Annona glabra Araticum do brejo NI *

Azadiractha indica Nim indiano NI Bryophyllum calycinum Pirarucu NI

Eleutherine plicata Marupazinho 12mm Mammea americana Abricó NI

Psidium guajava Goiabeira 17mm Syzygium aromaticum Cravo-da-índia 18mm

NI= não ocorreu inibição do crescimento do fungo.

O extrato das folhas de Eleutherine plicata foi capaz de inibir o crescimento da Candida albicans com a formação de um halo de inibição de 12mm. Na determinação da concentração inibitória mínima (CIM), o extrato foi ativo até a concentração de 250mg/mL (Figura 16).

FIGURA 16- Halo de inibição de 12 mm do extrato das folhas de Eleutherine plicata (Marupazinho) frente à cepa de Candida albicans.

Na avaliação da atividade antifúngica com o extrato das folhas de Psidium guajava foi observada a formação de um halo de inibição de 17 mm frente à cepa padrão de Candida albicans. Na determinação da concentração inibitória mínima (CIM), o extrato foi ativo até a concentração de 125mg/mL frente ao fungo testado (Figura 17).

FIGURA 17- Halo de inibição de 17 mm das folhas de Psidium guajava (goiabeira) .frente à cepa padrão de Candida albicans.

Com o extrato do Syzygium aromaticum, houve a formação de halo de inibição de 18 mm frente à cepa de Candida albicans (Figura 18) e a concentração inibitória mínima (CIM) foi de 62,5 mg/mL sobre o fungo testado.

Figura 18- Halo de inibição de 18 mm frente à cepa de Candida albicans do extrato de Syzygium aromaticum (cravo-da-índia).

Os demais extratos (Annona glabra, Azadiractha indica, Bryophyllum calycinum e Mammea americana) não apresentaram atividade contra a Candida albicans, mesmo na maior concentração 500mg/mL, uma vez que, em concentrações mais altas, as soluções dos extratos não permitiram uma absorção total nos discos (Figuras 19, 20, 21 e 22).

Figura 19- Ausência de halo de inibição do extrato de Annona glabra (abricó) sobre a cepa padrão de Candida albicans.

Figura 20- Ausência de halo de inibição do extrato de Azadiractha indica (Nim) sobre a cepa padrão de Candida albicans.

Figura 21- Ausência de halo de inibição do extrato de Bryophyllum calycinum (pirarucu) sobre a cepa padrão de Candida albicans.

Figura 22- Ausência de halo de inibição do extrato de Mammea americana (araticum do brejo) sobre a cepa padrão de Candida albicans.

Discos com nistatina (antifúngico convencional) foram utilizados como controle positivo. Houve formação de um halo de inibição de 12mm. Para avaliar a viabilidade do DMSO (dimetil-sulfóxido), foram utilizados discos contendo apenas DMSO, sendo considerado o controle negativo (Figura 23).

N= nistatina DMSO= dimetil-sulfóxido

Figura 23- Discos contendo nistatina (controle positivo) com halo de inibição de 12mm frente à cepa de Candida albicans e discos contendo DMSO (controle negativo) com ausência de halo de inibição.

6

DISCUSSÃO

Um recurso promissor para a descoberta de novos agentes antifúngicos com menores efeitos colaterais são as plantas, usadas na medicina popular, para tratamento de infecções fúngicas, onde os óleos e extratos obtidos há muito tempo têm servido de base para diversas aplicações terapêuticas.

Vários estudos têm apontado excelentes propriedades terapêuticas dos óleos essenciais. Entretanto, nos ensaios sobre a atividade antifúngica, in vitro, dos óleos, é possível verificar uma variedade de metodologias propostas, o que torna a comparação com esses estudos problemática.

Neste estudo, observou-se que os métodos comumente utilizados para avaliar a ação de óleos e extratos vegetais são o de difusão em disco, difusão utilizando cavidades feitas no ágar e diluição em caldo para determinação da concentração inibitória mínima- CIM. Porém, segundo Nascimento et al. (2007), esses métodos são padronizados pela CLSI (National Committee for Clinical Laboratory Standards) e desenvolvido para analisar agentes antimicrobianos, como os antibióticos.

Foi constatado, durante a pesquisa que, nos testes para avaliar a atividade antifúngica de óleos essenciais, a metodologia proposta pelo CLSI não poderia, de fato, ser seguida à risca, corroborando com as citações de Nascimento et al. (2007), devido às propriedades químicas que estes apresentam, como: serem voláteis, insolúveis em água, viscosos e complexos, resultando em difusão irregular dos componentes lipófilos dos óleos e, consequentemente, concentrações desiguais do óleo no ágar.

Visando melhorar a qualidade dos procedimentos com óleos essenciais, tornou-se comum a utilização de solventes, detergentes ou emulsificadores, a exemplo

do Tween 20, Tween 80, DMSO (dimetil-sulfóxido) e etanol, para facilitar a dispersão dos mesmos no meio de cultura (BRUNI et al., 2004; BAYDAR et al., 2004). Baseado nesses achados, optou-se por uma metodologia utilizando cavidades feitas no ágar e difusão em meio sólido, com o auxílio de um agente emulsificador (Tween 80), o qual apresentou melhores resultados, concordando com LIMA et al., 2006 e NUNES et al., 2006.

É lícito ressaltar que, devido à falta de padronização e dificuldade de difusão dos óleos essenciais, estes sejam menos estudados do que os extratos vegetais, apesar de ser constatado, cientificamente, que cerca de 60% dos óleos possuem propriedades antifúngicas e 35% exibem propriedades antibacterianas (OLIVEIRA et al. 2006).

No presente estudo, nenhum dos óleos testados apresentaram atividade antifúngica frente à cepa de Candida albicans, porém fatores importantes como a técnica utilizada, o meio de crescimento, o microrganismo, o material botânico, colheita, técnica de extração e variações genéticas de uma mesma espécie vegetal, podem alterar o teor de princípio ativo presente no óleo. Não invalidando, dessa forma, novos estudos de cunho farmacológico e microbiológico dessas espécies vegetais.

O óleo de copaíba, possui um princípio ativo chamado de beta carofileno, que tem ação germicida (VEIGA e PINTO, 2002) e, portanto, deveria provocar um resultado positivo (produção de halo de inibição), pois a maior ou menor atividade biológica dos óleos essenciais tem se mostrado dependente da composição de seus constituintes químicos como; citral, pineno, cineol, cariofileno, elemento furanodieno, inoneno, eugenol, eucaliptol, carvacrol e outros, que são responsáveis pelas propriedades antissépticas, antibacterianas, antifúngicas e antiparasitárias (CRAVEIRO; ALENCAR; CABANES, 1981; SOUZA et al., 2005).

Entretanto, a ausência de atividade antifúngica do óleo de copaíba está de acordo com os resultados encontrados por Santos et al. (2007), que avaliaram a eficácia do óleo de copaíba frente a diversas bactérias e à Candida albicans. Os resultados mostraram uma excelente atividade do óleo sobre as bactérias, porém não exibiram atividade contra o fungo.

Resultados similares foram registrados por Packer e Luz (2007) que, analisando a eficácia antibacteriana e antifúngica de vários óleos essenciais, inclusive o de andiroba e copaíba, não observaram atividade frente aos microrganismos testados.

Com relação à atividade antifúngica dos óleos de Piper aduncum e Piper hispidinervum, não houve formação de halo de inibição frente à cepa de Candida albicans. Entretanto, não foi encontrada, na literatura consultada, qualquer referência quanto à atividade antifúngica dessas espécies frente aos microrganismos presentes na cavidade oral, apesar de vários estudos demonstrarem excelente potencial dessas espécies como fungicidas (LUNZ et al., 1996; BASTOS et al., 2004; ESTRELA et al., 2006; BASTOS e BENCHIMOL, 2006; SOUZA et al., 2006).

No que diz respeito à avaliação dos extratos, não existe um consenso sobre o nível aceitável, quando comparado com os antimicrobianos padrões (OLIVEIRA et al., 2006).O critério adotado neste estudo foi sugerido por Holetz et al. (2002), baseado nos resultados de CIM.

O extrato das folhas de Annona glabra (araticum do brejo) não apresentou atividade antifúngica frente à cepa testada e, embora essa espécie tenha recebido a atenção de pesquisadores por ser utilizada na medicina popular como inseticida e antimicrobiano (CARVALHO; NASCIMENTO; MULLER, 2001), não foram

encontradas na literatura consultada, pesquisas avaliando o efeito da Annona glabra contra microrganismos de um modo geral e em especial contra Candida albicans.

O extrato de Azadiractha indica, apesar de apresentar um princípio ativo chamado de azadiractin, substância muito utilizada em cosméticos, cremes, loções e creme dental, devido apresentar propriedades anti - virais e anti- bacterianas (BISWAS, 2005) e ser relatado por vários autores como um bom fungicida (SAIRAM, 2000; ARAÚJO et al., 2000; SUBAPRIYA e NAGINI, 2005; FECURY et al., 2006), no presente estudo, não apresentou efeito antifúngico contra Candida albicans.

Esses achados estão de acordo com os encontrados no estudo de Gualtieri et al. (2004), que avaliaram o efeito antimicrobiano do extrato de Azadiractha indica sobre vários microrganismos, inclusive sobre a cepa padrão de Candida albicans (90028) e não apresentou atividade e no estudo de Darães et al. (2005), que também utilizaram cepa padrão não apresentaram eficácia na inibição do crescimento, in vitro, de Candida albicans.

Na verificação da atividade antifúngica do extrato de Bryophyllum calycinum (pirarucu), não foi observada a formação de halo de inibição sobre a cepa de Candida albicans. Entretanto, Nassis et al. (1992); Da Silva et al. (1999) eSousa et al. (2005) relataram várias propriedades medicinais do Bryophyllum calycinum, como: analgésica, antibacteriana, antifúngica e antisséptica, o que justifica a continuação de estudos microbiológicos, com outras cepas, na tentativa de obter resultados que possam contribuir para busca de novos fitoterápicos antimicrobianos.

Na avaliação antifúngica do extrato das folhas de Eleutherine plicata (marupazinho), foi observada a formação de um halo de inibição de 12mm, com uma

concentração inibitória mínima de 250 mg/mL, sendo considerado de acordo com o critério adotado (HOLETZ et al. 2002), um extrato com moderada atividade antifúngica.

Esses achados corroboram com as citações feitas por (ALBUQUERQUE, 1989; VIEIRA, 1992; MORS, 2000 e GONÇALVES, 2005) que ressaltaram a ampla utilização dessa planta na medicina popular, em quase todo o país, principalmente na região Amazônica, sem comprovação científica de sua eficácia.

O extrato das folhas da Mammea americana (abricó) não apresentou eficácia antifúngica sobre a cepa de Candida albicans. Entretanto, em 2000, Mourão relatou excelente propriedade vermífuga do abricó, além de outras propriedades citadas por Araújo (2007), como para o tratamento de afecções cutâneas, o que justifica a continuação do estudo dessa planta com outros microrganismos.

Na avaliação antifúngica do extrato de Psidium guajava (goiabeira), foi constatada uma boa atividade antifúngica frente à cepa de Candida albicans, pois exibiu um halo de inibição de 17 mm e uma concentração inibitória mínima de 125 mg/mL. Esse resultado está de acordo com os achados por Pessini (2003), Ruiz (2006), Alves et al. (2006) e Nair e Chanda (2007), que avaliaram a atividade do extrato de Psidium guajava sobre cepas padrões de Candida albicans e descorda dos achados por Martinez et al. (1997) em que o extrato não apresentou atividade antifúngica.

Mesmo sendo diferentes cepas, concentrações, metodologia e origem das plantas utilizadas nos trabalhos acima citados, os resultados são aceitáveis, devido à falta de padronização dos testes de suscetibilidade antifúngica.

O extrato de Syzygium aromaticum (cravo-da-índia) que apresentou um halo de inibição de 18mm frente à cepa de Candida albicans e uma concentração inibitória

mínima (CIM) de 62,5 mg/mL, sendo considerado um extrato com boa atividade antifúngica, segundo os critérios adotados na pesquisa.

A inibição do crescimento apresentou-se homogênea, de acordo com o grau de concentração do extrato da planta, havendo uma diminuição proporcional dos halos à medida que a concentração do extrato foi diminuindo.

Vários trabalhos (NASCIMENTO et al. 2000; SALVATERRA et al. 2005; TAGUCHI et al. 2005) e, mais recentemente, o de Hem et al. (2007), que avaliaram a eficácia antifúngica do Syzygium aromaticum (cravo-da-índia) frente à cepa de Candida albicans, encontraram resultados similares reforçando a boa atividade antifúngica desse extrato.

Sabe-se que o principal princípio ativo do Syzygium aromaticum é o eugenol, que é um composto fenólico muito utilizado na odontologia como componente de seladores e outros produtos antissépticos de higiene bucal (DELESPAUL et al. 2000; RAINA et al., 2001). Entretanto, em 2007, Hem et al., preocupados com a toxicidade do eugenol na cavidade oral, realizaram um estudo, in vitro, para investigar os efeitos na formação do biofilme. Concluíram que o eugenol apresenta potente atividade, in vitro, contra Candida albicans e com baixa citotoxicidade.

Há necessidade de busca de novos produtos com efeito antifúngico devido ao crescente aparecimento de cepas resistentes aos antifúngicos convencionais e, principalmente, devido aos indesejáveis efeitos colaterais. Os resultados aqui apresentados indicam um potencial efeito antifúngico dos extratos de Eleutherine plicata (Marupazinho), Psidium guajava (goiabeira) e Syzygium aromaticum (cravo-da- índia).

7 CONCLUSÃO

Com base nos resultados encontrados, conclui-se que:

1. Os óleos essenciais de Copaifera multijuga, Carapa guianensis, Piper aduncum e Piper hispidinervum não apresentaram atividade antifúngica sobre a levedura de Candida albicans.

2. O extrato de Syzygium aromaticum (cravo-da-índia) apresentou uma boa atividade antifúngica frente à cepa padrão de Candida albicans.

3. O extrato de Psidium guajava (goiabeira) e de Eleutherine plicata (marupazinho) apresentaram moderada atividade antifúngica.

4. Os demais extratos testados (Annona glabra, Azadiractha indica, Bryophyllum calycinum e Mammea americana) não apresentaram atividade antifúngica frente à cepa padrão de Candida albicans.

Dessa forma, os dados obtidos nesta pesquisa se mostram promissores e podem servir como guia na seleção de plantas com atividades antifúngicas para futuros trabalhos para determinados efeitos toxicológicos e farmacológicos, na perspectiva de uma possível aplicação terapêutica desses produtos.

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