendo que esse AGCC pode inibir a produção de citocinas, tais como IL- 12 e IL-10 e também inibe a enzima histona deacetilase (HUITEMA; SCHENK, 2018; KRAUTKRAMER et al., 2017). Ainda, estudo realizado por LEE et al., 2018, mostrou que camundongos obesos que fazem o uso de metformina, o qual diminuiu a resistência a insulina, apresentaram aumento significativo no gênero Butyricimonas. Em nossos dados, os animais SDRC não apresentaram diferença em relação a resistência à insulina pelo TTOG e área total da curva (Figura 10). Como questionamento, será que este resultado ocorreu devido à interferência por mecanismos epigenéticos e inibição da inflamação promovidos pela produção de butirato pelas bactérias do gênero Butyricimonas, levando a inibição das deacetilase e das citosinas?
O grupo SDP apresentou aumento da abundância dos filos Actinobacteria, Synergistetes e Fibrobacteres. (Figura 16); nas classes Actinobacteria e Fibrobacteres (Figura 17) na ordem Fibrobacterales (Figura 18); Família Fibrobacteraceae (Figura 19) e nos gêneros Lachnospira e Fibrobacter (Figura 20). De acordo com dados da literatura, todos esses níveis taxonômicos são caracterizados por se tratarem de bactérias que utilizam fontes alimentares ricas em fibras o que corrobora com os nossos achados já que a dieta padrão apresenta maior concentração de fibras na sua composição, sendo o dobro encontrado na dieta rica em carboidratos simples (BERTINO- GRIMALDI et al., 2013; BRIONES; COATS; BRINKMAN, 2014; DAVIS et al., 2012; DE FILIPPO et al., 2010; HENDERSON et al., 2015; KOIKE; KOBAYASHI, 2001; MANDAL et al., 2016; MARCHANDIN et al., 2010; MATHERON et al., 1996; NEUMANN; MCCORMICK; SUEN, 2017; PANASEVICH et al., 2015). A fermentação das fibras leva a produção de AGCC que se ligam aos receptores FFAR2 e FFAR3 e induz a produção de hormônio como o PYY a qual pode diminuir a motilidade intestinal de modo que favorece maior tempo para uma completa fermentação das fibras promovido pelas bactérias (EVERARD; CANI, 2014; MORAES et al., 2014). Os animais TDP foram favoráveis à diminuição dos mesmos
62 grupos taxonômicos aumentado pela dieta padrão, pois o exercício aeróbico pode aumentar a motilidade do trato gastrointestinal através de uma alta produção de peptídeo vaso intestinal (VIP) e prostaglandina podendo causar aumento da secreção intestinal e diarreia (LIRA et al., 2008). Portanto, os nutrientes alimentares como as fibras permanecerão por menos tempo no intestino para ser degradadas e fermentadas, podendo assim contribuir para o menor crescimento desses microrganismos.
O treinamento apresentou eficiência na redução do ganho de massa corporal e redução dos estoques dos tecidos adiposos inguinal, retroperitoneal e epididimal causados pela dieta (Tabela 7). A literatura aponta os benefícios causados pelos exercícios físicos, entre eles a redução da massa gorda, (PETRIDOU; SIOPI; MOUGIOS, 2018), o que leva a baixo risco de desenvolvimento de sobrepeso e obesidade. O treinamento aeróbico exige um maior consumo de energia que induz a queima dos ácidos graxos pela sua oxidação revertendo assim à diminuição dos índices antropométricos (CORREA et al., 2015; KEATING et al., 2015; KOCH; BRITTON; WISLØFF, 2012; PANISSA et al., 2016; STAIANO et al., 2017). O treinamento também foi capaz de aumentar significativamente o tecido marrom no grupo TDRC (Tabela 7). Estudos realizados em roedores mostraram que o treinamento induziu produção de mitocôndria por biogêneses a qual apresentou maior expressão gênica de UCP-1 e consequentemente levou ao aumento do tecido adiposo marrom (SEPA-KISHI; CEDDIA, 2016; STANFORD; MIDDELBEEK; GOODYEAR, 2015).
O treinamento pôde reverter parcialmente os efeitos causados pela dieta e entre esses efeitos está a redução da taxa de abundância das bactérias que se apresentaram aumentada pelo consumo da dieta rica em carboidratos como: ordem Enterobacteriales, famílias Enterobacteriaceae e Helicobacteriaceae e o gênero Escherichia, sendo todas essas classificações pertencentes ao Filo Protobacteria. Trabalho realizado com ratas mostrou que o exercício de corrida de alta intensidade foi capaz de diminuir a abundância de bactéria relacionada com o filo Proteobacteria (LIU et al., 2015). Uma hipótese que pode corroborar com a diminuição do agrupamento das Proteobactrias é que o exercício proporciona uma variação do fluxo sanguíneo afetando a oxigenação e fluxo de hormônios e metabolitos que percorre o intestino, desse modo
63 favorecendo o crescimento ou o não crescimento da taxa de determinados nichos de micro- organismos (CAMPBELL; WISNIEWSKI, 2017; DENOU et al., 2016b).
O treinamento aeróbico foi capaz de aumentar o filo Bacteroidetes e diminuir a razão dos filos Firmicute/Bacteroidetes. Segundos dados publicados, existe uma relação de maior abundância de Bacteroidetes em humanos e animais de fenótipos magros assim como os que fazem prática regular de exercícios ou praticam esporte. (CORTEZ et al., 2018; COX-YORK et al., 2015; KASAI et al., 2015; TSENG; WU, 2018). Estudos usando camundongo ob/ob, o qual não codifica o gene da leptina e desenvolve obesidade, mostrou que a taxa Fermicutes/Bacteroidetes é aumentada nesses animais, e nos camundongos que realizaram exercício essa razão diminuiu, assim corroborando com os nossos resultados, nos quais observamos que o treinamento proporcionou aumento do filo Bacteroidetes. Esse aumento podeestar relacionado à prevenção do desenvolvimento e instalação da obesidade. (DENOU et al., 2016b; MORALES MARROQUÍN, 2017; TSENG; WU, 2018). A nível família, as Bacteroidaceae e Porphyromonadaceae tiveram aumento significativo dentro do filo Bacteroidetes (suplementar 3). O gênero das Parabacteroides (suplementar 3), também presente no filo Bacteroidetes, apresentou aumento da abundância no grupo TDP e a espécie Parabacteroides. goldsteinii têm correlacionado efeitos probióticos contra o desenvolvimento da obesidade. (WU et al., 2018).
A interação dieta e treino aumentou o índice de adiposidade quando comparado com o grupo TDP, (Tabela 7). A microbiota dos animais TDRC aumentou a abundância do agrupamento de subtáxons que estão interligados hierarquicamente nos mesmos grupos da classe Gammaproteobacteria, ordem Aeromonadales, família Succinivibrionaceae e o gênero Anaerobiospirullum quando comparado com TDP. Os mesmos táxons fazem parte do filo Proteobacteria (Suplementar 5). O aumento da Gammaproteobactéria está relacionado com ganho da adiposidade e obesidade (CANI et al., 2012; DELZENNE; CANI, 2011; DELZENNE; NEYRINCK; CANI, 2011; EJTAHED et al., 2018), e os agrupamentos taxonômicos citados acima podem realizar fermentação da glicose e seus metabólitos favorecer a adipogêneses (CANI et al., 2012; DELZENNE; CANI, 2011; DELZENNE; NEYRINCK; CANI, 2011; EJTAHED et al., 2018). Sendo assim, esses dados podem explicar, pelo menos em parte, o fato do grupo
64 TDRC ter apresentado um maior índice de adiposidade quando comparados ao grupo TDP (Tabela 7).
Também, a interação treino e dieta, favoreceu o aumento da taxa de abundância da família Veillonellaceae no grupo TDRC, assim como o gênero Anaerovibrio pertencente à mesma família (Suplementar 4). Mell et al (MELL et al., 2015) realizou um estudo com modelos de ratos Dahl onde foi feito uma troca de microbiota entre animais hipertensos e normotensos. Como esperado, a linhagem normotensa após a troca de microbiota passou a ser hipertensa e a linhagem hipertensa se normalizou. Segundo o estudo, a família das Veillonellaceae foram as que se apresentaram como a principal evidência dos constituintes da microbiota que pudesse afetar o aumento da pressão sistólica. Esse estudo corrobora com nossos dados, sendo que o grupo TDRC teve um aumento da pressão sistólica (Tabela 8) apresentando estatisticamente significativo quando comparado com grupo TDP.
Já a família Lactobacillaceae apresentou diminuição da sua abundância no grupo TDRC quando comparado com grupo TDP (Figura 37), as Lactobacillaceae fazem parte do grupo de bactéria produtora de ácido lático e apresentam muitas vantagens como efeito probióticos, induzindo a mitigação da intolerância à lactose, imunomodulação, resistência a ácido biliares e produção de bacteriocinas (TURPIN et al., 2012). Também, a interação dieta e treino diminuiu abundância de Parabacteroidetes, no grupo TDRC quando comparado TDP (Figura 20). Estudos apontam que espécies deste mesmo gênero são usadas como probiótico apresentando efeitos positivos sobre a obesidade (WU et al., 2018).
De acordo com os resultados obtidos no dendograma, os mesmos revelaram que as amostras estão bem próximas quanto sua composição microbiana nas diferentes subclassificações taxonômica embora as amostras 5 SDP, 7 SDRC e 28 TDRC foram as que apresentaram maior divergência comparadas as demais amostras. Uma possibilidade que provavelmente poderia explicar a variação na composição das bactérias intestinais dos três animais em relação ao restante, pode se ter dado ao fato deles serem proles de progenitores diferentes, nisso ocorre duas grandes variáveis como o período pré-natal e amamentação que
65 podem ter interferido na composição da microbiota. (HOOPER; LITTMAN; MACPHERSON, 2012).
As variáveis testadas nesse trabalho como a alimentação rica em carboidratos simples e o treinamento físico aeróbico, mostraram que foram eficientes na modulação da microbiota, sendo que a dieta rica em carboidratos simples favoreceu aumento na taxa da abundância de táxons relacionados ao filo Proteobacteria que está interligado a vários estudos no desenvolvimento de patologias como obesidade (Figura 21). O treinamento foi capaz de reverter parcialmente à taxa de abundância dos mesmos táxons aumentada pela dieta. O treino também foi benéfico para o aumento da taxa de abundância de táxons de bactérias que apresentam efeitos probióticos. Todavia, embora o treinamento aeróbico tenha sido benéfico para modulação do microbioma, a associação treinamento e consumo da dieta rica em carboidratos simples mostraram que o exercício sozinho não foi capaz de manter a abundância de bactérias com efeitos probióticos e não foi capaz de diminuir a abundância de alguns táxons associados com patologias como hipertensão e adiposidade (Figura 22).
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DP= Dieta Padrão, DRCS= Dieta Rica em Carboidratos Simples, SDP= Sedentário Dieta Padrão, SDRC= Sedentário Dieta Rica em Carboidratos simples. A dieta rica em carboidrato simples modulou a microbiota a ponto de favorecer o aumento dos tecidos adiposos. O treinamento de natação aeróbica foi capaz de reduzir a abundância dos táxons favorecidos pelo consumo de ambas as dietas.
Figura 21- Resumo do efeito da modulação do microbioma influenciado pela dieta e seu impacto no modelo experimental e efeito da interferência do treinamento
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Figura 22-Resumo do efeito da modulação do microbioma influenciado pelo treinamento e interação com a dieta
TDP= Treinamento Dieta Padrão, TDRCS= Treinamento Dieta Rica em Carboidrato Simples, DP= Dieta Padrão, DRC= Dieta Rica em Carboidrato. Associação DRC mais o treinamento de natação aeróbico favoreceu aumento do índice de adiposidade comparado TDP. Também no grupo TDRC, diminuiu o gênero Parabacteroides e Lactobacillales a qual apresentam efeito probiótico. A família Veillonellaceae pode estar envolvida no aumento da pressão arterial no grupo TDRC comparado TDP. Observação: Os táxons sublinhados de vermelho pertencem à mesma subclassificação.
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