3.8.1 – Ambiente Experimental
Uma câmera foi instalada acima do aparato, para filmar todo procedimento, e foi conectada a um computador presente na própria sala. O ambiente foi mantido fechado, iluminado e com temperatura mantida em 23° Celsius. Os animais foram levados ao recinto individualmente, dessa forma foi minimizada a interferência por sons ou cheiro de outros animais já que a presença dos mesmos poderia retirar a
34 atenção do animal durante o teste. Após 10 minutos de exploração livre, os animais foram retirados do aparato. Após cada exploração o campo aberto e os objetos foram limpos com álcool 30%.
Os animais foram contidos sem auxilio de anestesia e foram submetidos a uma injeção intraperitoneal de veículo ou haloperidol. Transcorridas 24 horas após a exploração os animais foram reexpostos ao mesmo paradigma de objetos novos, com a presença de dois objetos não-familiares e dois familiares.
3.8.2 – Animais implantados
Os animais implantados são divididos em dois grupos. O primeiro grupo, chamado de controle, foi constituído por quatro animais que foram registrados em sua própria caixa durante 8 horas ciclo sono e vigília. Esses animais não passaram por nenhum procedimento comportamental. Foram submetidos a um registro após injeção de veículo e outro registro, sete dias após o primeiro, com injeção de haloperidol 0,3 mg/Kg.
O segundo grupo é constituído de 5 animais que passaram por procedimento de objetos novos. Sete dias depois da cirurgia de implante os animais foram submetidos a uma sessão de registro na sua própria gaiola para determinação do padrão para coleta de dados para cada animal, primeiro mapa de estado e habituação do animal ao aparato de registro. Transpassados dois dias depois do registro os animais são submetidos a primeira sessão de exploração. Durante os dez minutos de exploração a atividade eletrofisiologia do animal é registrada, a coleta de dados se estende até doze horas decorrido da exploração. Após sete dias a segunda sessão foi realizada com o mesmo modelo da primeira. Os testes foram filmados para posterior coleta de dados. Os animais foram devolvidos ao biotério depois dos procedimentos para posterior sacrifício por injeção intraperitoneal de tiopental na dose de 100 mg/Kg.
35 3.9 - ANÁLISE DE DADOS
3.9.1 – Comportamento
Os dados foram coletados através de vídeo captado por uma câmera Panasonic acoplada ao sistema Plexon com o software da própria câmera. Os dados considerados nesse experimento foram a razão entre o tempo de exploração dos objetos familiares/não-familiares, o tempo total de exploração (familiares + não-familiares) e a atividade locomotora, todos coletados durante a reexposição.
Consideramos exploração quando o animal mantém contato com o objeto através de vibrissas e ou com as duas patas dianteiras. Qualquer outra parte do animal em contato com o objeto não é considerado no tempo de exploração (corpo, pata traseira ou cauda, por exemplo).
3.9.2 – Eletrofisiologia
Para a eletrofisiologia foram considerados os dados de PLC coletados no hipocampo e córtex do animal. Foi construído um mapa de estado de até doze horas de registro. O mapa de estado foi construído com base no trabalho de Gervasoni et al (2004) e Dzirasa et al (2006). A partir de um análise de espectro de potência são verificadas as faixas de frequência em que os estados de sono e vigília mais se diferenciam. Duas razões de frequências são criadas de modo que a plotagem das razões ao longo do tempo é realizada em locais diferentes do gráfico, gerando três aglomerados distintos de sono MRO, SOL e vigília (Figura 10).
36 Figura 10. Representação do mapa de estado do ciclo de sono e vigília. Os pontos pretos representam o cluster de vigília, os pontos verdes representam o aglomerado de sono MRO e os pontos vermelhos representam o aglomerado de sono SOL. Os pontos azuis representam a as faixas de transição do ciclo.
Como meio de auxiliar a seleção dos aglomerados de sono e vigília foi adicionado a programação histogramas para determinar a posição e a intensidade de algumas faixas de oscilações e atividade motora. As oscilações de baixa frequência, delta por exemplo, são características do sono SOL, por isso é verificado uma maior intensidade de distribuição de delta onde é localizado o cluster de sono SOL. Teta é uma oscilação característica do sono MRO, do mesmo modo ela possui maior intensidade no cluster de sono MRO. O histograma de aceleração serve para distinguir de forma clara o cluster de vigília dos aglomerados de sono. A figura 11 mostra o histograma e os gráficos de distribuição de força associados ao mapa de estado da figura 10. Como a construção do mapa de estado não nos da nenhuma informação quantitativa do ciclo de sono vigília, é retirado o tempo total de duração de cada fase do ciclo sono vigília através do tempo de permanência dos pontos que estão em cada seleção de aglomerado. Na figura 10 pode ser observado um exemplo da duração de cada fase do ciclo do sono vigília em quatro horas de registro.
37 Figura 11. Histogramas associados a formação do mapa de estado. O eixo x e y de todos os quadros são equivalentes a razão 2 e 1, respectivamente, da figura 10. O quadro Mapa de Estado é um histograma da distribuição e intensidade dos pontos do mapa de estado. O quadro acelerômetro é uma distribuição de força da variação da aceleração no posicionamento do animal ao longo do registro. O quadro Teta e Delta representam uma distribuição de força das faixas de oscilação ao longo do registro.
Foram analisadas as durações de cada fase dos ciclos sono e vigília em quatro, seis horas de registro. Foi verificado também o curso temporal da fase de sono MRO em janelas de dez minutos durante as quatro primeiras horas de registros.
Os dados foram tratados estatisticamente no programa GraphPad Prism 5, no caso das análises da eletrofisiologia foram tratados no Matlab. A normalidade dos dados foi obtida através do teste de Shapiro-Wilk. Houve comparações de médias dos grupos com teste t de Student, Mann Whitney, Anova e Anova multi-variada.
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