Avaliação do microarranjo DArT com 7680 sondas

Com base nos dados da triagem e buscando aumentar o número de sondas polimórficas com representações genômicas da espécie alvo Pinus taeda, 768 sondas da biblioteca P. taeda x

P. elliottii (PstI+TaqI+MseI) foram descartadas e 1536 sondas da biblioteca com

representações genômicas das cinco árvores-elite de Pinus taeda foram adicionadas ao microarranjo. Um microarranjo com um total de 7.680 sondas DArT foi utilizado na genotipagem das 16 espécies de Pinus e das oito procedências de Pinus taeda, com dois indivíduos de cada.

Na genotipagem das espécies de Pinus foi identificado um total de 4.171 sondas DArT

polimórficas (54,3%) (Tabela 2.7), um aumento significativo (p<0,0001, χ2 com correção de

Yates) de sondas polimórficas em relação a genotipagem das espécies com o microarranjo de 6912 sondas. Esse acréscimo é esperado, tendo em vista o aumento de 1536 sondas derivadas de Pinus taeda. Visando reduzir o viés da distância genética existente entre as espécies de Pinus, os dados das quatro espécies filogeneticamente mais distantes, Pinus

chiapensis, Pinus ayacahuite, Pinus kesiya e Pinus maximinoi foram retirados das análises. Na

análise com as 12 espécies, um total de 1.377 sondas DArT polimórficas foram identificadas (17,9%) (Tabela 2.7). Na análise da genotipagem das oito procedências de Pinus taeda foi possível identificar 1.211 sondas DArT polimórficas (15,8%) (Tabela 2.7), um número

significativamente maior (p<0,0001, χ2 com correção de Yates) em relação ao número de

marcadores polimórficos detectados no microarranjo com 6912 sondas.

Avaliando o desempenho das bibliotecas na recuperação de sondas polimórficas, observou- se que tanto na genotipagem das espécies de Pinus quanto na genotipagem das procedências de Pinus taeda, duas bibliotecas se destacaram por revelarem mais sondas polimórficas, a biblioteca de espécies de Pinus PstI+BstNI e a biblioteca P. taeda x P. elliottii

PstI+BstNI (Tabela 2.7). A biblioteca de espécies de Pinus foi aquela que forneceu a maior

proporção de sondas DArT polimórficas. Observou-se também, que diferentemente dos resultados obtidos na triagem, houve uma diferença significativa entre as combinações enzimáticas PstI+TaqI e PstI+BstNI com representações genômicas de P. taeda x P. elliottii. A

76

quantidade de sondas polimórficas obtidas a partir da redução de complexidade com as enzimas PstI+BstNI foi significativamente maior (p≤0,006, teste exato de Fisher) do que

77

Tabela 2.7 – Número e proporção de sondas DArT polimórficas na genotipagem das espécies de Pinus e nas procedências de Pinus taeda com o microarranjo de 7680 sondas.

Espécies de Pinus Procedências de Pinus taeda

Bibliotecas Combinação de enzimas

Nº total

de sondas Análise total

a Análise sem PC PA PK e PMb Nº de sondas polimórficas* Proporção de sondas polimórficas Nº sondas polimórficas* Proporção polimorfismo Nº sondas polimórficas* Proporção polimorfismo

1 Espécies de Pinus PstI+BstNI 2304 1282 55,6% 521 22,6% 429 18,9%

2 Árvores-elite P. taeda PstI+BstNI 1536 637 41,5% 214 13,9% 228 14,8%

3 P. taeda X P. elliottii PstI+TaqI 1536 934 60,8% 264 17,2% 215 14,0%

4 P. taeda X P. elliottii PstI+BstNI 1536 884 57,6% 305 19,9% 278 18,1%

5 P. taeda X P. elliottii PstI+TaqI+MseI 768 434 56,5% 73 9,5% 61 7,9%

Total 7680 4171 54,3% 1377 17,9% 1211 15,8%

* Os parâmetros utilizados para declarar uma sonda como sendo um marcador polimórfico de alta qualidade foram Diversidade Genética (DG) ≥ 0,05, Call Rate > 70%, Reprodutibilidade > 95% e Valor de Q > 65.

a _{Marcadores DArT polimórficos calculados com as 16 espécies de Pinus.}

78

obtida com a combinação PstI+TaqI. Não é possível afirmar que a combinação de enzimas

PstI+BstNI seja de fato a melhor combinação de enzimas para Pinus, visto que houve

diferença entre as genotipagens e o experimento não visava propriamente avaliar este aspecto e por isso não foi repetido. Como ocorrido na triagem, o número de clones polimórficos derivados da biblioteca P. taeda x P. elliottii com a combinação de enzimas

PstI+TaqI+MseI foi significativamente menor (p<0,0001, teste exato de Fisher) do que o

número obtido a partir das outras bibliotecas, revelando uma menor eficiência dessa combinação na descoberta de sondas polimórficos para Pinus.

Analisando a distribuição das sondas DArT que passaram pelos diferentes parâmetros de seleção na genotipagem com as espécies de Pinus, observou-se que 50% das sondas tiveram diversidade genética maior que 0,40, 53% tiveram reprodutibilidade igual a 100%, 44% tiveram Call Rate maior que 80% e 62% tiveram Valor Q maior ou igual a 70% (Figura 2.10). Analisando a distribuição das sondas DArT na genotipagem das procedências de Pinus taeda, observou-se que 59% das sondas apresentaram diversidade genética maior ou igual a 0,40, 65% tiveram reprodutibilidade igual a 100%, 51% tiveram Call Rate maior que 80% e 49% tiveram Valor Q maior ou igual a 70% (Figura 2.10). As sondas DArT que consolidaram os parâmetros de reprodutibilidade maior que 95%, Call Rate maior que 70%, Valor de Q maior que 65 e diversidade genética maior que 0,05 foram selecionados como os marcadores polimórficos de maior qualidade (Figura 2.11). Os marcadores selecionados na genotipagem das espécies tiveram parâmetros médios de Call Rate de 91,4%, Reprodutibilidade de 98,3% e valor-Q de 80. Na genotipagem das procedências de Pinus taeda os parâmetros médios dos marcadores selecionados foram Call Rate de 78%, reprodutibilidade de 99% e valor-Q de 88,8%.

79

Figura 2.10 – Gráficos da distribuição do número e porcentagem das sondas DArT que passaram nos parâmetros para seleção dos marcadores com Diversidade Genética ≥ 0,05, Reprodutibilidade > 95%, Call Rate > 70% e Valor de Q > 65. Comparação da distribuição dos marcadores DArT na genotipagem das espécies de Pinus e das procedências de Pinus taeda.

80

Algumas espécies vegetais com genomas extensos e complexos também tiveram marcadores DArT desenvolvidos, o que permite uma comparação mesmo que tentativa, tendo em vista as particularidades de cada experimento em termos de rigor na seleção de sondas e, evidentemente, da estrutura e organização do genoma, do modo de reprodução e amplitude da base genética amostrada na construção das bibliotecas. Heller-Uszynska et al. (2011), analisando diferentes reduções de complexidade para 16 clones distintos de cana- de-acúçar (genoma poliploide de ~10Gbp por conteúdo diploide) conseguiram identificar 300 marcadores DArT em 3.072 clones (9,78%) com um dos melhores métodos de redução de complexidade avaliados (MITE/Bsp1286I). Akbari et al. (2006), identificaram em trigo 144 marcadores DArT em 1.536 sondas (9,4%) utilizando o melhor método de redução de complexidade por eles definido (PstI/TaqI), em 13 cultivares, mostrando que a tecnologia DArT pode ser efetivamente aplicada em um genoma hexaploide de ~16Gbp. Badea et al. (2011) obtiveram 719 marcadores DArT em 3.072 sondas (23.4%) ao genotipar 144 acessos de triticale, um hexaploide AABBRR. Na análise com as 16 espécies de Pinus, 1.282 marcadores DArT foram identificados a partir de 2.304 sondas derivadas especificamente da biblioteca de espécies (55,6%), uma proporção de clones polimórficos considerável para um genoma extenso e complexo de 24Gbp por conteúdo haploide.

Evidentemente que a diversidade de espécies consideradas, a inexistência de domesticação destas espécies e o próprio modo de reprodução alógamo do gênero Pinus, que resulta em ampla diversidade nucleotídica, justifica esta maior eficiência. Uma comparação mais adequada pode ser feita com o trabalho de desenvolvimento de um microarranjo DArT realizado para Eucalyptus que, além de também ter amostrado uma ampla representatividade de espécies, apresenta características semelhantes de hábito reprodutivo, embora tenha genoma cerca de 40 vezes menor (640 Mpb). Sansaloni et

al.(2010), em uma triagem inicial, identificaram 7.677 marcadores DArT a partir de 16.128

sondas (47,6%) e, mais tarde, após uma segunda triagem mais ampla, detectaram 13.300 sondas polimórficas em um painel envolvendo 64 espécies do gênero a partir de 23.808 sondas (55,9%). Neste mesmo trabalho, ao avaliar a proporção de marcadores polimórficos em um conjunto de indivíduos de seis pedigrees de Eucalyptus, a quantidade média de marcadores polimórficos relatados variou entre 864 e 2.553 com média de 1.395 a partir de 7.680 sondas, ou seja, 18.1%. Se forem considerados somente os resultados das quatro

81

bibliotecas de Pinus geradas com duas enzimas (Tabela 2.8), a proporção de marcadores polimórficos obtidos foi de 1150 de um total de 6912, ou seja, 16.6%, proporção esta consistente com os resultados de Eucalyptus. Ao se comparar, portanto, os resultados do trabalho de Eucalyptus com estes desenvolvidos para Pinus, observa-se proporções de identificação de sondas polimórficas muito próximas seja em nível inter bem como intra- específico, independentemente do tamanho do genoma. Isso sugere que a metodologia de redução de complexidade genômica utilizada na técnica DArT é muito eficiente em remover a porção de baixa complexidade, altamente repetitiva, colocando em patamares equivalentes genomas de dimensões muito discrepantes.

Figura 2.11 - Diagrama de Venn consolidando as informações da classificação das sondas DArT de acordo com os três parâmetros adotados, Call Rate>70%, Reprodutibilidade>95% e Valor de Q>65. Apenas os marcadores com diversidade genética maior que 0,05 que satisfazem simultaneamente os três parâmetros foram selecionados. Comparação entre as sondas polimórficas na genotipagem das espécies de Pinus e das procedências de Pinus

82

2.3.4 Hibridização cruzada de sequências repetitivas usando C0t-1 DNA

Para enriquecer a intensidade do sinal do microarranjo DArT com sondas ricas em representações genômicas com baixo número de cópia, os sinais dos elementos repetitivos foram bloqueados por hibridização cruzada com uma solução de DNA genômico altamente enriquecido em elementos repetitivos, gerada através de dois procedimentos de

renaturação cinética do DNA (C0t-1 DNA) (Britten e Kohne, 1968), um desenvolvido a partir

do artigo de Zwick et al. (1997) e o outro desenvolvido pela empresa DArT Pty Ltda. Para o teste foram utilizados representações genômicas de 16 indivíduos, filhos do cruzamento entre os parentais 104x(103+107), árvores-elite de Pinus taeda.

Utilizando o procedimento de enriquecimento de elementos repetitivos por S1 nuclease (Zwick, Hanson et al., 1997) observou-se um ganho de 65% no número de marcadores polimórficos em relação ao controle negativo, passando de 337 sondas polimórficas no controle negativo para 557 sondas polimórficas no método S1 nuclease (Tabela 2.8). Utilizando o método desenvolvido pela empresa DArT Pty Ltda este ganho foi um pouco menor, de 46,6%, passando de 337 para 494 (Tabela 2.8). Estas diferenças foram significativas (p valor < 0,05 no teste de Fisher). Apesar do ganho com o procedimento S1 nuclease ter sido maior nesse experimento, o procedimento de enriquecimento desenvolvido pela empresa DArT foi menos laborioso, mais rápido. Além disso, é um método baseado em PCR, com maior custo benefício, podendo ser desenvolvido em um único experimento, não necessitando de grandes quantidades iniciais de DNA.

Todas as bibliotecas do microarranjo revelaram mais sondas DArT polimórficas quando a hibridização cruzada com elementos repetitivos foi utilizada. Entretanto, não é possível realizar uma análise detalhada de possíveis interações entre a utilização do tratamento com

C0t-1 DNA e o tipo de biblioteca, tendo em vista que o experimento não foi repetido. O

número de sondas polimórficas na presença do C0t-1 DNA foi em média de 1,56 vezes maior

considerando os dois tratamentos. Essa diferença evidência o impacto negativo dos elementos repetitivos no desenvolvimento de marcadores DArT para genomas complexos. A alta intensidade do sinal emitido pelas sondas com sequências repetitivas oculta o sinal fraco emitido pelas sondas com sequências de baixa cópia quando posicionadas próximas no

83

microarranjo. Apesar da enzima de restrição PstI utilizada na redução de complexidade ser sensível a metilação CpG, eliminando muito DNA repetitivo metilado da representação genômica, só a seleção com enzima de restrição não foi suficiente para reduzir o efeito desses elementos em um genoma complexo como o de Pinus taeda.

Tabela 2.8 – Número de sondas DArT polimórficas nos dois tratamentos com C0t-1 DNA e na

ausência de C0t-1 DNA (controle negativo) utilizando 16 indivíduos, filhos do cruzamento dos

parentais 104x(103+107), árvores-elite de Pinus taeda.

_Bibliotecas Combinação de

enzimas

Nº total de sondas

Nº de sondas polimórficas* nos 16 indiv P. taeda

C0t-1 S1 nuclease C0t-1 DArT Controle Negativo

1 Espécies de Pinus PstI+BstNI 2304 135 145 87

2 Árvores-elite P. taeda PstI+BstNI 1536 73 65 41

4 P. taeda X P. elliottii PstI+TaqI 1536 148 130 85 5 P. taeda X P. elliottii PstI+BstNI 1536 153 122 111 6 P. taeda X P. elliottii PstI+TaqI+MseI 768 48 32 13

Total 7680 557 494 337

*Os paramêtros utilizados para a seleção das sondas DArT com alta qualidade foram Call Rate>80%, Reprodutibilidade=100%, valor Q>50.