Hibridização cruzada de sequências repetitivas usando C 0 t-1 DNA

Visando realçar a intensidade do sinal das sondas ricas em representações genômicas com baixo número de cópia, os sinais dos elementos repetitivos foram bloqueados por hibridização cruzada com uma solução de DNA genômico altamente enriquecido com elementos repetitivos de Pinus taeda (Figura 2.6). Para o enriquecimento de elementos

repetitivos dois procedimentos de renaturação cinética do DNA (C0t-1 DNA) foram testados

(Figura 2.7 A-B). O primeiro procedimento testado foi desenvolvido a partir do artigo de Zwick et al. (1997). Nesse procedimento o DNA genômico total é clivado por autoclave e os elementos repetitivos (em fita dupla) são selecionados pela digestão da enzima nuclease S1 (digere DNA fita simples) (Figura 2.7 A). O outro procedimento foi desenvolvido pela empresa DArT Pty Ltda, onde o DNA genômico total é clivado com enzimas de restrição, ligado com adaptadores, e amplificado via PCR com um programa diferencial de amplificação (Figura 2.7 B). Os dois procedimentos estão descritos a seguir.

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Figura 2.6. Representação esquemática do enriquecimento dos elementos repetitivos

usando os procedimentos de renaturação cinética do DNA (C0t-1 DNA) para a hibridização

cruzada.

Protocolo C0t-1 DNA: Método S1 nuclease

O isolamento dos elementos repetitivos utilizando o método S1 nuclease foi desenvolvido de acordo com o artigo de Zwick et al. (1997). Como o rendimento final de DNA gira em torno de um décimo a um vigésimo da concentração de DNA original utilizada, uma grande quantidade de DNA foi utilizada para aumentar o rendimento final. Aproximadamente 3 mg de DNA total foi extraído de acícula de Pinus taeda usando o método CTAB 2% (brometo de cetil-trimetilamônio) com modificações (Doyle e Doyle, 1987). Todo o procedimento de isolamento dos elementos repetitivos está esquematizado na figura 2.7-A.

Diluição do DNA usando 5M NaCl

O DNA genômico total foi diluído a uma concentração de 300 ng/μL usando 5M NaCl para uma concentração final de 0,3M NaCl. Três tubos a um volume final de 1.000 μl foram

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Fragmentação do DNA por autoclave

O DNA genômico diluído com NaCl foi autoclavado 3 vezes por 5 minutos. Após os 3 ciclos de autoclave uma alíquota foi aplicada no gel de agarose 1,2% para checar o tamanho dos fragmentos. O tamanho ideal dos fragmentos deve variar entre 100-1000 pb. Mais dois ciclos de autoclave por 7 minutos foram necessários para alcançar os fragmentos de tamanho desejado.

Figura 2.7. Representação esquemática do enriquecimento de elementos repetitivos dos

dois procedimentos de renaturação cinética do DNA (C0t-1 DNA) testados. (A) Método S1

nuclease, na qual o DNA genômico total é clivado por autoclave e os elementos repetitivos (em fita dupla) são selecionados pela digestão da enzima nucleasse S1 (digere DNA fita simples); (B) Método DArT, na qual o DNA genômico total é clivado com enzimas de restrição, ligado com adaptadores, e amplificado via PCR com um programa diferencial de amplificação.

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Re-anelamento dos fragmentos repetitivos

O tempo para o re-anelamento dos fragmentos repetitivos foi calculado utilizando a fórmula

C0t= 1= mol/L x Ts, onde a concentração inicial (C0) é calculada em mols de nucleotídeo por

litro e tempo em segundos. Assumindo um peso molecular médio para cada desoxirribonucleotídeos (dNTP) de 339 g/mol (peso estimado pela Sigma), para uma concentração inicial de 300 ng/μl (ou 0,300 g/L) o tempo calculado de re-anelamento dos fragmentos repetitivos foi de 1.130 segundos, aproximadamente 18,5 minutos. Ou seja, 1 mol de dNTP é igual a 339 g/mol, portanto, mols de DNA fragmentado é igual a (0,300

g/L)/(339 g/L)= 8.85x10-4 mol/L. Utilizando a fórmula é possível determinar que a reação

deve ocorrer em 1130s levando em consideração C0t= 1.

Assim, após a fragmentação do DNA por autoclave, o DNA foi desnaturado a 95°C por 10 minutos e imediatamente imergidos em gelo molhado por 10 segundos, a fim de eliminar qualquer possibilidade de re-anelamento precoce. Em seguida, o DNA fragmentado foi deixado em banho-maria a 65°C e o tempo calculado de re-anelamento de 18,5 min foi contado. Durante esse período fragmentos de DNA repetitivo se anelaram formando pequenos fragmentos de fita dupla, enquanto que DNA de baixa cópia continuaram fita simples. O tempo calculado para o re-anelamento foi respeitado para maior enriquecimento de fragmentos de DNA repetitivos com fita dupla e para que os DNAs de baixa cópia não voltem a se re-anelar com sua fita molde.

Digestão com S1 nuclease

Imediatamente após esse período, a enzima nuclease S1, que digere DNA de fita simples, foi adicionada à solução e esta incubada a 37°C por 8 minutos. Nessa etapa, todos os fragmentos de fita simples são digeridos pela enzima S1. Fenol equilibrado com TE foi adicionando à reação para inativar a ação da enzima. A reação foi purificada com fenol- clorofórmio-álcool isoamílico (25:24:1) e precipitada durante a noite usando 2.5 volumes de etanol 100%. Os precipitados foram ressuspendidos em TE e misturados para um volume

final de 90 µl de C0t-1 DNA. Para checar o sucesso da reação uma aliquota da solução foi

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Protocolo C0t-1 DNA: Método DArT

O protocolo método DArT foi desenvolvido pela empresa DArT Pty Ltda, e envolve a digestão com apenas uma enzima de restrição (Bsp 1286I) não sensível a metilação e a amplificação via PCR utilizando um programa de amplificação específico para a renaturação cinética do DNA. Todo o procedimento de isolamento dos elementos repetitivos utilizando essa metodologia está esquematizado na figura 2.7-B.

Aproximadamente 600 ng de DNA total foram extraídos de acícula de Pinus taeda usando o método CTAB 2% (brometo de cetil-trimetilamônio) com modificações (Doyle e Doyle, 1987) para a realização do procedimento.

Digestão, anelamento dos elementos repetitivos e ligação com adaptadores.

A digestão foi realizada em aproximadamente 550ng de DNA genômico em uma solução de volume final de 10 μl repetidas 8 vezes, contendo 10 mM de ATP, 1x BSA, 1X tampão RE, 200 unidades da enzima de restrição Bsp 1286I (NEB) e 0,05 mM de mix de adaptadores (1 reverso 5'-GACCGTTCTGGCA-3' e 3 Diretos 5’-CTGAGTAGTGCCAGAACGGTCTGCA-3’ 5’- CTGAGTAGTGCCAGAACGGTCTGCC-3’, 5’-CTGAGTAGTGCCAGAACGGTCTGCT-3’). A reação foi incubada a 37°C por 2 horas para a digestão em um termociclador. Em seguida a amostra foi desnaturada a 95°C por 15 minutos e incubada por 20 minutos a 65°C para desnaturar a enzima. Após esse período a solução foi resfriada lentamente 0.1°C/segundo até chegar a 37°C, nessa etapa a probabilidade de fragmentos repetitivos se anelarem é alta. Quando a temperatura alcançou 37°C foram adicionadas 80 unidades de DNA Ligase T4 e a preparação incubada por mais 1 hora a 37°C para ligação dos adaptadores.

Amplificação via PCR dos elementos repetitivos

Para a amplificação dos elementos repetitivos 0,5 μL do produto da reação de digestão/anelamento/ligação foram utilizados como molde para a amplificação via PCR em 50 μL. Essa reação usa iniciadores que reconhecem os sítios Bsp 1286I (5'- GAGTAGTGCCAGAACGGTC-3') de forma que somente os fragmentos que foram cortados com a enzima sejam amplificados. A reação foi replicada 96 vezes. A amplificação seguiu os

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seguintes parâmetros: 94°C por 1 min, seguido por 40 ciclos de 94°C por 20 segundos, reduzindo 2,4°C/seg até 58°C, 58°C por 40 segundos, aumentando 2,4°C/seg até 72°C, 72°C por 1 min, e finalizando com uma extensão de 72°C por 7 min, reduzindo 2,4°C/seg até 10°C. Para checar a qualidade e o sucesso da amplificação, 4 μL do produto foram analisados em gel de agarose 1,2% corado com brometo de etídio. As 96 amostras replicadas foram misturadas e aliquotadas em 7 tubos de 1,5 ml, com aproximadamente 600 μL de produto amplificado em cada tubo. Em seguida, as amostras foram purificadas com clorofórmio (24:1) e precipitadas overnight com 1 volume de isopropanol. Os precipitados foram lavados com etanol 77%, secos e ressupendidos em 20 μL de TE. As amostras foram então transferidas para um único tubo de 1,5 ml (1.9 ml volume final) e quantificadas em gel de agarose 1,2%.

Pré-hibridização dos C0t-1 DNA ao microarranjo DArT

Representações genômicas de 16 indivíduos, descendentes do cruzamento entre os parentais 104x(103+107), árvores-elite de Pinus taeda, foram preparadas em réplicas

completas para verificar a eficiência do C0t-1 DNA na hibridização com os 7680 clones do

microarranjo (Tabela 2.5). Antes da hibridização das amostras ao microarranjo, uma pré-

hibridização foi feita com as soluções de C0t-1 DNA sem marcação de fluorescência e

desnaturados a 95°C por 5 minutos. Para o teste, 16 slides foram pré-hibridizados com 5 μL

de C0t-1 DNA método DArT, outros 16 slides foram pré-hibridizados com 2,5 μL de C0t-1 DNA

método S1 nuclease e outros 16 slides não foram pré-hibridizados com C0t-1 DNA como

controle negativo. Após as pré-hibridizações, as 16 amostras foram marcados com fluorescência e hibridizados aos três conjuntos de 16 slides. Os dados foram então escaneados e analisados. Os paramêtros utilizados para a seleção dos clones DArT com alta qualidade foram call rate>80%, reprodutibilidade=100%, valor Q>50.

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Tabela 2.5 - Identificação dos indivíduos utilizados na hibridização cruzada com os dois

métodos de preparo do C0t-1 DNA de Pinus taeda e o controle negativo na hibridização com

7.680 clones do microarranjo.

Método C0t-1 DNA Natureza das

amostras

Nº Total de amostras

Combinação de enzimas para redução

de complexidade

S1 nuclease* Pinus taeda 16 PstI+BstNI

DArT Pinus taeda 16 PstI+BstNI

Controle negativo Pinus taeda 16 PstI+BstNI

Total 48

* Protocolo adaptado de Zwick et al. (1997)