Anexo 2 Proposta de estudo

O objetivo deste estudo consiste em caracterizar através da EC, as células epiteliais e a microvasculatura de uma gengiva clinicamente saudável e inflamada ao redor de um dente e de um espaço peri-implantar, com o objetivo de detetar alterações sub-clínicas de inflamação gengival. A importância desta investigação advém da carência de estudos que avaliem estes parâmetros sendo que, da recolha bibliográfica efetuada, não foi encontrado nenhum estudo elaborado na população que correlacionasse os mesmos.

Seleção da amostra

Tendo em conta as variáveis a analisar, o tamanho da amostra deve basear-se em cálculos estatísticos para que os resultados obtidos tenham significância.

Após a obtenção das autorizações necessárias, devem ser selecionados aleatoriamente indivíduos que cumpram os critérios de elegibilidade. Para dividir a amostra, devem ser definidos dois grupos distintos com base no seu diagnóstico periodontal: “Saúde Gengival” e “Inflamação Gengival”. O primeiro grupo deve incluir saúde gengival em dentes (saúde periodontal clínica) e em implantes (saúde peri-implantar) e a segunda, inflamação gengival em dentes (gengivite) e em implantes também (mucosite peri-implantar). O diagnóstico periodontal, deve ser realizado com base na nova classificação de 2017, publicada pela Associação Europeia de Periodontologia. (26)

Critérios de elegibilidade

Critérios de inclusão

Para este estudo devem considerados os critérios de inclusão: pacientes com o diagnóstico periodontal de saúde gengival, incluindo saúde gengival num periodonto intacto e reduzido; pacientes com inflamação gengival, com o diagnóstico de gengivite e mucosite peri-implantar.

Critérios de exclusão

Devem ser incluídos todos os pacientes exceto: fumadores, grávidas, pacientes medicamente comprometidos, pacientes que tenham alguma condição que interfira com a

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vasculatura dos tecidos gengivais e pacientes que estejam sob medicação que interfira com os mesmos. Ainda, casos de doentes com alergia ao azul de metileno ou portadores de anemia hemolítica por deficiência hereditária da glucose-6-fosfato desidrogenase, habitualmente denominada de favismo, devem ser também excluídos. (1)

Caracterização da amostra

A caracterização da amostra deve ser realizada tendo em conta o número de indivíduos, o seu sexo, a idade e o diagnóstico periodontal. Deve ser discriminada a data em que a recolha dos dados foi efetuada.

Protocolo de avaliação clínica

Inicialmente, deve realizar-se a anamnese e o diagnóstico periodontal dos pacientes. Nestes, deve ser efetuado o procedimento protocolado começando pela observação clínica do local a analisar.

Para facilitar a observação, o local da cavidade oral a avaliar deve ser a parte vestibular da gengiva, na região do primeiro pré-molar maxilar direito, dando preferência à zona da gengiva não queratinizada. Esta deve ser a localização preferencial devido ao fácil acesso, à espessura fina da gengiva, ao facto de haver uma maior prevalência de implantes na maxila e zona posterior comparado com a zona anterior. (27)

Em cada paciente, serão recolhidas imagens que servem de grupo de controlo. Para garantir a fiabilidade das mesmas, devem ser recolhidas nos três primeiros pré-molares restantes, para despistar possíveis alterações pontuais na mucosa gengival devidas a trauma oclusal ou a inflamação devida a impactação alimentar.

Protocolo fotográfico

Previamente à aquisição das imagens pelo endoscópio de contacto, devem-se efetuar fotografias intra-orais com o objetivo de caracterizar e de se poder recorrer ao aspeto clínico dos tecidos gengivais já observados. Assim, devem ser realizadas fotografias com uma câmara fotográfica na região da cavidade oral a ser analisada. (1)

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Aquisição das imagens

Material utilizado

O equipamento imprescindível para a aquisição das imagens é constituído por uma fonte de luz fria, um endoscópio de contacto e azul de metileno a 1%. O sistema de imagem como a câmara de vídeo, monitor e gravador de imagem, é dispensável embora seja necessário caso se queiram armazenar as imagens observadas. (1)

Para a aquisição das imagens, deve ser utilizado um endoscópio de contacto e as mesmas devem ser capturadas digitalmente por uma câmara e armazenadas como fotografia. (1, 5)

O outro elemento a utilizar é o azul de metileno a 1%, um corante vital que tem a capacidade de garantir o contraste e de diferenciar o núcleo do citoplasma das células do epitélio. (1)

Execução da técnica

Inicialmente, a execução da técnica deve começar com a diminuição cuidadosa do excesso de saliva com uma cânula de aspiração e limpeza da saliva na área de interesse. Como complemento do exame clínico, pode-se começar por utilizar o endoscópio de contacto como um endoscópio clássico.(1, 7, 9, 10, 12)

Quando o endoscópio se encontrar sobre a área da mucosa a analisar microscopicamente, a intensidade da fonte de luz deve ser diminuída, para evitar lesões térmicas da mucosa. A ponta do endoscópio deve ser então encostada à superfície com pressão ligeira e o botão de focagem deve ser regulado para 60 aumentos de ampliação. (1, 5, 10, 12)

Primeiramente, o objetivo é observar a microcirculação para posteriormente se caracterizar o padrão vascular. A técnica de endoscopia de contacto deve ser utilizada, inicialmente, sem qualquer coloração para se poderem observar os vasos sub-epiteliais, dado que a mesma não permite que a luz chegue ao plano submucoso, local onde se encontram os vasos sanguíneos. (1, 5, 17, 18) A forma dos mesmos é examinada por observação dos glóbulos vermelhos que os preenchem e não pela visualização das suas paredes. (1, 5)

Nesta primeira fase não é possível observar as células dado que estas são transparentes e não são detetadas pelo endoscópio de contacto sem coloração prévia. (1, 5)

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Seguidamente, deve-se remover novamente excesso de saliva sobre a área com uma gaze, sem esfregar. (1, 5)

Para a visualização das células, a mucosa deve ser corada, durante aproximadamente 5 minutos, com uma bola de algodão embebida em azul de metileno a 1%. A ponta do endoscópio é novamente encostada e foca-se o plano celular, sendo este mais superficial que o plano vascular. A arquitetura celular é observada, sendo que núcleos coram de azul escuro e o citoplasma de azul claro. (1, 5, 7, 10)

Se se regular a focagem para um plano um pouco mais profundo, tem-se igualmente acesso à microcirculação sub-epitelial. Existe um ponto de focagem intermédio que permite observar em simultâneo células e vasos, com um grau de definição aceitável. (1)

Para observar a mucosa, o endoscópio de contacto pode estar estático ou em movimento. Quando se observar uma zona merecida de ser caracterizada mais detalhadamente, troca-se a ampliação para 150 aumentos e o zoom da câmara deve ser aumentado. Esta observação carece de mais luminosidade. (1)

Análise das imagens obtidas com a endoscopia de contacto

Após a recolha das imagens estar efetuada segue-se a caracterização das mesmas e posterior análise dos resultados.

As variáveis consideradas para definir os padrões de inflamação gengival devem ser divididas em dois grupos, o padrão celular e o padrão vascular. Em relação ao padrão celular, devem ser consideradas:

- Observação de mitoses: caracterizar como “sim” ou não” conforme a observação das mesmas; (1)

- Intensidade da coloração nuclear regular: embora um pouco subjetiva, considera-se regular quando, ao dividir a imagem em quatro quadrantes idênticos, os núcleos aparentem uma coloração semelhante entre si, devendo caracteriza-se como “sim” ou “não” consoante o sejam; (1)

- Células nucleadas: deve-se caracterizar como “sim” ou “não” consoante os núcleos das células sejam visíveis ou não; (1)

- Identificação de infiltrados inflamatórios: caracterizar como “sim” ou “não” aquando da ocorrência de infiltrados inflamatórios anormais para o tecido. (1)

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49 - A arquitetura vascular e forma dos vasos harmoniosa: considerar a arquitetura harmoniosa como “sim” quando os vasos, no seu conjunto, apresentarem forma e dimensões típicas e estiverem distribuídos com a mesma orientação e densidade por área; (1)

- Observação de microtromboses: caracterizar como “sim” ou “não” aquando da observação de alargamentos nodulares dos vasos. (1)

Para todas as variáveis, deve ter-se como referência os grupos de controlo. (1) O objetivo é detetar sinais subclínicos de inflamação gengival.

Análise estatística

De forma a seguir o objetivo inicialmente traçado para este estudo, a análise estatística deve basear-se em relacionar os parâmetros considerados para definir o padrão celular e vascular. Estes parâmetros recolhidos nas imagens de EC devem ser relacionados com o sexo, a idade e o diagnóstico periodontal do paciente.

Deve ser estabelecido um nível de significância relativamente aos testes estatísticos para averiguar se as associações são estatisticamente significativas ou não.

Relações a averiguar, em cada grupo:

• Paciente com mucosite peri-implantar OU gengivite OU saúde periodontal e a presença/ausência de mitoses;

• Paciente com mucosite peri-implantar OU gengivite OU saúde periodontal e a presença/ausência de uma intensidade da coloração nuclear regular;

• Paciente com mucosite peri-implantar OU gengivite OU saúde periodontal e a presença/ausência de células nucleadas;

• Paciente com mucosite peri-implantar OU gengivite OU saúde periodontal e a presença/ausência de células inflamatórias anormais para o tecido;

• Paciente com mucosite peri-implantar OU gengivite OU saúde periodontal e a presença/ausência de uma arquitetura celular e forma harmoniosa dos vasos; • Paciente com mucosite peri-implantar OU gengivite OU saúde periodontal e a

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Considerações éticas e observações finais

Para efetivação da participação no estudo, apenas devem ser incluídos pacientes que assinem a declaração de consentimento informado. Deve ser assegurado o anonimato dos participantes e a confidencialidade dos dados recolhidos.

O projeto de investigação deve ser autorizado pela Comissão da Proteção de Dados da Universidade do Porto e por se enquadrar num estudo clínico com intervenção de um dispositivo médico, o parecer deve ser também solicitado à Comissão de Ética para a Investigação Científica (CEIC).

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