1.1- Animais e Tratamento

Para a realização deste trabalho foram utilizados ratos machos da linhagem Wistar, com trinta dias de idade (P-30), fornecidos pelo biotério da UFSJ. Os procedimentos relatados nesta dissertação estão de acordo com o Guia para Manejo e Uso de Animais de Laboratório do Comitê para Uso e Manejo Animal da Instituição UFSJ, baseado no Guia para Manejo e Uso de Mamíferos em Neurociência e Pesquisa do Comportamento do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA). Os animais foram alojados aos pares em gaiolas de vidro confeccionadas nos moldes das caixas convencionais e mantidas em estantes climatizadas (Figura III.1). O macroambiente foi padronizado tendo as seguintes características: fotoperíodo com ciclo padrão claro-escuro de 12 horas (escuro: 7:00hs - 19:00hs/claro: 19:00hs - 7:00hs), temperatura ambiente controlada entre 21±2ºC, e condições adequadas de ventilação e umidade relativa. Aos animais era permitido o acesso irrestrito à ração em pellets e água.

No caso do fotoperíodo, optou-se por inverter o período de claro e escuro uma vez que a manipulação dos animais, quer fosse para fins de protocolo, quer fosse para o manejo sanitário, não deveria interferir com o ritmo circadiano das cobaias. Assim, como o ciclo do escuro é aquele que corresponde ao período de maior atividade dos ratos, o mesmo sofreu uma permuta tanto em relação ao fuso horário, quanto com relação ao padrão de luminescência. No caso, o período de ausência de luz foi modificado pela implantação de luzes vermelhas, as quais facilitam a manipulação e os

procedimentos no ambiente, e melhoram o padrão de imagem registrado pelas câmeras CCD’s, caso se desejasse estender o monitoramento dentro do ciclo do escuro. Historicamente se sabe, através de estudos comportamentais e fisiológicos, que tal padrão de iluminação não funciona como fator de stress ou desconforto, já que é assimilada pela espécie em questão de forma similar à falta de luz do ciclo do escuro.

Figura III.1 – Gaiolas de monitoramento (A), arranjo das gaiolas para o monitoramento dentro da

estante climatizada (B) e estante climatizada com câmera de filmagem em posição (C)

Os animais foram alojados nas condições experimentais, cerca de sete dias antes do início do protocolo para aclimatação. No 30º dia de vida, induziu-se o estado de mal epiléptico (Status Epilepticus - SE) por meio de injeção sistêmica de cloridrato de pilocarpina (Pilo, Merck, 30 ou 60 mg/kg IP). A aplicação da pilocarpina foi precedida pela administração sistêmica, também por via intraperitoneal, do cloreto de lítio (Reagen – Quimibras, 127 mg/kg), com antecedência de 24 horas. O pré-tratamento com o cloreto de lítio potencializa a ação epileptogênica da pilocarpina. Isto permite que se reduza significativamente a dosagem da mesma de valores de 300-400 mg/Kg, correspondentes à aplicação exclusiva da Pilo, a dosagens tão baixas quanto 30 mg/Kg (DUBÉ et al., 2000a). Ambas as substâncias foram diluídas em cloreto de sódio a 0,9% (NaCl 0,9%) imediatamente antes de serem injetadas, de modo a se obter uma solução

C B

A A

de pilocarpina a 1,5% (15 mg/ml) e uma solução de cloreto de lítio a 5,08% (50,8 mg/ml), o que se traduziu em volumes finais sempre menores do que 1 ml.

O metilbrometo de escopolamina (Sigma, 1 mg/kg ), uma droga anticolinérgica, foi utilizado cerca de trinta minutos antes da pilocarpina, também por via intraperitoneal. A exemplo das outras substâncias empregadas, a escopolamina também foi diluída em NaCl 0,9%, para obtenção de uma solução com concentração final de 0,05% (0,5 mg/ml). A administração da metil-escopolamina neste modelo tem por finalidade atenuar os efeitos periféricos provocados pela injeção de pilocarpina (CLIFFORD et al., 1987). A dose inicial da pilocarpina foi de 30 mg/kg para todos os ratos e, naqueles casos em que não se evidenciou nenhuma crise límbica dentro de trinta minutos, uma nova dose de 30 mg/kg foi ministrada (FUJIKAWA et al., 1999). Tal protocolo nos conduziu à obtenção de dois grupos de indução: SE com 30 mg/kg de Pilo e SE com 60 mg/kg de Pilo; contudo, eles foram submetidos ao mesmo tempo de status epilepticus.

No momento em que as crises límbicas isoladas se transformaram em crises epilépticas persistentes, foi caracterizado o início do status epilepticus. As manifestações comportamentais agudas e os padrões motores apresentados pelos animais foram graduados utilizando-se a escala de Racine, idealizada para o Kindling elétrico e modificada por LOSCHER (1997) (Tabela III.1). Finalmente, para reduzir as altas taxas de mortalidade, particularmente associadas com as crises tônicas, o protocolo incluiu a utilização de uma droga antiepiléptica ministrada 2 horas após o início do SE. A droga de eleição foi o diazepam (Diazepamil – Hipolabor, 10mg/2ml), aplicado por via intraperitoneal, inicialmente em dose única (10 mg/kg), mas admitindo outra administração, caso não ocorresse a interrupção das crises motoras em 15 minutos.

Imediatamente após a constatação da interrupção das crises motoras, foram instituídos cuidados de enfermagem com o objetivo de se minimizar a mortalidade pós-SE, geralmente considerada significativa neste tipo de modelo. Tal abordagem consistiu na administração de 5 ml de soro fisiológico (NaCl 0,9%) via intraperitoneal, no fornecimento de dextrose na água de consumo (dextrose 5%), nos primeiros 5 dias pós-SE, assim como suporte nutricional (ração triturada e úmida per os), quando necessário, a fim de garantir balanço energético e hídrico favoráveis. Nesta fase inicial, aproveitando-se da imobilidade proporcionada pelo diazepam, efetuou-se a marcação (com tinta preta atóxica) de metade dos sobreviventes, o que permitiu a presença de dois

ratos por gaiola (um pintado e outro sem marcação), facilitando a identificação durante o vídeo-monitoramento.

Os ratos correspondentes ao grupo controle (Wistar, machos, P-30 ) receberam o mesmo tratamento com lítio e metil-escopolamina e também salina ao invés da pilocarpina, de modo que os ratos controles daqueles que receberam 30 mg/Kg de Pilo passaram por uma única aplicação de salina e os controles dos animais que totalizaram 60 mg/Kg foram submetidos a 2 aplicações de salina obedecendo ao intervalo de 30 minutos. Ambos os grupos de ratos controles também foram injetados com diazepam 150 minutos (30 minutos de latência para o SE + 120 minutos de SE), após a aplicação de salina; especificamente no caso controle dos animais tratados com 60 mg/Kg, 150 minutos após a segunda aplicação de salina. Estes grupos ficaram alojados sob as mesmas condições dos animais tratados e foram analisados em períodos correspondentes aos ratos que se tornaram epilépticos e aos ratos que terminaram o período de observação sem crises documentadas.

CAIXA 1 2 3 4 5 6 7 8 RATO 1 2 (______________________) Data __/__/__ Peso:_____g (H:_______) *LiCl (127mg/Kg IP – 2,5 ml/Kg):_______________ (solução 5,08%) Data __/__/__ Peso:_____g (H:____) *MeScop (1mg/Kg IP – 2 ml/Kg):________________ (solução 0,05%) (H:____) *Pilo(30mg/Kg IP – 2 ml/Kg):____________________(solução 1,5%) Redosagem: (H:____) *Pilo(+30mg/Kg IP – 2 ml/Kg):____________________(solução 1,5%) Início do SE:___________ (período de latência:______________________)

Score 0 Score 1 Score 2 Score 3 Score 4 Score 5

Escala de Racine modifica da (Loscher, 1997) Sem qualquer manifestação motora detectável (Acinesia) .Imobilidade .Clonia facial .Contração de vibrissas .↓↓↓↓ Abertura das pálpebras .Farejar esterotipado .Sacudidas de cabeça .Clonias faciais mais intensas .Clonia unilateral de MA’s .Clonia bilateral de MA’s .Elevação .Elevação e queda . Crises tônico-clônicas sec. generalizadas Fase Aguda Outras alterações:

( ) “ olhar fixo” ( ) salivação ( ) piloereção ( ) incontinência urinária ( ) tremores ( ) auto-traumatismo Interrupção do SE (pós-120min) (H:_______) Diazepam (10mg/Kg IP – 2ml/Kg):_____________ ( ) aplicações subseqüentes___________________________________________________________ Cuidados pós-SE:_____________________________________________________________________ Obs:________________________________________________________________________________

(Pilo 1,5% = 15mg/ml; MeScop 0,05% = 0,5 mg/ml; LiCl 5,08% = 50,80 mg/ml; Diazepam 10mg/2ml)