CONSIDERAÇÕES FINAIS
APÊNDICE A METODOLOGIA Seleção de animais
Para o desenvolvimento dos protocolos experimentais apresentados neste trabalho, foram utilizados 90 ratos Wistar (Rattus novergicus) machos, com massa corpórea entre 180 e 200 gramas. Esses animais foram procedentes do Biotério Central do Campus do Pici-UFC, transferidos para o Biotério Setorial do Departamento de Fisiologia e Farmacologia (Faculdade de Medicina-UFC), e mantidos em gaiolas apropriadas, em número máximo de seis animais em cada uma delas. Todos receberam ração comercial balanceada e água à vontade, e permaneceram nas mesmas condições ambientais durante os experimentos, com controle circadiano e térmico adequados. Os protocolos experimentais foram executados seguindo as recomendações de criação e de uso de animais para ensino e pesquisa científica contidas na lei 11.794, de 8 de outubro de 2008 (Lei Arouca). Todos os esforços foram envidados no sentido de se reduzir ao mínimo necessário o número de animais e o sofrimento dos mesmos. Para tanto, os protocolos de execução foram submetidos e aprovados à Comissão de Ética para Uso de Animais (CEUA) da UFC sob número de protocolo 70/13.
Inicialmente, quatro grupos, com uma média de 19 ratos cada um, foram submetidos à ligadura e receberam de Tween 80 (TW80) ou MTR (10, 30 e 90
mg/kg), respectivamente, foram utilizados para análise macroscópica do osso alveolar. A gengiva subjacente à área desafiada foi analisada por ELISA para TNF- e IL-1 ou por atividade de MPO. Em seguida, mais dois grupos de sete animais cada foram submetidos à ligadura, receberam TW80 ou MTR 90 mg/kg e foram
utilizados para análise microscópica.
A Matricaria recutita (MTR) foi coletada em Mandirituba, cidade do estado de Paraná, Brasil (Lote 048351). Seus capítulos florais foram, então, obtidos através da empresa Florien® (São Paulo, Brasil) e submetidos à estelirização e à secagem
através de estufa, seguidas da análise microbiológica, a qual detectou uma quantidade de bolores, de leveduras e de enterobactérias de acordo com o padrão microbiológico preconizado pelo Ministério da Saúde, e demonstrou ausência de
Escherichia coli (coliformes), de Staphylococcus aureus, de Pseudomonas aeruginosas e de Samonella sp. Além disso, flavonoides puderam ser identificados
através do método de colorimetria.
Obtenção do extrato seco de Matricaria recutita
O extrato seco a ser utilizado neste estudo foi fornecido pelo Laboratório de Farmacognosia da Faculdade de Farmácia da UFC, seguindo metodologia padronizada.
Para a preparação do referido extrato, flores secas e rasuradas de Matricaria
recutita L. foram submetidas à extração com etanol por soxhlet durante 6 horas. A
seguir, o extrato líquido obtido (droga vegetal:solvente - 1:1) foi submetido à secagem por spray-drying (LABMAQ, Brasil), com emprego de dióxido de silício na concentração de 30% em relação ao resíduo sólido (6,17%) do extrato etanólico, produzindo-se, ao final, um extrato seco.
A análise do teor de apigenina-7-glicosídeo (princípio ativo/marcador) no extrato seco de camomila foi realizada por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) (Alliance Waters, USA), seguindo método validado previamente no Centro de Estudos Farmacêuticos e Cosméticos (CEFAC)/DEFA/FFOE (Leal et al., 2009).
Antes das análises, as amostras foram filtradas em aparato de filtragem (Millipore, EUA) contendo membrana filtrante de 0,45µm de poro (Millipore, EUA). A determinação do teor do referido marcador no extrato foi realizada com auxílio da curva de calibração construída com emprego de padrão externo (apigenina 7- glicosídeo: ≥97.0% pureza, Sigma-Aldrich, USA).
Os dados obtidos foram submetidos à análise de regressão linear que permitiu determinar a equação da reta, bem como o coeficiente de correlação, (r>0,99) comprovando a linearidade do método (Figura 1). Na análise cromatográfica
do extrato seco, foram empregadas três réplicas, e os resultados estão expressos como média ± desvio padrão (DP), e coeficiente de variação (CV: DP/média x 100).
Figura 1. Curva de calibração da apigenina-7-glicosídeo, marcador químico padronizado no extrato seco de Matricaria recutita utilizado no presente estudo.
Na Figura 2 pode ser observado o cromatograma do extrato seco de camomila, com detecção da apigenina-7-glicosídeo (Tempo de retenção: 23,3min). A concentração do presente marcador químico no extrato de camomila foi de 128,5 ± 0,99 (0,77) mg de apigenina/g de extrato seco.
Figura 2. Cromatograma original do extrato seco de Matricaria recutita com detecção da apigenina-7- glicosídeo/marcador químico.
Foi utilizado o modelo de periodontite descrito anteriormente (Crawford et al., 1978; Sallay et al., 1982; Samejima et al., 1990) e modificado por Lima et al. (2000). Este consistiu em inserir um fio de sutura de náilon 3.0, em torno do segundo molar superior esquerdo de um rato sob anestesia com xilazina e ketamina (90 e 10 mg/kg, i.m., respectivamente). Previamente à passagem do fio, uma guia foi utilizada nos espaços interproximais mesial e distal do dente citado (Figura 3A). Logo em seguida, o fio foi passado (Figura 3B), de forma que o nó cirúrgico ficou voltado para a face vestibular da boca do rato (Figura 3C). Os animais foram mortos no 11o dia, dia de pico de perda óssea determinado anteriormente (Lima et al., 2000; Lima et al., 2004).
Figura 3. Protocolo de indução da periodontite. Inicialmente, passa-se uma agulha como guia nos espaços
interproximais mesial e distal do segundo molar superior esquerdo (A). Em seguida, passa-se o fio de náilon (B) e dá-se um nó (C), o qual será voltado para a face vestibular.
Grupos experimentais
A Matricaria recutita foi utilizada no modelo de ligadura em ratos. Dessa forma, seguiram-se os seguintes grupos controles ou de tratamentos:
- Grupo Controle para Periodontite
Os animais deste grupo, denominado Tween 80 (TW80), foram submetidos à
periodontite induzida através da ligadura, conforme descrito anteriormente, e receberam TW80 a 4% (v.o.) (2 ml/kg) 30 minutos antes do procedimento cirúrgico e
diariamente até o dia do sacrifício, no 11º dia pós-periodontite.
- Grupos com periodontite tratados com a Matricaria recutita (MTR)
Os animais foram divididos em três subgrupos, denominados MTR, os quais receberam, por gavagem, a MTR nas doses de 10, 30 e 90 mg/kg, respectivamente. As doses utilizadas neste estudo foram baseadas no estudo de Cemek et al., 2008. A MTR foi administrada 30 minutos antes da instalação do fio e após esta, diariamente, até o 11º dia. Para sua administração diária, o extrato seco de MTR foi diluído em TW80.
Análise macroscópica do tecido ósseo
No 11º dia seguido do procedimento cirúrgico, os animais foram sacrificados e suas maxilas removidas e fixadas em formol a 10% durante 24 horas. A seguir, as maxilas foram separadas em duas hemiarcadas, dissecadas e coradas com azul de metileno a 1% com o objetivo de discriminar o osso dos dentes, os quais se coram em menor intensidade (Lima et al., 2000; Lima et al., 2004). Para a quantificação da reabsorção óssea, as duas hemiarcadas foram acomodadas com massa de modelar em lâminas para posterior fotografia em câmera digital (Sony Cyber-Shot®, modelo DSC-W170; Hong Kong, Japan). A área reabsorvida foi medida em um programa de computador, o Image JTM (ImageJ 1.32j, National Institute of Health; EUA),
considerando a demarcação desde a ponta de cúspide até a borda óssea remanescente, subtraída da respectiva área da hemiarcada contralateral normal. Essa área foi comparada à outra previamente conhecida (5 x 5 mm2) (Lima et al.,
2000; Lima et al., 2004; Goes et al., 2010).
Figura 4. Desenho esquemático da mensuração da perda óssea alveolar na análise macroscópica. Linha
vermelha demarcando a área entre a junção cemento-esmalte e a borda óssea remanescente de hemiarcadas esquerda e direita. A região sob a linha amarela corresponde à área de reabsorção óssea alveolar obtida. Esta área obtida em pixel será comparada com uma área previamente conhecida de um quadrado milimetrado, que é fotografado junto com a hemiarcada.
As análises microscópicas foram realizadas em cortes seriados da hemiarcada. Para tanto, o mesmo protocolo de indução da periodontite foi realizado em grupos adicionais de animais, a saber, TW80 e MTR 90 mg/kg. Após o sacrifício
dos animais no 11ºdia experimental, as hemiarcadas foram removidas e fixadas em formol a 10% por 24 horas. A seguir, foram submetidas à desmineralização em EDTA a 10% por aproximadamente 30 dias. Posteriormente, as hemiarcadas foram neutralizadas em banho de água corrente por 24 horas, e processadas para inclusão em parafina. Foram feitos cortes seriados de 3-4 m em micrótomo apropriado e as lâminas obtidas foram coradas pelo método Hematoxilina-Eosina (HE).
Análise histométrica
A área da furca do segundo molar foi considerada para avaliação histométrica. Para tal, as imagens foram obtidas dessa região em um microscópio (x100) e lançadas em um programa de computador (Infinity AnalyzeTM). A quantificação da perda óssea alveolar na área da furca foi obtida considerando o ponto mais alto da crista do tecido ósseo remanescente e a superfície do dente, conforme demonstrado abaixo. O valor correspondente à área de perda óssea nesta região foi calculado através do referido software onde as imagens foram obtidas diretamente do microscópio (Nikon Eclipse, Modelo H550S, Made in Japan).
Figura 4. Desenho esquemático (x100) da mensuração da perda óssea alveolar na análise histométrica.
superfície do dente. O valor correspondente a esta área é calculado através de um software (Infinity AnalyzeTM)
que obtém as imagens diretamente do microscópio (Nikon Eclipse, Modelo H550S, Made in Japan).
Análise histológica
Para a análise histológica das hemiarcadas, a região entre os 1º e 2º molares foi considerada. Para tanto, foram avaliados os aspectos inflamatórios, como presença/intensidade de infiltrado celular e de osteoclastos, além do estado de preservação do processo alveolar e do cemento, atribuindo-se escores que variarão de 0 a 3, de acordo com a intensidade destes achados (Lima et al., 2000): Escore 0: Infiltrado celular ausente ou discreto; escassos ou raros osteoclastos; processo alveolar preservado; cemento preservado. Escore 1: Infiltrado celular moderado; presença de alguns osteoclastos; pequena reabsorção do processo alveolar; cemento preservado. Escore 2: Infiltrado celular acentuado; presença de grande número de osteoclastos; processo alveolar com reabsorção acentuada; destruição parcial de cemento. Escore 3: Infiltrado celular acentuado; presença de um número aumentado de osteoclastos; processo alveolar ausente; destruição total do cemento.
Análise imunohistoquímica para detecção de RANKL/ OPG/TRAP
Para tal análise, os mesmos blocos utilizados na análise histológica foram cortados em cortes seriados (4µm) em lâminas com poli L-lisina (Probe on Plus®) adequadas para a técnica de imunohistoquímica. Inicialmente, os cortes seriados foram desparafinizados em estufa a 37 °C e hidratados à temperatura ambiente por meio de imersões conseguintes em xilol, álcool 95% e água destilada, em determinados períodos de tempo para cada solução, para, em seguida, serem imersos em solução tamponada 0,1M (tampão de citrato, ph 6,0) sob aquecimento a 100 °C, por 15 minutos.
Após o resfriamento em temperatura ambiente durante 20 minutos, foram feitas incubação em peróxido de hidrogênio a 3 %, para bloqueio da peroxidase endógena, intercaladas por lavagens com solução tamponada de fosfato (PBS), a fim de se obter o bloqueio das ligações proteicas inespecíficas.
Posteriormente, a incubação com um dos anticorpos primários anti-RANKL, anti-OPG ou anti-TRAP foi feita durante a noite (overnight), por 18 horas, a 4 °C. Após a lavagem no dia seguinte, foi feita incubação com anticorpo (secundário) biotinilado anti-IgG, por 30 minutos, à temperatura de 22 °C a 25 °C. Durante esse
período, o complexo ABC foi preparado para incubação posterior, conforme instruções do fabricante.
Após nova lavagem com PBS, foi realizada a revelação da reação através de uma coloração utilizando o cromógeno 3,3 diaminobenzidina DAB/peróxido, por 2 a 3 minutos, à temperatura ambiente. A reação foi interrompida com água destilada e as lâminas foram contra-coradas por hematoxilina de Harry por 15 segundos, à temperatura ambiente.
Os controles negativos foram processados simultaneamente como descritos acima, sendo que o primeiro anticorpo foi substituído por PBS-BSA 5%. Nenhum dos controles negativos mostrou imunorreatividade para RANKL, OPG e TRAP. Por fim, foi realizada a desidratação em uma série de concentrações de alcoóis, e clareamento em xilol das amostras e finalmente, as respectivas montagens das lâminas e lamínulas.
Dosagem sérica de Fosfatase Alcalina Óssea (FAO)
Antes da indução da periodontite (dia zero), bem como na ocasião do sacrifício (dia 11), em todos os subgrupos de animais utilizados para análise macroscópica, foram coletadas amostras de sangue, e a atividade osteoblástica foi avaliada através da dosagem indireta da isoforma óssea da Fosfatase Alcalina Total (FAT), a FAO. A quantificação foi feita utilizando a metodologia da inativação térmica de amostras (Moss; Whitby, 1975), através de “Kits” do fabricante LABTEST (Labtest, Lagoa Santa-MG, Brasil). O procedimento de dosagem de Fosfatase Alcalina total foi realizado seguindo a metodologia a seguir:
Após a identificação dos tubos de ensaio em Branco, Amostra e Padrão, adiciona-se em todos os tubos a quantidade de β50 μl do tampão e β5 μl de substrato. Posteriormente, adicionou-se β5 μl da amostra nos tubos assim identificados e β5 μl de padrão no tubo assim identificado inicialmente. Após homogeneização, todos os tubos devem ser submetidos ao aquecimento indireto a 37 ºC por 10 minutos. Em seguida, adiciona-se 1 ml do reagente de cor em todos os tubos para que sejam efetuadas as leituras espectrofotométricas em 590 nm. A fosfatase alcalina óssea é determinada pela diferença da dosagem da fosfatase alcalina total (constituída pelas isoformas: hepática, entérica e óssea) subtraída da
dosagem realizada com a amostra aquecida a 56 ºC por 10 minutos, seguindo a mesma sequência de passos descritos acima.
Atividade da mieloperoxidase (MPO) no tecido gengival
Após o sacrifício dos animais utilizados para análise macroscópica, delicadamente foram removidas amostras do tecido gengival subjacente à área desafiada da hemiarcada esquerda de todos os grupos experimentais (TW80,
MTR10, 30 e 90 mg/kg), assim como da hemiarcada contralateral controle do grupo TW80, mantidas a -80 ºC em freezer e, posteriormente, homogeneizadas e
processadas para a análise em Leitor Automático de Placas (tipo ELISA) da atividade da mieloperoxidase, enzima abundante nos grânulos azurófilos dos neutrófilos. Essa enzima tem sido utilizada como um marcador quantitativo da infiltração de neutrófilos ativos nos processos inflamatórios em vários tecidos, e seguimos protocolo conforme metodologia descrita por Lima et al. (2005), baseada em Bradley et al., 1982.
Assim, o tecido gengival foi pesado e triturado em solução contendo NaCl (100 mM), EDTA (15 mM) e NaPO4 (20 mM) e o homogenato foi centrifugado a 4 oC
por 15 minutos (3 g). O pellet foi, então, submetido a solução hipotônica [900 µl de NaCl a 0.2%; 900 µl de NaCl a 1,6%; 900 µl de glicose 5%] e novamente centrifugado a 4 oC por 15 min (3 g). O pellet final foi resuspendido em solução
contendo NaPO4 a 50 mM e hexadecil-trimetil-brometo de amônio (H-TAB), e homogeneizado a 4 oC por 15 min (10 g). O sobrenadante foi usado para o ensaio
de MPO usando tetrametilbenzidina (1,6 mM) e H2O2 (0,5 mM), e a concentração de
MPO foi determinada em absorbância de 450 nm.
Os valores foram expressos em atividade de MPO por miligrama de gengiva comparada à curva padrão construída utilizando neutrófilos peritoneais de ratos. Para alcançar este objetivo, a migração de neutrófilos foi induzida por injeção intraperitoneal de carragenina em ratos (300 µg por animal). Uma curva padrão relativa de neutrófilos (>90% de pureza) e os números de absorvância foram obtidos por processamento de neutrófilos purificados, como descrito acima, e o ensaio da atividade de MPO foi realizado.
Análise de ELISA para TNF- e IL-1β
A análise de Elisa foi utilizada para quantificar os níveis de TNF- e IL-1 . Para tanto, o mesmo protocolo de indução da perda óssea foi novamente realizado em grupos de animais adicionais, contendo 10 ratos cada, e após o sacrifício no 11° dia, delicadamente foram removidas amostras do tecido gengival subjacente à área desafiada da hemiarcada esquerda de todos os grupos experimentais (TW80,
MTR10, 30 e 90 mg/kg), assim como da hemiarcada contralateral controle do grupo TW80, mantidas a -80 ºC em freezer até o momento da análise. Para a realização do
referido ensaio, o tecido coletado foi homogeneizado em tampão PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8,1 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4, pH 7,2 – 7,4) e processado
como descrito por Safieh-Garabedian et al. (1995).
A detecção de TNF- e IL-1 foi determinada no sobrenadante do macerado da amostra por Elisa (Cunha et al., 1993). Placas de 96 poços foram incubadas por 12 h a 4 °C com anticorpo anti-TNF- ou anti-IL-1 . Após sensibilização das placas, as amostras serão adicionadas em duplicata e a curva padrão será adicionada em várias diluições e incubadas por 2 h a 4 ºC. As placas serão então lavadas três vezes com solução tampão PBS/Tween-20 (0,05% SIGMA) e incubadas com anticorpo monoclonal biotinilado anti-TNF-α ou anti-IL-1 (1:1000 com BSA/Tween 1%). Após o período de incubação à temperatura ambiente por 1 h, as placas foram lavadas e 50 μL do complexo HRP-estreptavidina diluído 1:5000 foram adicionados. Decorridos 15 minutos, o reagente de cor o-fenilenodiamina (OPD, 50 μL) foi adicionado e as placas foram incubadas na ausência de luz a 37 ºC por 15 a 20 min. A reação enzimática foi interrompida com H2SO4 (1M) e a densidade óptica será
medida a 490 nm em espectrofotômetro para TNF- e IL-1 . As concentrações das citocinas contidas nas amostras foram calculadas a partir de uma curva padrão com 11 pontos, obtida por diluição seriada, sendo as concentrações iniciais de 4000 pg/mL. O resultado foi expresso em picograma de citocinas.
Análise dos parâmetros sistêmicos Estudos hematológicos
A anestesia dos animais foi feita utilizando-se utilizando-se xilazina e ketamina (90 e 10 mg/kg, i.m., respectivamente). Em seguida, seccionou-se a ponta da cauda do animal com uma tesoura. A primeira gota de sangue foi desprezada e a seguinte foi colhida para a confecção do esfregaço corado pelo método H&E para as contagens diferenciais. Adicionalmente, 20 l de sangue foram diluídos em 380 l de Líquido de Turk, para a realização da contagem do número total de leucócitos, utilizando câmara de Neubauer. Logo após, os animais tiveram suas caudas cauterizadas, para evitar eventuais infecções. Os hemogramas foram realizados imediatamente antes da cirurgia e no 11º dia experimental.
Avaliação das condições hepáticas
Nos dias 0 e 11, foram coletadas, foram coletadas amostras de sangue e as alterações hepáticas dos animais foram investigadas através da determinação da atividade sérica das enzimas transaminases aspartato aminotransferase (AST) e alanino aminotransferase (ALT). A quantificação foi realizada utilizando-se “Kits” específicos para cada tipo de dosagem. A metodologia seguiu orientação do laboratório fabricante (Labtest®). Para tanto, alíquotas de 50 μl da amostra foram
incubadas em banho-maria a 37 ºC por 60 minutos para AST, ou 30 minutos para ALT. Em seguida, foram adicionados β50 μl do reagente de cor e β,5 ml de solução NaOH. Posteriormente foi determinada diretamente em espectrofotômetro a leitura das absorbâncias utilizando comprimento de onda de 505 nm.
No sacrifício, o fígado dos animais foi removido e pesado. Os valores foram expressos como o índice do respectivo órgão (peso úmido do órgão dividido pelo peso do animal no dia do sacrifício) (Silva et al., 2010).
Avaliação das condições renais
Nos dias 0 e 11, foram coletadas, foram coletadas amostras de sangue e as alterações renais dos animais foram investigadas através da determinação da atividade sérica ureia e creatinina. A quantificação foi realizada utilizando-se “Kits” específicos para cada tipo de dosagem. A metodologia seguiu orientação do laboratório fabricante (Labtest®). Para determinação dos níveis séricos de ureia, alíquotas de 10 μl da amostra foram adicionadas a 1 ml de urease tamponada e incubadas em banho-maria a 37 ºC por 5 minutos, em seguida foi adicionado 1 ml da solução oxidante, posteriormente foi determinada diretamente em espectrofotômetro
a leitura das absorbâncias utilizando comprimento de onda de 600 nm. Para determinação dos níveis séricos de creatinina, alíquotas de 1β5 μl da amostra foram adicionadas a β50 μl de ácido pícrico e 1 ml de solução tampão. Em seguida, foram incubadas em banho-maria a 37 ºC por 10 minutos. Após esse período, foi realizada uma primeira leitura em espectrofotômetro com comprimento de onda de 510 nm. Em seguida foi adicionado 50 μl de solução acidificante para a realização de uma nova leitura das absorbâncias.
No sacrifício, o rim dos animais foi removido e pesado. Os valores foram expressos como o índice do respectivo órgão (peso úmido do órgão dividido pelo peso do animal no dia do sacrifício) (Silva et al., 2010).
Avaliação da condição esplênica
No sacrifício, o baço dos animais foi removido e pesado. Os valores foram expressos como o índice do respectivo órgão (peso úmido do órgão dividido pelo peso do animal no dia do sacrifício) (Silva et al., 2010).
Análise da variação de massa corpórea
Todos os animais tiveram suas massas corporais medidas antes dos procedimentos cirúrgicos e, após estes, diariamente, durante todo o período experimental. Os valores encontrados foram expressos como a variação de massa corpórea (g), em relação à massa inicial.
Aspectos Éticos
Todos os protocolos indicados nesse projeto foram submetidos e aprovados pela Comissão de Ética para Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal do Ceará, sob o número 70/13. Os pesquisadores envolvidos se comprometeram em envidar todos os esforços para reduzir ao mínimo o número de animais a serem utilizados, bem como o sofrimento dos mesmos, de acordo com os princípios éticos para se trabalhar com animais de laboratório.
Os resultados paramétricos foram expressos para comparações entre os grupos serão utilizados Análise de Variância (Anova) seguido pelo teste de Bonferroni. Os dados não paramétricos foram expressos como Mediana seguida dos seus valores extremos de rol, e os testes estatísticos aplicados serão Kruskal-Wallis e Dunn. Em todas as situações, foi adotado o nível de significância p<0,05.