Aplicação dos marcadores DArT na análise filogenética

Para avaliar o desempenho potencial da tecnologia DArT especificamente em estudos de filogenia, 3.723 marcadores DArT referentes à genotipagem das 17 espécies de Pinus foram selecionados para a análise filogenética. As análises com inferência bayesiana e máxima parcimônia revelaram o mesmo perfil de distribuição das espécies no filograma (Figura 2.12 A-B).

As espécies analisadas agruparam-se em cinco grupos filogenéticos, com valor de bootstrap e probabilidade posterior igual a 100%, (Figura 2.12). As espécies Pinus ayacahuite e Pinus

chiapensis, como esperado, posicionaram em um grupo mais distante (Figura 2.12). Essas

espécies pertencem ao subgênero Strobus, seção Quinquefoliae, subseção Strobus (Tabela 2.9) (Gernandt, López et al., 2005), subgênero diferente das demais espécies, sendo

84

consideradas, portanto, como grupo externo. A espécie Pinus kesiya agrupou-se em um clado distinto (Figura 2.12), condizente com sua classificação taxonômica atual, na qual faz parte do subgênero Pinus, seção Pinus, subseção Pinus (Tabela 2.9). De acordo com a árvore filogenética, os subgêneros Pinus e Strobus apresentam um ancestral comum, corroborando a história evolutiva dessas espécies (Figura 2.13), provavelmente originárias de uma espécie extinta da família Pinaceae (Pitystrobus) (Millar e Kinloch, 1991) (Figura2.13).

Conforme esperado, os dados DArT revelam que as demais espécies analisadas formam um grupo monofilético. De acordo com as classificações taxonômicas existentes, estas espécies pertencem a uma mesma seção do subgênero Pinus, denominada Trifoliae (Gernandt, López

et al., 2005) ou New World Diploxylon Pines (Price, Liston et al., 1998) (Figura 2.12, Tabela

2.9). De acordo com Millar e Kinloch (1991) esta seção originou-se provavelmente da seção

Sylvestres, a aproximadamente 136 milhões de anos atrás, no cretáceo (Figura 2.13).

Entretanto, as classificações taxonômicas desta seção, em nível de subseção, diferem nas distintas propostas da literatura. Exceção feita para a espécie Pinus maximinoi, posicionada em um grupo a parte (Figura 2.12) dentro dessa seção. A separação desta espécie das demais é consistente com o que foi proposto por Price et al. (1998) e Gernandt et al. (2005) onde Pinus maximinoi é membro da subseção Ponderosae (Tabela 2.9).

Em relação às demais espécies da seção Trifoliae, Gernandt et al. (2005) propôs que as mesmas pertençam a uma única subseção, Australes (Figura 2.12). Anteriormente, Price et

al. (1998) classificaram essas espécies em três subseções diferentes, Oocarpae, Leiophylla e Australes (Figura 2.12). A classificação proposta por Price et al. (1998) é baseada na união de

dois grandes trabalhos, o de Little e Critchfield (1969), que organizaram todas as classificações propostas anteriormente em uma única nomenclatura, e o de Krupkin et al. (1996), que classificaram o gênero Pinus através da comparação de sequências de DNA de cloroplasto (cpDNA). Já a classificação proposta Gernandt et al. (2005) é baseada na relação filogenética revelada por estudos com sequências de DNA de cloroplasto (matK e rbcL), sendo consistente com características morfológicas tradicionais, mas diferindo consideravelmente da classificação padrão anterior utilizada por Little e Critchfield (1969).

85

Fazendo um paralelo entre a classificação de Price et al (1998) e aquela revelada pela análise com marcadores DArT, observou-se que os dados DArT revelam uma maior proximidade entre Pinus leiophylla e Pinus herrerae, pertencentes a subseções diferentes (Leiophyllae e

Oocarpae respectivamente), do que entre Pinus herrerae e Pinus tecunumanii, pertencentes

à mesma subseção, sugerindo portanto que Pinus leiophylla pertença à mesma subseção de

Pinus herrerae e Pinus tecunumanii (Figura 2.12 e Tabela 2.9). Outro caso de posicionamento

filogenético conflitante entre as classificações taxonômicas existentes é o da espécie Pinus

teocote. Esta espécie já foi classificada por Little e Critchfield (1969) e outros autores, como

membro da subseção Ponderosae. Perry (1991) em uma nova proposta classificou Pinus

teocote e Pinus herrerae como membros da subseção Teocote. Já Price et al. (1998), a partir

de observações de Krupkin et al. (1996), classificou Pinus teocote e Pinus herrerae como membros do grupo Teocote, dentro da subseção Oocarpae (Tabela 2.9). Os dados DArT revelam uma proximidade genética entre Pinus teocote e Pinus herrerae, mas não evidenciam uma potencial existência de um agrupamento específico que os coloque em um grupo a parte das demais espécies no ramo (Figura 2.12). Essa observação é consistente com a classificação mais recente proposta por Gernandt et al. (2005) que apresenta P. teocote na seção Australes juntamente com P. herrerae sem qualquer indicativo de subseção ou agrupamento. A espécie Pinus tecunumanii já foi considerada no passado por alguns autores como uma subespécie de Pinus patula. Os dados DArT corroboram os resultados obtidos por Furman et al. (1997) com marcadores RAPD, onde Pinus tecunumanii de fato se mostrou como um táxon distinto de Pinus patula.

86

Figura 2.12- Filograma das 17 espécies do gênero Pinus gerado a partir de 3.723 marcadores DArT posicionado em relação à classificação taxonômica proposta por Price et al. (1998) e Gernandt et al. (2005). (A) Análise com inferência bayesiana utilizando o programa MrBayes; (B) Análise de máxima parcimônia com reponderação utilizando o programa PAUP (3.362 marcadores informativos, consistência CI=0,91, homoplasia HI=0,07, retenção RI=0,93). As espécies Pinus ayacahuite e Pinus chiapensis foram selecionadas como grupo externo.

87

Tabela 2.9 – Classificação taxonômica das 17 espécies do gênero Pinus de acordo com Price et al. (1998) e Gernandt et al. (2005).

Taxonomia Geral Subgênero Seção

Subseção Espécies Sensu Price et al. (1998) Sensu Gernandt et al. (2005)

Reino Plantae Subgênero Pinus

(Diploxylon)

Trifoliae (Gernandt et al. (2005))

Australes Australes Pinus taeda

Divisão Pinophyta Australes Australes Pinus elliottii

Classe Pinopsida (Yellow ou hard

pines) New World Diploxylon

Pines (Price et al. (1998))

Australes Australes P. elliottii x P. c. hondurensis

Ordem Pinales Australes Australes Pinus caribaea var. bahamensis

Família Pinaceae Australes Australes Pinus caribaea var. caribaea

Gênero Pinus Australes Australes Pinus caribaea var. hondurensis

Oocarpae

(teocote grupo) Australes Pinus teocote

Oocarpae

(oocarpa grupo) Australes Pinus pringlei

Oocarpae

(oocarpa grupo) Australes Pinus patula

Oocarpae

(oocarpa grupo) Australes Pinus greggii

Oocarpae

(teocote grupo) Australes Pinus herrerae

Leiophyllae Australes Pinus leiophylla

Oocarpae

(oocarpa grupo) Australes Pinus tecunumanii

Ponderosae (pseudostrobus

grupo)

Ponderosae Pinus maximinoi

Pinus Pinus Pinus Pinus kesiya

Subgênero Strobus

(haploxylon)

Quinquefoliae (Gernandt et

al. (2005)), Strobus (Price et al. (1998))

Strobi Strobus Pinus ayacahuite

88

Segundo Furman et al. (1997) e Dvorak et al. (2000), as subseções propostas por Price et al. (1998), Oocarpae e Australes, possuem uma relação evolutiva próxima, derivando de um mesmo ancestral comum (Figura 2.12 e Figura 2.13). Segundo Millar e Kinloch (1991), a subseção Oocarpae originou-se da subseção Australes a aproximadamente 38 milhões de anos atrás, no eoceno (Figura 2.13). Estudos com RAPD de Dvorak et al. (2000) indicaram que Pinus caribaea var. hondurensis, classificado por Price et al. (1998) como subseção

Australes, compartilha uma ligação evolutiva próxima com Pinus tecunumanii pertencente à

subseção Oocarpae, maior até do que entre espécies da mesma subseção (Figura 2,12 e Figura 2.14). Dvorak et al. (2000) relatam também que existem fortes evidências de hibridação natural entre as espécies da subseção Oocarpae e Australes, principalmente entre Pinus caribaea var. hondurensis e Pinus tecunumanii. Essas observações são consistentes com os resultados relevados pelos marcadores DArT, sugerindo que as duas subseções são na verdade dois grupos a parte, descendendo um do outro e pertencendo cada um a uma subseção, assim como proposto por Price et al. (1998). Além disso, os dados DArT sugerem que Pinus leiophylla, proposto por Price et al. (1998) como outra subseção, faça parte da subseção Oocarpae.

89

Figura 2.13. Hipótese filogenética do aparecimento do Gênero Pinus, mostrando sua origem a partir de Pityostrobus na era Mesozoica e sua divergência ao longo do tempo geológico em subgêneros, seções e subseções. Setas destacando as subseções analisadas neste trabalho. Círculo: destaque para a seção New World Diploxylon Pines. Pa= Paleoceno; E= Ecoceno; O=Oligoceno; M= Mioceno; Pl= Pleoseno; Q= Quartenário. Fonte: (Millar e Kinloch, 1991; White, Adams et al., 2007).

90

Outro dado que chama a atenção é a separação filogenética, com forte suporte estatístico (bootstrap a 100%), de Pinus taeda das demais espécies da subseção Australes (Figura 2.12 e Figura 2.14 – biblioteca P.taeda x P. elliottii). Interessante observar, que na classificação mais recente de Gernandt et al. (2005) Pinus taeda, apesar de, segundo ele, pertencer à subseção

Australes, aparece como membro de um grupo monofilético com outras três espécies do

leste da América do Norte. Além disso, não existem relatos na literatura de hibridização de

Pinus taeda com nenhuma das espécies da subseção Australes com exceção de P. rigida

(Pitch pine), P. echinata (Shortleaf pine), P. palustris (Longleaf pine) e P. elliottii (Slash pine) todas estas espécies que ocorrem na região sudeste da América do Norte (Neale, 2007). Entretanto, a árvore consenso apresentada por Gernandt et al. (2005) não revela detalhes finos da divisão desses grupos. Os dados de 3273 marcadores DArT juntamente com as informações de hibridização sugerem a possibilidade de que P. taeda e suas espécies norte americanas próximas venham a ser classificadas em outra subseção no futuro, mas para isso é necessário um estudo mais amplo com maior número de espécies da américa do norte.

91

Figura 2.14- Filogramas das espécies do subgênero Pinus obtidos pela análise de diferentes conjuntos de marcadores, de acordo com a biblioteca de origem (2112 marcadores DArT da biblioteca com representações genômicas de P. taeda x P. elliottii, 1135 da biblioteca espécies de Pinus e 476 da biblioteca P. taeda árvore-elite) (A) Filogramas gerados a partir da inferência bayesiana utilizando o programa MrBayes; (B) Filogramas gerados a partir de critérios de máxima parcimônia com reponderação.

92

Visando verificar algum possível viés nas análises filogenéticas como resultado da origem dos marcadores em termos das bibliotecas, marcadores derivados de cada biblioteca foram analisados separadamente utilizando apenas os dados das espécies do subgênero Pinus. As análises com inferência bayesiana e máxima parcimônia revelaram padrões similares (Figura 2.14 A-B). Também não foi observada diferença nos filogramas obtidos com os três subconjuntos de marcadores (Figura 2.12), sendo possível observar a separação com alto suporte estatístico de Pinus kesia, seção Pinus, das outras espécies da seção Trifoliae e das subseções Ponderosae, Oocarpae e Australes. Esta separação é bem evidenciada na análise com os marcadores da biblioteca P. taeda x P. elliottii. A biblioteca P. taeda x P. elliottii foi a biblioteca que apresentou maior apoio de ramo, com 100% de bootstrap. Isso se deve, provavelmente, ao maior número de marcadores informativos e por esta biblioteca possuir representações genômicas obtidas a partir de três combinações enzimáticas diferentes (PstI+TaqI, PstI+BstNI e PstI+TaqI+MseI). A biblioteca P. taeda árvore-elite foi a biblioteca que revelou menor apoio dos ramos na separação das espécies da subseção Oocarpae e

Australes, provavelmente devido à uma menor diversidade de sequências e consequente

baixo número de marcadores informativos (Figura 2.14-B), por possuir representação genômica apenas da espécie Pinus taeda. Apesar disso, é possível observar uma separação das espécies das subseções Oocarpae das espécies de Australes.

As análises realizadas neste trabalho com base em 3.273 marcadores DArT, são portanto, mais consistentes com a classificação original publicada por Price et al. (1998) que propõe a existência de duas subseções separadas, Australes à qual P. taeda, P. eliottii e P. caribaea e suas variedades pertenceriam e a Oocarpae na qual P. herrerae, P. leiophylla, P. pringlei, P.

patula, P. teocote, P. greggii e Pinus tecunumanii, tipicamente pertencentes à América

Central, seriam enquadradas. Em outras palavras, ao amostrar o genoma nuclear e possivelmente extra nuclear, de uma forma muito mais ampla do que estudos anteriores, baseados em sequências consideravelmente limitadas de regiões do DNA de cloroplasto e DNA ribossomal, os dados moleculares levantados neste trabalho propõem uma volta à classificação de Price et al. (1998), com exceção do posicionamento filogenético de Pinus

leiophylla, não sendo mais considerado como membro da subseção Leiophyllae. Para validar

esta proposta será interessante ampliar a amostragem de espécies de Pinus, especialmente de espécies norte-americanas dentro da subseção Australes, para potencialmente resolver

93

esta questão de uma forma mais definitiva. Claramente, o microarranjo DArT desenvolvido neste trabalho representa uma ferramenta potente para estudos filogenéticos, particularmente para aumentar a resolução em níveis taxonômicos mais altos, assim como foi observado para espécies de Eucalyptus (Steane et al. 2011). O microarranjo DArT poderá ser altamente útil para estudos que visem a diferenciação dentro e entre espécies, a detecção de fluxo gênico e introgressão natural em condições de campo ou a verificação de híbridos de cruzamentos controlados em programas de melhoramento. Além disso, caso as sondas DArT que revelaram polimorfismo venham a ser sequenciadas e anotadas, a informação de sequência juntamente com a de polimorfismo poderá ser utilizada para estimar filogenias separando dados derivados de regiões gênicas e regiões presumivelmente neutras.

94

CAPÍTULO 3 - CONSTRUÇÃO DE UM MAPA GENÉTICO DE ALTA DENSIDADE

PARA Pinus taeda UTILIZANDO GENOTIPAGEM POR SEQUENCIAMENTO DArT-

SEQ E MICROSSATÉLITES

3.1 INTRODUÇÃO

Mapas genéticos de alta densidade e ampla cobertura do genoma, têm se tornado uma ferramenta central para investigar a organização do genoma, para aumentar a resolução do mapeamento de QTLs e fornecer uma estrutura de marcadores capaz de auxiliar o ordenamento de segmentos de sequência durante a montagem de genomas. Apesar dos avanços da genômica, ainda existe uma carência de mapas genéticos de alta densidade e tecnologias de genotipagem de alto desempenho capazes de cobrir amplamente o genoma de Pinus taeda (Neale, 2007). Marcadores como RAPDs, AFLPs, RFLPs, ESTPs, SSRs e SNPs foram largamente utilizados na construção de mapas genéticos para P. taeda (Grattapaglia, P Wilcox et al., 1991; Devey, Fiddler et al., 1994; Remington, Whetten et al., 1999; Temesgen, Brown et al., 2001; Eckert, Pande et al., 2009; Echt, Saha, Krutovsky et al., 2011). Entretanto, a densidade desses mapas em termos de número de marcadores ainda é limitada e insuficiente para fornecer informações para aplicações que demandam uma amostragem ampla do genoma, tais como auxiliar a montagem do megagenoma de Pinus

taeda ou alta resolução para clonagem posicional de genes.

Nos últimos anos, com o extraordinário avanço das tecnologias de sequenciamento (Next

Generation Sequencing-NGS) o desenvolvimento de técnicas de genotipagem baseadas em

sequenciamento tem permitido a geração de novas classes de marcadores. O sequenciamento mais rápido e barato impulsionou o desenvolvimento de abordagens de genotipagem em larga escala baseadas em diferentes técnicas de redução de complexidade genômica seguidas de sequenciamento (GBS-Genotyping-by-Sequencing) (Davey, Hohenlohe

et al., 2011). Estas abordagens permitem genotipar milhares de amostras para milhares ou

dezenas de milhares de marcadores a custos de algumas dezenas de dólares. Uma das tecnologias de genotipagem por sequenciamento mais comuns até o momento baseia-se na redução da complexidade genômica da amostra de DNA utilizando combinações específicas

95

de enzimas de restrição, ligação com adaptadores com sequências indexadoras e amplificação por PCR. Os fragmentos selecionados resultantes são submetidos ao sequenciamento por meio do qual são geradas dezenas de milhões de sequências curtas (em geral de 69 bases úteis) em plataformas de sequenciamento. Estas sequências são alinhadas entre si, ou sobre um genoma de referência e polimorfismos de sequência, do tipo presença ou ausência (presence absence variants - PAVs), derivados da variabilidade na distribuição dos sítios de restrição ou polimorfismos de base individual (Single Nucleotide Polymorphisms - SNPs) são detectados em sequências presentes em todas ou na maioria das amostras.

Recentemente foram publicados trabalhos mostrando a viabilidade da técnica para a genotipagem, mapeamento genético e estudos de diversidade em espécies com genoma complexo como milho, trigo e cevada (Elshire, Glaubitz et al., 2011; Poland, Brown et al., 2012; Beissinger, Hirsch et al., 2013). Mapas genéticos de alta densidade desenvolvidos com essa técnica também foram utilizados para ancorar e ordenar mapas físicos e aperfeiçoar ou corrigir sequências não ordenadas em cevada (Mayer, Waugh et al., 2012). Espécies como soja (Sonah, Bastien et al., 2013), Panicum (Lu, Lipka et al., 2013), framboesa (Ward, Bhangoo et al., 2013) também foram genotipadas utilizando GbS. Em espécies florestais uma metodologia GbS foi aplicada em Eucalyptus (Sansaloni, Petroli et al., 2011) pelo laboratório DArT Pty Ltda. Esta empresa otimizou a técnica DArT de redução de complexidade já amplamente utilizada para a genotipagem via microarranjos de sondas imobilizadas, para a detecção de polimorfismos via sequenciamento. Em genomas complexos de coníferas o uso desta metodologia de genotipagem por sequenciamento via redução de complexidade com enzimas de restrição ainda não foi relatada na literatura.

Este estudo apresenta a construção de um mapa genético com densidade de marcadores da ordem de sub-centiMorgan para Pinus taeda utilizando a tecnologia de genotipagem por sequenciamento otimizada pela empresa DArT Pty Ltda e marcadores microssatélites. Um conjunto de megagametófitos haploides de uma única árvore, P. taeda 7-56, foi utilizado como população de mapeamento com o objetivo de gerar um mapa de referência para fins de ancoragem de sequências de Pinus taeda. Para avaliar a utilidade do mapa genético construído para procedimentos futuros de ancorar a montagem do complexo genoma de

96

biblioteca construída por Magbanua et al. (2011) para a mesma árvore clone 7-56 de P.

taeda, foram ancoradas ao mapa genético.

3.2 MATERIAL E MÉTODOS