Animais marinhos como fonte de biomoléculas

O ecossistema marinho abriga ampla biodiversidade sendo uma das bases das atividades econômicas da nossa sociedade. Vale ressaltar que os oceanos e mares proporcionam um incomensurável potencial para a heterogeneidade biológica e química (Abad et al., 2011). Os recifes de coral (Figura 6), por exemplo, são essenciais para a saúde dos oceanos e a economia de muitos países. Eles protegem a Costa da erosão causada pela energia do mar, são responsáveis pela produção da base estrutural de habitats, ou seja, constituem o elo inicial da cadeia alimentar para a biodiversidade recifal e fornecem a fonte fundamental de proteína para vários países subdesenvolvidos, bem como a renda da indústria turística. Os

recifes abrigam uma fauna associada riquíssima que incluem desde bactérias a peixes sendo estes organismos fontes de novas drogas para a indústria farmacêutica. Vários desses organismos relacionados aos corais dependem fundamentalmente da saúde destes para a sobrevivência (Mcfall-Ngai et al., 2005; Chimetto et al., 2010).

Figura 6. Vista aérea dos recifes de corais de Tamandaré, APA Costa dos Corais.

Fonte: (Ferreira e Maida, 2006).

Apesar da sua importância como fonte de alimentos relacionados com os recursos da medicina, energia, dentre outros, ainda se conhece muito pouco sobre as espécies de micro-organismos vivos que se encontram nesse ambiente (González-Párraga et al., 2011).

O número crescente de estudos sobre a heterogeneidade da microbiota em corais nos últimos 10 anos mostrou que eles desempenham um papel-chave na construção dos recifes, pois auxiliam a formação da fauna bentônica e possuem um papel fundamental para a saúde dos oceanos. Além disso, como mencionado breviamente, tem sido extremamente importante para a economia de vários países por meio da pesca, ecoturismo e “berçário” para diversos organismos (Chimetto et al., 2009).

Não somente os corais, mas outros invertebrados marinhos também são conhecidos por serem aglomeradores naturais de comunidades microbianas particulares, pois a sua alimentação deve-se à filtragem de partículas contidas na

água. Animais como os bivalvos marinhos como os mexilhões e moluscos podem prender em seus tecidos uma grande quantidade de bactérias nativas e não nativas dos oceanos e que são de significativa importância do ponto de vista da saúde pública. Esses animais estão sujeitos ao controle microbiano centrado na detecção da bactéria entérica E. coli como um indicador de poluição fecal, bem como membros dos gêneros Vibrio ou Aeromonas, que podem ser patogênicos para humanos ou animais (Romanenko et al., 2008).

Diversas interações estão presentes nesse ambiente e tem sido amplamente difundidas nesse ecossistema como, por exemplo, as associações mutuamente benéficas entre bactérias e animais. As interações de bactérias hospedeiras no ambiente marinho são tradicionalmente caracterizadas como simbiótica, comensal ou patogênica. Estas colaborações de certa forma ampliam o potencial de sobrevivência de ambos envolvidos. Na simbiose, as interações das bactérias hospedeiras, por exemplo, são equilibradas com benefício recíproco tanto para elas quanto para os organismos na qual elas se associam. Nas interações comensais há a coexistência de pelo menos dois organismos diferentes, sem prejuízo mas também sem benefício evidente. As definições de interações de bactérias hospedeiras são confluentes e muitas podem apresentar-se em duas categorias de interação (Mcfall- Ngai et al., 2005).

Outros estudos têm demonstrado que espécies da bactéria Gram-negativa Photobacterium associada a corais têm sido capazes de produzir antibióticos que protegem o coral (Chimetto et al., 2010). Por outro lado, o motivo na qual os corais obtiveram, durante milhares de anos, a produção de estruturas maiores e biológicas tem sido muitas vezes atribuído à simbiose característica entre o coral e microalgas endossimbióticas, conhecidas como zooxantelas (Symbiodinium sp.). Mais que 50% dos nutrientes dos corais são derivados dos produtos fotossintéticos das zooxantelas (Mcfall-Ngai et al., 2005).

No caso da interação patogênica, um parceiro se beneficia em detrimento do outro, resultando em casos de danos nos tecidos ou na célula ou até mesmo a morte do organismo. As interações entre as bactérias e os seus hospedeiros não são estáticas, porém constituem grande preocupação uma vez que, mudanças adaptativas em um dos parceiros devem ser seguidas por medidas defensivas do outro para que possa manter o equilíbrio (Mcfall-Ngai et al., 2005).

O rompimento de simbioses entre algas e corais gera uma das doenças mais graves dos corais que resulta no clareamento ou branqueamento (descoloração) do coral (Mcfall-Ngai et al., 2005). Acredita-se que as mudanças climáticas e interferência antrópica poderia ser uma das causas do branqueamento de corais no mundo todo. Além do branqueamento, a doença da banda negra tem sido descrita em 70 espécies de corais, incluindo tanto escleratinas quanto gorgônias podendo causar a mortalidade da colônia toda por lise instantânea dos tecidos. Esta doença na maioria das vezes tem como alvo, espécies recifais de corais ecologicamente importantes. Estudos anteriores acerca das bactérias associadas a corais revelaram que os corais visivelmente saudáveis contêm menos comunidades bacterianas diferenciadas do que em áreas saudáveis contendo corais doentes e que as composições das duas populações são diferentes.

Nos últimos anos, o estudo de micro-organismos associados a corais tem ampliado o foco no papel de tais micro-organismos na saúde e doença do coral. Um destes micro-organismos é a bactéria Photobacterium rosenbergii que foi encontrada associada com a saúde e a doença em corais brasileiros. Alguns estudos revelaram a atividade antibacteriana entre bactérias associadas ao coral e também atividade antimicrobiana dos corais propriamente ditos (Gantar et al., 2011). Estudos revelam que P. rosenbergii aparentemente dotada de motilidade, aparece de forma considerável na microbiota de espécies de corais saudavéis e doentes (Chimetto et al., 2009).

Pesquisadores acreditam que existem milhares de bactérias marinhas desconhecidas, pois a quantidade de espécies isoladas até então, não reflete a heterogeneidade de formas presentes no mar. As bactérias presentes na água do mar podem ter origem nos rios ou por meio de esgotos, aterros sanitários e se adaptar ao ambiente marinho. Desta maneira, um grande número de agentes patogênicos pode ser levado para o mar. A adaptação destes micro-organismos ao ambiente marinho está relacionada à forma de alimentação de alguns organismos por meio da filtragem destas águas contaminadas ingerindo esses micro-organismos que podem se tornar patogênicos para os seres humanos (González-Párraga et al., 2011).

A distribuição de bactérias na água do mar pode ser definida por uma série de fatores físico-químicos e biológicos sendo o número de matéria em decomposição

orgânica disponível e a densidade de organismos planctônicos dentro das águas, visivelmente as causas básicas desta distribuição. No trabalho de González-Párraga (2011), foi citado apenas patógenos encontrados em todos os domínios de vida, Archaea, Eucarya e Bacteria, destacando-se os gêneros Alcaligenes sp na qual faz parte da microbiota natural bacteriana não patogênica isolado a partir da água, bem como nas amostras de mexilhões; Pseudomonas sp encontrado em crustáceos, peixes e bivalvos; Pseudoalteromonas sp comumente associados com organismos marinhos mas somente alguns relacinados a doenças; Shewanella sp isolado de peixes e moluscos; Vibrio sp isolados de pepinos do mar da espécie Apostichopus japonicus; Photobacterium sp encontrado na microbiota do camarão Nephrops norvegicus e de alguns corais; Aeromonas sp encontrado em moluscos bivalvos e Tenacibaculum mesophilum isolados de esponjas e macroalgas (González-Párraga et al., 2011).

Em 1951, Bergmann e Feeny relataram o isolamento dos nucleosídeos espongouridina e espongotimidina a partir da esponja Cryptotethya crypta indicando um dos primeiros relatos na literatura com produtos naturais químicos marinhos. Com base na sua estrutura química, estes produtos naturais são separados em sete classes: terpenoides, esteroides (incluindo saponinas), alcaloides, éteres (incluindo cetais), fenois (incluindo quinonas), estrigolactonas e peptídeos. Até meados de 2008, a maioria dos novos compostos isolados a partir de organismos marinhos foi proveniente de invertebrados, na qual 75% dos compostos foram isolados a partir de animais pertencentes ao filo Porifera (principalmente esponja) e celenterados (a maior parte de corais). No mesmo estudo, foi comprovada que a quantidade de terpenoides e alcaloides isolados foi superior a quantidade de peptídeos isolados (Hu et al., 2011).

Em comparação com o ambiente terrestre que foi o centro de estudos e pesquisas da indústria farmacêutica por décadas, habitats marinhos se mantêm conservados sem a exploração da sua tendência para produção de metabólitos farmacológicos. Nas últimas décadas, o estudo e a pesquisa foram ampliados do ambiente terrestre para o ambiente oceânico a fim de descobrir novos indícios para candidatos à produção de fármacos. Como já referenciado, o ambiente marinho representa grande importância para a biodiversidade de organismos. Tais organismos servem como fonte de novas substâncias principalmente metabólitos

secundários na qual a pesquisa por estas moléculas representa crescimento nos últimos anos. O ambiente marinho dispõe de enormes recursos para novos e diferentes compostos na qual foi considerado o maior reservatório de moléculas naturais remanescentes a serem avaliados para a atividade de fármacos (Aneiros e Garateix, 2004). Além disto, é importante destacar que este consiste em um ambiente repleto de micro-organismos e o uso de moléculas de defesa contra patógenos é uma realidade neste ecossistema.

Nos últimos anos, buscando novas alternativas para a redução do número de micro-organismos patogênicos aos seres humanos e também para a defesa de animais e plantas, os PAMs se destacaram como prováveis substitutos para os antibióticos convencionais (Jenssen et al., 2006) e uma variedade de PAMs provenientes de invertebrados terrestres e marinhos foi e ainda está sendo descrita e caracterizada. Estes peptídeos podem ser extraídos de esponjas marinhas, anelídeos, moluscos, quelicerados, crustáceos e tunicados e apresentam atividade contra diferentes micro-organismos e outras atividades que incluem antitumorante, anticoagulante, inseticida, entre outras (Tabela 3).

Em relação aos PAMs que podem desempenhar atividade antimicrobiana no organismo do animal, os isolados do filo Echinodermata conhecidos como strongylocinas foram os primeiros PAMs a serem isolados de colemócitos de ouriços (Strongylocentrotus droebachiensis) (Li et al., 2008). Estes se dividem em strongylocinas 1 e 2 na qual constituem peptídeos catiônicos ricos em cisteína e que apresentam 48 resíduos de aminoácidos (5.6 kDa) e 51 resíduos de aminoácidos (5.8 kDa), respectivamente. Eles exibem baixa atividade hemolítica e atividade contra as bactérias Gram-positivas como Corynebacterium glutamicum e S. aureus e também Gram-negativas, por exemplo, Listonella anguillarum e E. coli (Li et al., 2008; Li et al., 2010).

No filo Arthropoda, peptídeos conhecidos como Taquilepsinas I foram isolados de hemócitos do caranguejo-ferradura japonês Tachypleus tridentatus e mostraram inibição do crescimento de bactérias Gram-negativas (Salmonella e E. coli) e bactérias Gram-positivas (S. aureus), bem como o crescimento de fungos como C.albicans e Cryptococcus neoformans. Estas possuem duas pontes dissulfeto e formas antiparalelas de folhas-β, com resíduos hidrofóbicos em um lado da molécula e resíduos catiônicos do outro lado (Morvan et al., 1997).

No filo Chordata, tem-se exemplos de peptídeos do tipo α-hélices com atividade antibacteriana das quais podem ser citados as clavaninas que foram originalmente isoladas de hemócitos do tunicado Styela clava. Estes peptídeos possuem 23 resíduos de aminoácidos, com porção C-terminal rica em histidina, glicina e fenilalanina (Lee et al., 1997). Estes peptídeos atuam em nível de membrana por meio de um mecanismo dependente do pH na qual são mais ativos em elevadas concentrações de sal em pH ácido do que em pH neutro quando o peptídeo apresenta uma carga ligeiramente positiva, atuando de forma inespecífica e desestabilizando a bicamada lipídica (Lee et al., 1997; Van Kan et al., 2003).

Na hidra, espécie de cnidário foram isolados diversos PAMs sendo o mais conhecido o hidramacina 1. A presença de PAMs neste animal era esperada nos epitélios ectodermal e endodermal que são bem dispostos para sobreviver em um ambiente cheio de agentes patogênicos e impedem a entrada de agentes infecciosos no organismo (Bosch et al., 2009; Sher e Zlotkin, 2009). A hidralisina, uma proteína paralisante que exibe células com atividade citolítica seletiva, não proteolíticas ou atividade fosfolipase, encontrada na hidra verde Chlorohydra viridissima compreende um grupo distinto de outras toxinas de Cnidários, mas semelhante em atividade e estrutura de toxinas bacterianas e fúngicas (Sher et al., 2005). Este peptídeo demonstrou atividade contra um grande número de patógenos humanos Gram-negativos, incluindo E. coli, Klebsiella oxytoca e K. pneumoniae, que são resistentes a antibióticos convencionais. Na mesogléia de Aurelia aurita, comumente chamada de medusa da lua ou simplemente água viva, foi encontrada um PAM denominado aurelina. Este peptídeo exibiu atividade contra a bactéria Gram-negativa E. coli e contra a bactéria Gram-positiva Listeria monocytogenes (Ovchinnikova et al., 2006).

Tabela 3. Alguns peptídeos antimicrobianos isolados de invertebrados marinhos e suas respectivas atividades.

Peptídeos Antimicrobianos

Invertebrado isolado Atividades Referências

Aurelina Mesogléia da água viva (Aurelia

aurita)

E. coli e L.monocytogenes (Ovchinnikova et al., 2006)

Defensinas Molusco (Mytilus edulis e Mytilus

galloprovincialis) e escorpiões (Leiurus quiquestriatus e

Androctonus australis)

Gram-positiva, Gram-negativa e vírus (Cociancich et al., 1993; Charlet et al., 1996; Ehret-Sabatier et al., 1996; Hubert et al., 1996)

Cg-Def Molusco Crassostrea gigas Antibacteriana: Gram-positiva e -negativa,

antifúngica (Gonzalez et al., 2007)

Hidramacina 1 Hidra E. coli, K. oxytoca e K. pneumoniae (Bosch et al., 2009; Sher e Zlotkin,

2009)

Strongylocinas 1 e 2 Colemócitos de ouriços

(Strongylocentrotus droebachiensis)

C. glutamicum, S. aureus, Listonella (Vibrio)

anguillarum e E. coli

(Li et al., 2008; Li et al., 2010)

Clavaninas Hemócitos do tunicado (Styela clava) Clavanina A: S. aureus, bactérias Gram-

negativas e fungos (Lee et al., 1997; Van Kan et al., 2003)

Mitilina A Mexilhão (Mytilus edulis) Espécies de Vibrio, leveduras e fungos (Charlet et al., 1996; Blunt et al.,

2010)

Bactenecina Hemócitos do caranguejo (Carcinus

maenas)

Micrococcus luteus e Psychrobucter

immobilis

(Schnapp et al., 1996; Stensvag et

al., 2008)

Taquilepsina I Hemócitos do caranguejo ferradura

(Tachypleus tridentatus)

Salmonella, E. coli, S. aureus, C.albicans e

C. neoformans (Morvan et al., 1997)

Peneidina 1, 2, 3 e 4 Plasma e hemócitos do camarão

(Litopenaeus vannamei e L.

setiferus)

Antibacteriana (Destoumieux et al., 1997; Destoumieux et al., 1999; Gross et

FCTH Plasma e hemolinfa do camarão

(Litopenaeus vannamei) Antifúngica (Destoumieux-Garzon et al., 2001; Bachere et al., 2004)

Teonelamida F Esponja marinha Theonella sp. Antifúngica (Matsunaga et al., 1989)

Orbiculamide A Theonella sp. Anticoagulantes do sangue que atuam como

inibidores da enzima trombina (Fusetani et al., 1991)

Halicylindramides A–C Esponjas marinhas Halichondria

cylindrata

Antifúngica contra Mortierella ramanniana

e citotóxica contra céulas leucêmicas P388 (Li et al., 1995)

Halicylindramides D e E Halichondria cylindrata M.ramanniana (Li et al., 1996)

Jaspamida/ geodiamolida e

hemiasterlina /criamida Auletta c.f. constrictaEsponjas marinhas Cymbastela sp., e Hemiasterella minor.

Jaspamide: antifúngicos e atividades antiproliferativas além de citotóxicas,

antimicrobianas e inseticidas

(Coleman et al., 1995; Zampella et

al., 1999)

Aciculitinas A−C Esponja Aciculites orientalis Antifúngica (Bewley et al., 1996)

Dolabelanina B2 Lebre do mar (Dolabela auricularia)

Antifúngica: Candida tropicalis,

Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae e C. albicans.

Antibacteriana: Bacillus subtilis, S. aureus, L.

monocytogenes, Haemophilus influenza,

Vibrio vulnificus, E. coli

(Iijima et al., 2003)

BDS I e II Anêmona (Anemonia sulcata) Antihipertensiva e antiviral; bloqueador de

canal de potássio Kv3 (Driscoll et al., 1989; Yeung et al., 2005)

Didemninas Ascídias (Trididemnum solidum) Antitumoral e antiviral (Aneiros e Garateix, 2004)

Tamandarinas A e B Ascídia da família Didemnidae Antiviral, imunossupressora, antitumoral (Vervoort et al., 2000; Aneiros e

Garateix, 2004)

Lissoclinamidas Ascídia (Lissoclinum patela) Propriedades farmacológicas contra fibroblastos humanos (Aneiros e Garateix, 2004)

A vida marinha também pode ser capaz de produzir ou acumular uma gama diversificada de metabólitos secundários biologicamente ativos, incluindo esteroides, terpenos, acetogeninas, alcaloides e polifenois (Reimao et al., 2008; Zhao et al., 2012). No caso de cnidários marinhos, especialmente os sesséis também produzem uma gama diversificada de metabólitos bioativos com grande potencial de desenvolvimento como medicamentos e ferramentas de pesquisa que funcionam como barreiras físicas contra patógenos que o organismo marinho pode encontrar em recifes abertos (Sánchez et al., 1998; Haygood et al., 1999).

Alguns destes metabólitos de origem marinha com atividades antibacterianas, antifúngicas e antivirais, recentemente estão sendo utilizados fortemente como antibióticos e podem ser eficazes contra doenças infecciosas, tais como o HIV, tratamento do câncer e as diversas infecções bacterianas (penicilina, cefalosporina, estreptomicina e vancomicina) (Abad et al., 2011).

Uma das companhias farmacêuticas mais conhecidas que desenvolvem fármacos com protótipos de origem marinha é a PharmaMar e nos últimos 20 anos investiu mais de 1,2 bilhão de reais na pesquisa desses fármacos com potencial para tratamento do câncer. Essa companhia é responsável pela coleção de mais de 65.000 organismos marinhos, na qual foram isoladas 700 novas substâncias químicas e descritas 30 novas famílias. No ano de 2009, existiam 3 substâncias em fase pré-clínica e 5 em fase clínica de testes, sendo que a trabectedina (ET-743, Yondelis®_{) foi aprovada pela Comissão Européia para o tratamento de sarcomas de}

tecidos moles em pacientes refratários. Outra companhia fundada para a prospecção de fármacos a partir de micro-organismos marinhos é a Nereus Pharmaceuticals fundada em 1998, possuiu 2 protótipos em fase 1 de testes clínicos para o tratamento de câncer, incluindo a salinosporamida A. Atualmente já existem 4 fármacos relacionados a substâncias de origem marinha em uso clínico como anticâncer como a ara-C (Citarabina®) extraída da esponja Cryptotheca crypta, coletada no mar do Caribe e trabectedina (Yondelis®), antiviral como a ara-A (Vidarabina®) também encontrada na ascídia caribenha Ecteinascidia turbinata, além do analgésico neuropático conhecido como ziconotídeo (Prialt®) (Costa-Lotufo et al., 2009).

Na pesquisa por novos agentes antivirais, especificamente para combate ao herpes, no laboratório Welcome, a zidovudina ou azidotimidina (AZT) foi encontrada a partir das propriedades de nucleosídeos isolados de algas marinhas. Inicialmente,

o AZT foi isolado e passou por ensaios não demonstrando atividade contra o Herpes. Com o aparecimento do HIV, responsável pela AIDS, o AZT foi reavaliado e caracterizado como um inibidor da enzima transcriptase-reversa (TR) viral, sendo um dos poucos tratamentos quimioterápicos contra este tipo de retrovírus (Barreiro e Bolzani, 2009).

Como descrito anteriormente existem muitos relatos de potenciais atividades analgésicas e antimicrobianas de extratos metanólicos de algumas espécies marinhas. Contudo, relato na literatura referente às pesquisas voltadas à busca de proteínas ou peptídeos a partir de extratos das espécies aqui citadas é inexistente e por este motivo espécies de corais e alguns endêmicos do litoral brasileiro como Carijoa riisei, Muriceopsis sulphurea, Neospongodes atlantica, Palythoa caribaeorum, Plexaurella grandiflora e Phyllogorgia dilatata foram eleitas para o estudo e busca de moléculas protéicas com atividade antimicrobiana. O filo em destaque neste trabalho é o Cnidaria (do grego knidos, irritante, e do latim aria, sufixo plural) que pode ser representado por animais de corpo mole, que apresentam hemolinfa e barreiras impermeáveis, tais como cutícula ou exoesqueleto, resultando em alta vulnerabilidade aos agentes patogênicos (Hemmrich et al., 2007) apud (Bosch et al., 2009).