65 Os animais heterozigotos submetidos a injeção de halo 0,3 mg/Kg e 0,05 mg/Kg imediatamente após a exploração exibiram um comportamento semelhante. No parâmetro da razão entre a exploração dos objetos os animais do grupo controle e dos tratamentos obtiveram razões próximas a 1. Esse resultado indicou que mesmo sem intervenção farmacológica os animais heterozigotos para o gene de DAT possuem um déficit natural na tarefa de reconhecimento em objetos novos. O resultado também revelou que as doses de 0,3 e 0,05 mg/Kg de haloperidol não modificaram a tendência a não reconhecer os objetos novos.
A justificativa para os animais heterozigotos possuírem um déficit natural na tarefa pode estar no desequilíbrio nos níveis de dopamina encontrados por todas as vias dopaminérgicas no cérebro desses animais. Os animais Nocautes possuem um déficit na produção de dos transportadores de dopamina da fenda sináptica, isso resulta na permanência do neurotransmissor na fenda sináptica 100X mais do que animais selvagens (Giros et al 1996). O excesso de dopamina na fenda sináptica aumenta a atividade dos neurônios pré e pós sinápticos, esse excesso de atividade pode estar ligado ao déficit na memória encontrado no presente trabalho.
O grupo que foi submetido a injeção (0,05 mg/Kg) trinta minutos antes da exploração revelou uma média significativamente maior que seu grupo controle. Esse resultado mostrou que a dose de 0,05 mg/Kg atuando não só na consolidação, mas também na aquisição resultou em um exploração dos objetos novos significativamente maior que os velhos. O resultado visto na figura 16 revela que a razão do grupo de heterozigotos ficou estatisticamente semelhante à encontrada nos animais selvagens.
Resultado semelhante foi encontrado no parâmetro de tempo total de exploração, podemos ver nas figuras 16 que os grupos que foram submetidos a injeção imediatamente após a exploração não obtiveram diferença estatística entre os grupos controle e tratado. O resultado entre o grupo submetido a injeção trinta minutos antes da exploração figura 16 também não revelou diferença estatística entre o controle e o grupo tratado, bem como não houve diferença entre grupos.
Por ultimo, os testes de comparação no parâmetro locomotor revelaram que a dose de 0,05 mg/Kg aumentou significativamente a média de distância total percorrida durante o teste de reconhecimento em objetos novos. Na figura 16 podemos visualizar que a droga injetada imediatamente após a exploração provocou
66 um aumento significativo da média da distância total percorrida, na figura 16 podemos visualizar que a média da distância total percorrida no grupo halo 0,05 mg/Kg, submetido a injeção 30 minutos antes da exploração, é significativamente maior que os grupos 0,3 mg/Kg e do veículo submetidos a injeção trinta minutos após a exploração
Curiosamente, o haloperidol agiu de forma semelhante no parâmetro de consolidação de memória em animais selvagens e animais heterozigotos. Os animais selvagens, no entanto, verificou-se também alterações no o tempo total de exploração enquanto nos animais heterozigotos foi afetado o parâmetro de distância total percorrida.
5.3 – ELETROFISIOLOGIA
O resultado do teste comportamental dos animais que passaram pela eletrofisiologia, visto na figura 18, foi semelhante aos animais que passaram pele mesmo procedimento, injeção de 0,3 mg/Kg de haloperidol imediatamente após a exploração. Assim como os resultados anteriores o grupo veículo ficou com a média da razão próxima a 2 e o grupo haloperidol ficou com a média próxima a 1, indicando que em média os animais não distinguiram os objetos após a utilização da droga. No parâmetro de tempo total de exploração os grupos não diferiram na comparação.
Os dados de PLC foram tratados de modo a fornecer a variação e duração de tempo em que os animais passaram em cada fase do ciclo sono e vigília. No presente trabalho foi explorado as diferenças na duração de tempo entre cada fase do ciclo sono e vigília com o tempo total de seis e quatro horas de registro.
Foi verificado que o grupo controle (figura 19) não apresentou nenhuma diferença estatisticamente significante nas comparações entre as sessões com injeção de veículo e haloperidol em nenhuma fase do ciclo de sono e vigília. Apesar disso foi revelado uma tendência na diminuição do sono MRO após a adição da droga na comparação das quatro primeiras horas de registro (p = 0,11) e na comparação da vigília (0,11). No grupo Exposição (figura 20), os animais que passaram pelo registro eletrofisiológico após a exploração de objetos, foi revelado com as comparações entre a sessão com veículo e a sessão com haloperidol uma tendência de diminuição na duração de sono MRO em seis horas de registro (p = 0,09) e diferença estatística nas
67 quatro horas de registro (p = 0,02). A comparação entre os outros estados não revelou tendência ou diferença estatística.
Para comparar se as condições de exposição ou controle em que os animais foram submetidos são capazes de inteferir no ciclo de sono e vigília o grupo exposição e o grupo controle foram comparados entre si. Com a comparação de seis horas de registro (figura 21) pôde ser verificado que o sono SOL e a vigília não são afetados nem pelo tratamento da droga e nem pela condição de exposição de objetos novos. O teste de Anova de duas vias revelou que a condição (exposição e controle) influência significativamente o resultado, isso sugere que a exposição de objetos novos leva a um aumento significativo e específico de sono MRO. O resultado da análise das quatro primeiras horas de registro (figura 22) revelou a mesma tendência da análise das seis primeiras horas de registro. A vigília e o sono SOL não revelou diferenças significantes enquanto o sono MRO revelou diferença no efeito da condição e do tratamento sobre os dados. Deste modo foi possível verificar que houve efeito específico da droga haloperidol na modulação da fase de sono MRO com um efeito de diminuição da duração do mesmo em relação aos seus respectivos controles.
Para verificar se a variação dos dados dos grupos tratado em relação aos seus grupos controle sob as diferentes condições (exposição/controle) foi feita de modo semelhante ou não foi realizado a normalização dos dados. De modo a anular o efeito da condição os dados foram normalizados a partir do grupo veículo nas diferentes condições (veiculo/veiculo, halo 0,3 mg/Kg). A estatística dos dados normalizados revelou a mesma tendência encontrada nos dados anteriores. A junção dos dados normalizados mostrou que somente o sono MRO possui uma diminuição significante em relação ao grupo controle (figura 23). A variação dos dados dos grupos halo 0,3 mg/Kg foram comparadas revelando que não há diferença significante na fase de sono MRO entre as condições de exposição – controle, pode ser sugerido então que a variação acontece em propoção semelhante em ambas condições com o tratamento de haloperidol 0,3 mg/Kg. Quando verificamos a variação no sono SOL foi obtido diferença significante entre a variação dos dados e a vigília mostrou uma tendência inversa na variação dos dados, como pode ser visualizado na figura 30. Pode-se sugerir que o aumento de sono MRO foi compensado de modo diferente nas diferentes condições. O grupo controle teve um aumento relativo no sono SOL
68 enquanto o grupo de exposição teve uma tendência a ter um aumento relativo de vigília.
Foi analisado o curso temporal de sono MRO para verificar se há diferença, entre as diferentes condições e tratamentos, no modo em que se comporta a duração de sono MRO ao longo do registro. Como pode ser visualizado na figura 25, foi verificado que as diferenças entre o tratamento (veículo e halo 0,3 mg/Kg) no grupo controle e no grupo exposição foi obtida entre a segunda e terceira hora de registro. A comparação entre todos os grupos (halo controle, halo exposição, veículo controle e veículo exposição) revelou também uma diferença na segunda e terceira hora.
O sono possui características fundamentais para o processo de consolidação da memória, seja em processos de plasticidade neural como também no fluxo de troca de informações entre várias áreas do nosso encéfalo e na reverberação das informações durante o sono que foram obtidas durante o estado de vigília (Ribeiro & Nicolelis 2004). O sono MRO possui um papel especial no que concerne a processos de neuroplasticidade e bioquímicos, como a ativação de genes imediatos, por exemplo, o gene zif-268 que possivelmente está relacionado com o tráfego de informação da passagem de memória do hipocampo para o córtex cerebral (Ribeiro et al 2002).
A partir da década de 1970 trabalhos foram publicados fazendo uma associação com tarefas cognitivas e o aumento específico de sono MRO. Os trabalhos de Lucero (1970), Fishbein et al (1974) e Smith (1982) demonstrou que tarefas cognitivas como esquiva discriminativa e exploração de labirinto em busca de recompensa aumentaram especificamente os episódios de sono MRO. O trabalho de Schiffelholz e Aldenhoff (2002) demonstrou que a tarefa de exploração de objetos aumenta o numero de episódios de sono MRO. O presente trabalho está de acordo com os resultados encontrados na literatura, verificamos em nosso paradigma que a duração de sono MRO aumenta significativamente nas quatro primeiras horas de registro após a exploração de objetos.
O resultado encontrado na análise do curso temporal (figura 25) revelou que a diminuição significativa do sono MRO, nas comparações entre os grupos veículo e haloperidol nas condições de controle e exposição, acontece entre a segunda e terceira hora após o registro. Esse resultado está de acordo com os dados apresentados por Lucero (1970) e Smith (1982) que encontraram o aumento de sono MRO em torno da segunda hora de registro.
69 Na modulação da fase de sono, a dopamina parece ter um papel significativo como sugerido pelos trabalhos Dizirasa et al (2006), Monti e Monti (2007) e Monti e Jantos (2008). A modulação de receptores D2 já foi evidenciada na literatura como uma importante via de modulação da fase de sono MRO, foi verificado por Lima et al (2008) que bloqueio seletivo de receptores D2 diminuem significativamente a duração de sono MRO sem afetar o sono SOL. O presente trabalho apresenta resultados com a modulação de receptores D2 diminuindo significativamente a duração de sono MRO nas quatro primeiras horas de registro, tais resultados vão de acordo com dados já encontrados na literatura.
Outro resultado importante foi a correlação e a regressão encontrada entre a duração da fase do sono MRO nas quatro primeiras horas de registro e as razões de exploração de objetos (não-familiares/familiares) (figura 26). Foi encontrado que há uma correlação positiva entre os dados de sono MRO e a razão, indicando que durações baixas de sono MRO são acompanhadas de razões baixas de exploração, o mesmo principio pode ser aplicado as durações altas e razões altas. Com o modelo de regressão (figura 26) visualizamos que razões baixas podem predizer durações baixas de sono MRO.
Os trabalhos de Pearleman (1969) , Fishbein (1970), Smith e Kelly (1988) e Rolls et al (2011) revelaram que a privação de sono leva a um déficit na aprendizagem de tarefas como a esquiva inibitória. O trabalho de Palchykova et al (2006) também se revela na mesma direção em que a privação total de sono afeta a tarefa de reconhecimento em objetos novos.
O presente trabalho teve o mérito de unir vários resultados encontrados na literatura, de modo a associar a interação fisiológica entre o sistema dopaminérgico, o ciclo sono-vigília e o processo de consolidação de memórias. Verificamos que a modulação dopaminérgica através da droga haloperidol resultou em um déficit no reconhecimento de objetos ao mesmo tempo que diminuiu significativamente, e especificamente, a duração de sono MRO. Verificamos que os animais submetidos a dose de 0,3 mg/Kg de haloperidol apresentou uma diminuição de forma consistente e semelhante na duração de sono MRO em ambas as condição de exposição a novidade e controle, podendo assim ser sugerida como um bom modelo de privação de sono MRO. Encontramos também que os animais heterozigotos que possuem déficit de reconhecimento em objetos são capazes de readquirir a capacidade de distinção de
70 objetos novos, nos mesmos níveis de um animal selvagem, com intervenção farmacológica de haloperidol 0,05 mg/Kg.
Na figura 17 encontramos um modelo de atividade dopaminérgica normal com os nossos grupos controles (veículo), ao reduzir a atividade D2 com a dose de 0,3 mg/Kg de haloperidol encontramos um déficit no reconhecimento de objetos. Na mesma figura (17) podemos verificar um modelo de alta atividade dopaminérgica (animais heterozigotos) que não possuem capacidade de distinção dos objetos, mas quando submetemos esses animais a uma baixa dose de haloperidol, diminuindo assim sua atividade, há um retorno na capacidade de reconhecimento dos objetos.
Com os resultados adquiridos no presente trabalho e com os resultados já encontrados na literatura podemos concluir que o sistema dopaminérgico, mais especificamente os receptores da família D2, parece ter uma relação direta com a consolidação de memórias. A relação entre essas duas variáveis parece ser semelhante a uma curva de U invertido. Uma baixa atividade dopaminérgica seria associada com prejuízos nos níveis de consolidação de memória, níveis normais de atividade dopaminérgica seria associada com níveis normais de consolidação de memórias e, por ultimo, uma alta atividade dopaminérgica estaria associada a déficits na consolidação de memórias. Pode ser sugerido também que uma possível explicação para o comportamento da curva em U invertido entre a atividade dopaminérgica e os níveis de consolidação de memória seria dada através da modulação dopaminérgica do sono MRO. A sugestão da curva em U invertido pode ser visualizada na figura 32.
71 Figura 27. Relação entre atividade dopaminérgica e a consolidação de memórias. Com os dados encontrados no presente trabalho e dados descritos na literatura pode ser sugerido que a relação entre atividade dopaminérgica e a consolidação de memórias seja em U invertido. 1 – baixa atividade dopaminérgica é acompanhada de baixa consolidação de memória (dados do presente trabalho com antagonista D2, antagonista D1 (Rossato et al 2009), Antagonista D2 (Nader e LeDoux 1999,Morice et al 2007)). 2 – Animais selvagens sem alterações farmacológicas, por exemplo, os animais utilizados como controle no presente experimento. 3 – Uma dose de agonista ou antagonista dopaminérgico que otimize a atividade dopaminérgica, modulando uma das famílias de receptores de modo a aumentar a atividade de uma família em detrimento da outra, no presente trabalho encontramos que baixa dose de haloperidol resultou em um aumento na performance na exploração de objetos. 4 – Alta atividade dopaminérgica seria acompanhada de déficits na consolidação de memórias, agonistas D1 (Rossato et al 2009), DAT-KO (presente trabalho, Morice et al 2007).
72
6 – CONCLUSÕES
1) Nossos dados indicam que a modulação de receptores dopaminérgicos da família D2 com a droga haloperidol na dose de 0,3 mg/Kg foi capaz de causar déficit na consolidação de memória em reconhecimento em objetos novos em camundongos;
2) Verificamos que a dose de 0,05 mg/Kg aplicada trinta minutos antes da exploração de objetos resultou em um aumento da exploração de objetos novos;
3) Concluímos que a exposição de objetos novos resultou em um aumento significativo de sono MRO em relação a animais que não passaram por tal procedimento;
4) A dose de 0,3 mg/Kg de haloperidol resultou em uma diminuição significativa de sono MRO na condição de exploração de objetos e na condição de ausência de novidade, de forma proporcional nas duas condições;
5) Pode ser concluído também que os mesmos animais que obtiveram déficit na consolidação de memória de reconhecimento de objetos novos possuíram diminuição significativa de sono MRO;
6) Animais heterozigotos possuem, naturalmente, déficit em reconhecimento de objetos novos mesmo sem intervenção farmacológica;
7) A dose de 0,05 mg/Kg de haloperidol foi capaz de restabelecer a habilidade de reconhecimento de objetos novos em animais heterozigotos.
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