Animais e maneio

No presente estudo foram utilizadas éguas da raça PSL, num total de 53 animais. Foram utilizadas, como dadoras, 24 éguas com idades compreendidas entre os 6 e os 31 anos de idade, sendo a idade média de 17,2 anos e, como recetoras, 29 éguas com idades compreendidas entre os 4 e os 24 anos de idade, sendo a idade média de 8,75 anos. O grupo de éguas dadoras foi sujeito a 71 inseminações, das quais 24 com sémen refrigerado e 45 com sémen congelado. Foram utilizados 17 garanhões, de diferentes raças, com idades compreendidas entre os 6 e os 26 anos, com uma idade média de 13,12 anos.

44 O controlo reprodutivo de algumas éguas era feito fora do centro reprodutivo, no entanto a maioria permanecia no centro em regime extensivo enquanto alguns animais eram mantidos em regime intensivo. A alimentação era sempre definida pelos proprietários. Todas as avaliações da dinâmica folicular e inseminações artificiais foram realizadas por dois Médicos Veterinários, enquanto a recolha e transferência de embriões foi sempre executada pelo mesmo médico veterinário. Todos estes procedimentos eram desempenhados de acordo com um protocolo específico.

As éguas que ingressavam no centro reprodutivo eram sujeitas a um exame ginecológico que englobava a observação da genitália, palpação retal e observação ecográfica do trato reprodutivo.

Todos os dados relevantes eram devidamente registados num caderno que permitia a análise completa do historial reprodutivo de cada égua durante a época reprodutiva, e que eram posteriormente transferidos para um computador. Era anotada a avaliação do desenvolvimento folicular, com o tamanho do diâmetro folicular de ambos os ovários, a iminência ou ocorrência de uma ovulação, a presença de quistos uterinos ou ováricos, presença de líquido intrauterino, categorias de edema uterino, administração de fármacos e diagnósticos de gestação.

As éguas dadoras eram sujeitas a controlo ecográfico para avaliar a dinâmica folicular e presença de líquido uterino, que caso se apresentasse uma persistência de 24 horas, era realizada uma lavagem uterina e posteriormente era realizado um tratamento com oxitocina, 20 UI (unidades internacionais), via endovenosa ou intramuscular, dependendo da quantidade de líquido, sendo que se recorria à via endovenosa em casos de maior acumulação de líquido. Na presença de um folículo com diâmetro superior ou igual a 35 mm era realizada a indução da ovulação, com a administração endovenosa de hCG (1500 UI), sendo esperada a ovulação entre as 24 e as 48 horas seguintes. Nos casos em que se usava sémen refrigerado, as éguas eram inseminadas nas 24 horas seguintes à indução da ovulação e, caso não se verificasse a ocorrência de ovulação a presença de uma ovulação nas 24 horas seguintes à inseminação era realizada uma nova inseminação. Na ocasião em que o sémen era congelado, as éguas eram examinadas ecograficamente a cada seis horas, sendo que a inseminação era realizada imediatamente após a ovulação.

A beneficiação das éguas foi sempre realizada com recurso à IA. O sémen utilizado nas inseminações era sempre selecionado pelos proprietários, sendo que o refrigerado era enviado por médicos veterinários ou era recolhido após uma deslocação ao exterior do

45 centro reprodutivo, enquanto o sémen congelado se encontrava armazenado em tanques de criopreservação de sémen.

O dia da ovulação é sempre considerado como sendo o dia 0 do ciclo, sendo que a recolha do embrião era sempre agendada para o dia 7 ou 8, sendo que o mesmo se encontrava sempre condicionado pela quantidade e aptidão reprodutiva das recetoras disponíveis nesse momento, bem como pela sincronização da recetora com a dadora. No caso de éguas idosas e éguas inseminadas com sémen congelado a recolha poderia ser adiada um dia, para o D9 pós-ovulação. Tudo isto tendo também em conta que após a recolha, a transferência tinha de ser realizada no máximo até às 24 horas seguintes. Por forma a realizar a recolha do embrião, a recetora era colocada no tronco de contenção, a cauda é contida e revestida com fita e a zona perineal é lavada três vezes com solução iodada e enxaguada com água abundante, sendo por fim seca (Figura 12).

Figura 12- Limpeza da zona perineal da égua.

Previamente à recolha são colocados 4 litros de LR numa caixa contendo água à temperatura de 37ºC, para que o fluido ascenda à temperatura fisiológica do animal (Figura 13).

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Figura 13- Caixa contendo água à temperatura de 37ºC e 4L de LR.

O material utilizado para realizar a lavagem e que venha a contactar diretamente com o aparelho reprodutivo da égua é previamente esterilizado. É realizada a conexão dos tubos do sistema de lavagem (tubo “Y” e cateter de “Foley”) (Figura 14) e o filtro de 75 µm na extremidade inferior do sistema, que permite a utilização de um sistema fechado, reduzindo assim a contaminação e possibilitando a passagem de líquido pelo sistema. O Médico Veterinário, após colocação de uma luva de palpação retal esterilizada, introduz o cateter de “Foley” através da cérvix até à parte cranial da mesma, altura em que através de uma seringa com ar insufla o balão com 50 ml de ar (Figura 15) e verifica a estanquidade mediante pressão contra a cérvix.

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Figura 15- Insuflação com ar, através de seringa, do balão do cateter de “Foley”.

Sem retirar o braço dentro da vagina transferia-se o primeiro litro de modo a verificar que o mesmo não reflui para a vagina e deixa-se refluir o fluido para dentro do filtro mediante o princípio do sistema dos vasos comunicantes. A passagem do líquido pelo filtro é conseguida pelo manuseamento dos “clamps”, através do encerramento daquele que permite a sua entrada para o útero e da abertura daquele que permite a saída pelo filtro. É então que se deve retirar a mão de dentro da vagina e começar a massajar o útero por palpação retal, por forma a forçar o líquido a percorrer todo o útero. Após a infusão de cada litro é verificada a presença do embrião macroscopicamente no filtro. O procedimento deve ser realizado quatro vezes no entanto pode ser realizado mais vezes. No decorrer da última lavagem são administrados 20 UI de oxitocina por via endovenosa para estimular as contrações uterinas e esperam-se 3 a 5 minutos antes de abrir o sistema. Quando o útero estiver vazio, o Foley é esvaziado e é retirado o cateter dentro do útero, fechando o sistema antes de sair da vagina. Aproximadamente 50 ml de meio de lavagem são retidos no filtro onde se encontra o embrião, sendo que por vezes há a possibilidade de visualizar macroscopicamente embriões a partir dos 8 dias (Figura 16).

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Figura 16- Embrião retido no filtro no final da lavagem contendo alguma quantidade de detritos.

No final da recolha era sempre administrada PGF2α (1 ml) pela via intramuscular com o objetivo de a égua dadora tornar ao estro.

A solução presente no filtro é então transferida para uma placa de Petri esterilizada com grelha na base, e através do microscópio lupa é pesquisado o embrião (Figura 17 e 18).

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Figura 18 - Observação à lupa de dois embriões procedentes de ovulação dupla.

Após a identificação era realizada a classificação do embrião em relação ao diâmetro, grau 1 (excelente), 2 (bom), 3 (pobre), 4 (degenerado ou morto) ou UFO, e estado de desenvolvimento (mórula, blastocisto jovem, blastocisto ou blastocisto expandido). Posteriormente o embrião era transferido, com a ajuda de uma pipeta específica para manipulação de embriões, para um recipiente com várias divisões onde era lavado através de sucessivas lavagens com um meio de manutenção à base de antibióticos (SYNGRO® Holding) (Figura 19).

Figura 19 - Observação macroscópica de um embrião durante uma das lavagens.

O embrião era então transferido para uma palheta de transferência de 0,25 ou 0,50 ml, consoante o seu tamanho, em que a palheta é preenchida com 3 colunas de líquido, separadas por ar, sendo que o embrião se encontra na coluna do meio.

50 As éguas candidatas a recetoras de embriões eram examinadas regularmente e diariamente quando em estro. Na maioria dos casos em que o diâmetro folicular era superior ou igual a 35 mm e havia a necessidade de utilização da recetora, era realizada a indução da ovulação tal como nas dadoras. Na altura precedente à transferência eram sujeitas a um controlo reprodutivo mais rigoroso, em que era avaliada o tónus uterino e cervical, a presença e definição do CL e a necessidade de tratamento no caso de existir líquido intrauterino. Nos casos em que havia mais do que uma recetora disponível era escolhida a que apresentasse melhores parâmetros.

Para a realização da transferência transcervical do embrião a recetora era contida no tronco de contenção e a zona perineal limpa, tal como para a dadora. Era realizada a administração de flunixina meglumina e sedação com acepromazina, ambos pela via endovenosa. A transferência era realizada com a ajuda de uma pipeta do tipo “Cassou”. O Médico Veterinário colocava uma luva de palpação retal estéril e garantia que durante a realização da técnica de transferência a pipeta não contactava com potenciais contaminantes, nomeadamente a nível da vulva, pelo que havia sempre um ajudante a separar os lábios vulvares. A pipeta estava sempre envolvida por uma bainha estéril e era introduzida até ao início da cérvix, altura em que era retirada a bainha pelo ajudante. A pipeta era então avançada através da porção cranial da cérvix até ao lúmen uterino onde era introduzido o embrião. No final da transferência era sempre realizada a confirmação de que o embrião não permaneceu na pipeta através de uma pesquisa ao microscópio.

Posteriormente, o diagnóstico de gestação das recetoras era realizado aos 12 e aos 24 dias de gestação através de ecografia transretal.