Esse estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Faculdade de Ciências Médicas da Unicamp, de acordo com as resoluções do Comitê Brasileiro de Ética em Pesquisa (parecer no 1.135.867 de 02/07/2015).
RESULTADOS
Experimentos de titulação do DNAds mostraram que a menor concentração da preparação antigênica que produziu reatividade máxima foi alcançada com 10 μg/mL. Todas as reações ELISA foram realizadas utilizando DNAds a uma concentração de 20 μg/ml. Experimentos de titulação do conjugado definiram que a menor concentração desse reagente que produziu reatividade máxima foi alcançada com a diluição 1:8.000. Todas as reações ELISA foram realizadas com conjugado diluído a 1:4.000. Estudos de linearidade mostraram que as taxas de conversão do substrato foram lineares por pelo menos 12 min. Todas as reações ELISA foram bloqueadas 10 min. após a adição do sistema substrato e lidas em seguida.
A Figura 1 mostra a curva ROC produzida com os resultados obtidos com a bateria de soros de pacientes com LES, pacientes com outras doenças e pessoas sadias.
Figura 1. Curva ROC para avaliação do
desempenho da técnica ELISA.
Utilizando o cut-off determinado pela curva (7,65), a técnica ELISA foi positiva em 118 (92,91%) das 127 amostras de soros de pacientes com LES e em cinco (8,92%) das 56 amostras de soros de pacientes com outras doenças (dois com artrite reumatoide, um com hepatite B, um com esclerose sistêmica e um com mononucleose infecciosa). A técnica ELISA não foi positiva em nenhuma das 37 amostras de soros do grupo de pessoas sadias.
A Figura 2 mostra a distribuição das concentrações de anticorpos anti-DNAds obtidas com a técnica ELISA nas 220 amostras de soros incluídas no estudo.
Figura 2. Anticorpos anti-DNAds detectados pela técnica ELISA. A
linha tracejada representa o valor do cut-off (7,65).
O coeficiente de variação da técnica ELISA, obtido pela análise de um padrão contendo 50 UA/mL por 14 dias alternados, foi 9,6%.
A técnica CLIFT foi positiva (títulos ≥ 1:10) em 109 (85,82%) das 127 amostras de soros de pacientes com LES, sendo negativa nas 56 amostras de pacientes com outras doenças e nas 37 amostras de soros de pessoas sadias.
Nove pacientes com LES apresentaram reação ELISA positiva e CLIFT negativa, enquanto nove pacientes apresentaram as duas reações negativas.
Em resumo, a técnica ELISA apresentou sensibilidade de 92,9% e especificidade de 94,6%, enquanto que a técnica CLIFT apresentou sensibilidade e especificidade de 85,83% e 100%, respectivamente.
De acordo com a análise estatística: (i) a técnica ELISA apresentou sensibilidade significativamente superior àquela obtida com a técnica CLIFT (p=0,0027); (ii) a técnica CLIFT apresentou especificidade significativamente superior àquela obtida com a técnica ELISA (p=0,0253).
Os índices de avidez dos anticorpos IgG anti-DNAds determinados em 15 amostras de soros de pacientes com LES variaram de 58,48% a 96,90%, como mostrado na Tabela II.
Tabela II. Índices de avidez (IAv) dos anticorpos IgG anti-DNAds em 15 amostras de soro de pacientes com LES.
Amostra IAv (% ) Amostra IAv (% ) Amostra IAv (% )
1 96,90 6 90,37 11 81,61
2 87,71 7 86,56 12 58,48
3 83,50 8 78,66 13 75,66
4 95,18 9 81,35 14 76,29
5 94,93 10 69,79 15 65,63
A variação de resultados mostrou que a técnica pode ser adequada para a determinação da avidez dos anticorpos IgG anti-DNAds.
DISCUSSÃO
Devido à heterogeneidade das manifestações clínicas do LES, o diagnóstico da doença é baseado em aspectos clínicos e achados laboratoriais, com destaque para a detecção de alguns tipos de autoanticorpos.5 De acordo
com critérios propostos pela ACR (1997), são considerados para o diagnóstico do LES: (a) títulos significativos de ANAs por imunofluorescência ou qualquer teste equivalente, na ausência de drogas capazes de induzir síndrome similar ao LES, (b) níveis significativos de anticorpos anti-DNAds e anti-Sm, (c) presença de anticorpos anti-fosfolípides, baseada em níveis anormais de anticorpos anticardiolipina IgG ou IgM, verificados por (i) um resultado positivo no teste para anticoagulante lúpico (geralmente realizado através de um teste tempo de tromboplastina parcial - PTT) ou (ii) um teste RPR falso-positivo para sífilis, por no mínimo seis meses, confirmado por um teste negativo para a pesquisa de anticorpos anti-Treponema pallidum por imunofluorescência indireta (FTA-Abs) ou por um teste de imobilização do parasita (TPI).1,16,17 De
acordo com os critérios propostos pela SLICC (2012), são considerados para o diagnóstico do LES: (a) níveis de ANAs acima dos valores de referência do laboratório, (b) níveis de anticorpos anti-DNAds acima dos valores de referência do laboratório (o dobro se a detecção dos anticorpos for feita por ELISA), (c) presença de anticorpos anti-Sm e (d) presença de anticorpos anti-fosfolípides, verificada por (i) um resultado positivo no teste para anticoagulante lúpico ou (ii) um teste falso-positivo para detecção de IgM, IgG ou IgA anti-cardiolipina para sífilis, confirmado por um teste FTA-Abs ou TPI negativo ou (iii) detecção de níveis médios/altos de anticorpos anticardiolipina (IgA, IgG ou IgM) ou (iv) detecção de anticorpos anti- β2-glicoproteina.1,18,19
Os anticorpos anti-DNAss e anti-DNAds estão envolvidos no desenvolvimento do LES e tem sido eluídos de rins de pacientes e modelos experimentais com a doença.68 Nas classificações ACR (1997) e SLICC (2012),
a detecção de anticorpos anti-DNAds é considerada critério diagnóstico.17,18
Os anticorpos anti-DNAds são altamente heterogêneos em relação à sua especificidade, classe, subclasse e avidez.65,121 Embora muito mais
específicos para o LES do que os anticorpos anti-DNAss, os anticorpos anti- DNAds podem ser detectados com baixa frequência em pessoas
sadias95,97,101,122 e em outras doenças, incluindo artrite reumatoide,82,86,88,92– 94,101,105,106,112,122–126 síndrome de Sjögren,82,86,88,92,94,101,106,112,126–129 esclerose
sistêmica,86,88,92,94,112,123,128,130,131 sarcoidose,84,132 DITC,85,88,101,125,133
DMTC,86,88,94,101,106,127,134 doenças hepáticas crônicas,88,135 fenômeno de
Raynaud,80,136 hepatite crônica ativa,80,94,135,137 hepatite B,89,90 hepatite
C,91,128,138 hepatite autoimune,81,92,93 mononucleose infecciosa,90,139 doença de
Crohn,93 miastenia grave,92,94,105 tireoidite autoimune, gastrite autoimune,
anemina hemolítica autoimune,92 vasculite,95 cirrose biliar primária,88,94 e
síndrome antifosfolípide.96
Os anticorpos anti-DNAss não são úteis para o diagnóstico do LES, devido ao fato de serem detectados com alta frequência em várias outras doenças, incluindo: artrite reumatoide,140 esclerose sistêmica,141,142 lúpus
induzido por drogas,143 mononucleose infecciosa140, glomerulonefrite crônica140
e em hepatites crônica ativa,140 autoimune144,145 e viral.146 Alguns casos de
pacientes com leucemia147,148 e cirrose biliar primária com níveis acima do
normal de anticorpos anti-DNAss também foram observados.144,149
Existem diferentes técnicas para a pesquisa dos anticorpos anti- DNAds, com sensibilidades e especificidades distintas. Como já mencionado, atualmente, CLIFT e ELISA são as principais técnicas utilizadas para a detecção desses anticorpos. 56,69,150
Considerando o objetivo do presente estudo, uma pesquisa no site Public Medline (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/), de 1979 a 2017, utilizando os termos Systemic Lupus Erythematosus, ELISA, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, Immunoenzyme Techniques, anti-dsDNA e antibodies, identificou 57 referências que diziam respeito à descrição e utilização de técnicas ELISA para a pesquisa de anticorpos anti-DNAds no LES.
Klotz et al. (1979) descreveram uma técnica ELISA in house para a pesquisa de anticorpos IgM e IgG no LES, utilizando tubos de poliestireno pré- tratados com sulfato de protamina e DNAds ou DNA desnaturado (DNAss) de timo de vitelo como antígenos. A técnica ELISA in house foi comparada com um RIA in house, baseado na quantificação do DNA tritiado complexado a anticorpos anti-DNA do soro, após filtração da mistura em membranas de fibra de vidro (GF/A). Anticorpos anti-DNAds e anti-DNAss foram pesquisados em
amostras de soros de 15 pacientes com LES e 27 voluntários sadios. De acordo com os autores, uma correlação muito boa foi observada entre as duas técnicas na pesquisa de anticorpos anti-DNAds, diferentemente da baixa correlação observada na pesquisa de anticorpos anti-DNAss.
Halbert et al. (1981) descreveram uma técnica ELISA in house, utilizando discos plásticos contendo grupos isocianato e DNAds de timo de vitelo como antígeno, para a determinação de anticorpos (IgM e IgG) anti- DNAds em soros de pacientes com LES e pessoas sadias, correlacionando os resultados obtidos com técnicas Farr e CLIFT in house. De acordo com os autores, a análise dos resultados obtidos com soros de pacientes com LES mostrou que a técnica ELISA in house apresentava boa correlação (r) com a técnica Farr in house (n=64, r = 0,75, p< 0,001) e CLIFT in house (n=56, r=0,71, p< 0,001).
Pisetsky & Peters (1981) descreveram uma técnica ELISA in house para a pesquisa de anticorpos IgG anti-DNAds, utilizando placas de poliestireno (sem tratamento) e DNAds de esperma de salmão como antígeno. Os soros de pacientes com LES e outras doenças utilizados no trabalho foram obtidos da rotina do laboratório clínico do Centro Médico da Universidade de Duke (EUA), escolhidos ao acaso. Todos os soros tinham sido previamente analisados para a pesquisa de anticorpos anti-DNAds por RIA. A constatação de que os anticorpos detectados por ELISA eram dirigidos ao DNA foi obtida pelas seguintes observações: (a) o DNAds purificado bloqueava a ligação dos anticorpos presentes no soro ao DNA fixado no poliestireno; (b) os resultados das técnicas ELISA in house e RIA apresentaram correlação entre si. Todos os soros negativos para anticorpos anti-DNAds por RIA também apresentaram resultados negativos por ELISA in house; quase todos os soros positivos para anticorpos anti-DNAds por RIA foram positivos por ELISA in house. De acordo com os autores, a técnica ELISA in house, considerando as suas características (alta sensibilidade, rapidez, uso de materiais não radioativos e possibilidade de expressão de resultados quantitativos), poderia ser de grande utilidade para a rotina diagnóstica do LES e pesquisas clinicas e experimentais.
Kávai et al. (1982) descreveram uma técnica ELISA in house para a pesquisa de anticorpos IgM anti-DNAds e IgG anti-DNAds, utilizando placas
de ELISA pré-tratadas com SAB metilada e DNAds de timo de vitelo como antígeno. Anticorpos anti-DNAds foram pesquisados em 120 amostras de soros de pacientes com LES (60 com LES ativo e 60 com LES inativo) e 20 doadores de sangue. Em pacientes com LES em atividade, a média das concentrações de anticorpos IgM e IgG foi 1,0 ± 12,5 µg/mL e 4,6 ± 36,9 µg/mL, respectivamente, enquanto a média das concentrações desses anticorpos na doença inativa foi 1,2 ± 10,5 µg/mL e 3,2 ± 21,8 µg/Ml, respectivamente. No grupo de doadores de sangue, os valores das médias das concentrações de anticorpos IgM e IgG foram 0,3 ± 1,7 µg/mL e 0,9 ± 5,3 µg/mL, respectivamente. De acordo com os autores, os resultados mostraram que a técnica ELISA in
house é confiável para detectar diferentes classes de anticorpos anti-DNAds.
Stokes et al. (1982) descreveram uma técnica ELISA in house para a pesquisa de anticorpos no LES, utilizando placas de poliestireno pré-tratadas com sulfato de protamina e DNAds e DNAss de timo de vitelo como antígenos (a opção por timo de vitelo foi definida após comparação com outras fontes de antígeno - núcleos de células hepáticas de rato, Escherichia coli - E. coli e esperma de arenque). A técnica ELISA in house foi comparada com um RIA
in house, utilizando DNAds de E. coli marcado com C14 como antígeno, e uma
técnica de aglutinação em lâmina, utilizando partículas de látex revestidas com desoxiribonucleoproteína (DNP) (AR Horwell Ltd, Inglaterra). A atividade dos anticorpos IgG anti-DNAds e IgG anti-DNAss foi avaliada utilizando amostras de soros de 215 pacientes (48 com LES, 100 com doenças hepáticas, 38 com doença de Crohn, 14 com doença celíaca e 101 com artrite reumatóide) e 100 doadores de sangue. Não foi detectada atividade de anticorpo para DNAds e DNAss nas amostras de soros de doadores de sangue; por outro lado, nenhuma das amostras de soros de pacientes com LES foi negativa. Atividade de anticorpo fraca foi detectada em amostras de soros de alguns pacientes com artrite reumatoide e doenças hepáticas. Em amostras de soros enviadas ao laboratório para a pesquisa de anticorpos anti-DNA durante um período de seis meses, houve concordância de aproximadamente 85% e 80% entre os resultados das técnicas ELISA in house e RIA in house e ELISA in house e aglutinação, respectivamente. De acordo com os autores, a técnica ELISA in
house poderia ser uma alternativa econômica e confiável para a pesquisa de anticorpos anti-DNAds no LES.
Rubin et al. (1983) descreveram uma técnica ELISA in house para a pesquisa de anticorpos totais anti-DNAds, utilizando placas de poliestireno pré-tratadas com SAB metilada e DNAds de timo de vitelo como antígeno tratado com S1 nuclease após fixação ao plástico. A técnica ELISA in house foi comparada com uma técnica Farr in house com DNAds de timo de vitelo marcado com I125 como antígeno, após tratamento com S1 nuclease. Foram
testadas amostras de soros de pacientes com LES, esclerose sistêmica, artrite reumatoide, DMTC, síndrome de Sjögren, lúpus induzido por droga e de doadores de sangue. Os dois ensaios apresentaram boa concordância entre si (r=0,96), com os anticorpos anti-DNAds sendo detectados predominantemente em pacientes com LES. Ensaios comparativos mostraram que o pré-tratamento do plástico com SAB metilada, ao invés do sulfato de protamina, gerava menos casos de reações cruzadas, pelo fato desse material não interagir com anticorpos anti-histonas.
Wollina (1984) descreveu um ultramicroensaio ELISA in house, adaptado de uma técnica analítica em câmara (CAT), para a pesquisa de anticorpos IgG anti-DNA, utilizando DNAds de timo de vitelo como antígeno. Foram testadas 171 amostras de soros, sendo 84 de pacientes com LES e 87 com outras doenças do tecido conectivo (lúpus discóide crônico, artrite reumatóide, síndrome de Sjögren, psoríase, polimiosite, panarterite, esclerose sistêmica e DITC). A técnica ELISA in house foi positiva em 48 (≅57%) amostras de pacientes com LES e em nove amostras (≅10%) de pacientes com outras doenças. Uma técnica CLIFT in house foi utilizada para a pesquisa de anticorpos IgG anti-DNAds em 53 (≅63%) das 84 amostras de pacientes com LES e em 72 (≅82,7%) das 87 amostras de soros de pacientes com outras doenças. Das 53 amostras de pacientes com LES testadas, 11 (20,7%) foram positivas por ELISA e CLIFT, 11 (20,7%) foram positivas por ELISA e negativas por CLIFT e 31 (58,4%) foram negativas com as duas técnicas. Das 72 amostras de soros de pacientes com outras doenças, duas amostras (uma de síndrome de Sjögren e uma de DITC) foram positivas por ELISA e CLIFT e sete amostras apenas com a técnica ELISA (quatro de artrite reumatoide, duas de
DITC e uma de esclerose sistêmica). De acordo com o autor, a detecção de anticorpos IgG anti-DNAds não é restrita ao LES, sendo a sua presença em outras doenças devido provavelmente à presença de anticorpos de baixa avidez.
Isenberg et al. (1987) avaliaram o desempenho de técnicas ELISA
in house utilizando placas de poliestireno pré-tratadas com PLL e DNAds
(tratado com S1 nuclease) ou DNAss de timo de vitelo como antígeno, para a pesquisa de anticorpos IgM anti-DNAds, IgG anti-DNAds, IgM anti-DNAss e IgG anti-DNAss, pela comparação com quatro testes para a pesquisa de anticorpos anti-DNAds: CLIFT in house, RIA in house, usando filtro Millipore e DNA marcado com I125 como antígeno (RIA-Millipore), e dois RIAS comerciais
utilizando DNAds marcado com I125 como antígeno: Gamma-B anti-dsDNA
(Immunodiagnostics, Washington, Inglaterra) e anti-dsDNA Amersham kit (Immuno Biological Laboratories, Hamburg, Alemanha). Foram testadas 200 amostras de soros, sendo 60 de pacientes com LES, 70 de pacientes com DTC (artrite reumatoide, n=30; síndrome de Sjögren, n=10; miosite, n=10; esclerose sistêmica, n=10 e doença hepática autoimune, n=10) e 70 de doadores de sangue. Com relação as 60 amostras de soros de pacientes com LES, níveis significativos de anticorpos IgM anti-DNAds, IgG anti-DNAds, IgM anti-DNAss e IgG anti-DNAss foram detectados em 22 (37%), 20 (33%), 15 (25%) e 19 (32%) amostras com a técnica ELISA in house, respectivamente, enquanto níveis significativos de anticorpos anti-DNAds foram detectados em 8 (13%), 17 (28%), 34 (57%) e 23 (38%) amostras com as técnicas CLIFT in house, RIA-Millipore, RIA-Gamma-B e RIA-Amersham, respectivamente. Com relação as 70 amostras de soros de pacientes com outras doenças, níveis significativos de anticorpos IgM anti-DNAds, IgG anti-DNAds, IgM anti-DNAss e IgG anti-DNAss foram detectados em 7 (10%), 3 (4%), 6 (9%) e 4 (6%) amostras com a técnica ELISA in house, respectivamente, enquanto níveis significativos de anticorpos anti-DNAds foram detectados em 3 (4%), 7 (10%) e 2 (3%) amostras com as técnicas RIA-Millipore, RIA-Gamma-B e RIA- Amersham, respectivamente. A técnica CLIFT in house foi negativa em todas as amostras de soros de pacientes com DTC e de pessoas sadias. De acordo com os autores, (a) o ensaio RIA-Gamma-B apresentou melhor sensibilidade
para anticorpos anti-DNAds, (b) o ensaio CLIFT in house apresentou melhor especificidade para anticorpos anti-DNAds, (c) os ensaios que apresentaram as melhores correlações de resultados foram ELISA-IgG anti-DNAss e ELISA-IgG anti-DNAds (r=0,54), RIA-Millipore e ELISA-IgG anti-DNAss (r=0,51) e RIA-Millipore e RIA-Amersham (r=0,49). Ainda de acordo com os autores, a pesquisa de anticorpos anti-DNA deveria ser realizada por mais de uma técnica.
Mohan et al. (1989) avaliaram o desempenho dos ensaios ELISA in
house, utilizando DNAds de timo de vitelo como antígeno, e CLIFT in house,
para a pesquisa de anticorpos anti-DNAds em 60 amostras de soros enviadas ao laboratório para pesquisa de doenças autoimunes e 56 amostras de doadores de sangue. Das 60 amostras recebidas pelo laboratório, 35 (≅58,3%) apresentaram títulos significativos de anticorpos anti-DNAds por ELISA e 28 (≅47%) pelo teste CLIFT, enquanto 14 (≅23%) amostras tiveram resultados negativos com os dois testes. De acordo com os autores, a técnica ELISA poderia ser uma boa alternativa à técnica CLIFT, devido à sua sensibilidade relativamente maior, expressão de resultados quantitativos e processamento de um maior número de amostras.
Ward et al. (1989) compararam o desempenho de um RIA em filtro
in house com os testes comerciais ELISA (Diamedix, Miami, EUA), utilizando
como antígeno DNAds plasmidial de E. coli, e CLIFT (Kallestad Diagnostics, Austin, EUA), utilizando conjugado anti-IgG, para a pesquisa de anticorpos anti- DNAds em amostras seriadas de soros de nove pacientes com LES. De acordo com os autores, os resultados dos ensaios mostraram correlação substancial: CLIFT e RIA in house (r=0,804), CLIFT e ELISA (r=0,706) e ELISA e RIA in house (r=0,504).
Emlen et al. (1990) descreveram um teste ELISA in house, para a pesquisa de anticorpos IgG anti-DNAds utilizando placas de ELISA pré-tratadas com estreptavidina e DNAds plasmidial biotinilado como antígeno, tratado com S1 nuclease após acoplagem ao plástico, comparando os resultados desse teste com uma técnica RIA in house, usando filtro Millipore e DNAds marcado com I125 como antígeno (RIA-Millipore), e duas técnicas comerciais utilizando
Arlington Heights, EUA) e uma técnica ELISA (Sigma, St. Louis, EUA). A pesquisa de anticorpos anti-DNAds foi realizada em 198 amostras de soros, sendo 33 de pacientes com LES, 36 com artrite reumatóide, 14 com esclerose sistêmica, 18 com doenças hepáticas crônicas e 97 de pessoas sadias. A técnica ELISA in house foi positiva em 17 (≅52%) amostras de soros de pacientes com LES e em duas (≅11%) amostras de soros de pacientes com doença hepática crônica. Os estudos comparativos mostraram alto grau de concordância da técnica ELISA in house com as outras técnicas utilizadas- 86% de correlação com Farr- Amersham, 80% com RIA Millipore in house e 74% com ELISA-Sigma. De acordo com os autores, a técnica ELISA in house é simples, requer pequenas quantidades de DNA, sendo altamente específica para a detecção de anticorpos anti-DNAds.
Tzioufas et al. (1990) avaliaram o desempenho de uma técnica ELISA in house para a pesquisa de anticorpos IgG anti-DNAds, pela comparação com as técnicas comerciais Farr (anti-dsDNA Amersham, Immuno Biological Laboratories, Hamburg, Alemanha), utilizando como antígeno DNAds plasmidial marcado com I125, e CLIFT (Kallestad Diagnostics, Austin, EUA), utilizando conjugado anti-imunoglobulina total. Na técnica ELISA in house, as placas foram pré-tratadas com PLL e o DNAds fixado tratado com S1 nuclease . Foram testadas 97 amostras de soros, sendo 58 de pacientes com LES, apresentando diferentes graus de atividade da doença, e 39 de pacientes com outras doenças reumáticas autoimunes (artrite reumatoide, n=17; síndrome de Sjögren, n=15 e DITC, n=7). As técnicas ELISA in house, Farr-Amersham e CLIFT-Kallestad apresentaram sensibilidades e especificidades de 80% e 80%, 39,6% e 97,2% e 32,7% e 100%, respectivamente. De acordo com os autores, a técnica ELISA in house descrita foi o método mais sensível, apresentando razoável especificidade e boa correlação com a atividade da doença.
Werle et al. (1992) compararam o desempenho de três técnicas comerciais para a pesquisa de anticorpos anti-DNAds: (1) ELISA-IgG, utilizando DNAds de timo de vitelo (TM) ou recombinante (R) (EliA Medizintechnik GmbH, Freiburg, Alemanha), (2) Farr (Amersham Buchler GmbH & CoKG, Braunschweig, Alemanha), utilizando como antígeno DNAds
plasmidial marcado com I125, e (3) CLIFT in house utilizando um conjugado fluorescente polivalente. A técnica CLIFT in house foi realizada com lâminas sem tratamento ou com tratamento prévio com HCl. Foram testadas 2.061 amostras de soros de pacientes encaminhados ao laboratório para a pesquisa de anticorpos anti-DNAds, 1.360 foram testadas com ELISA utilizando DNAds de timo de vitelo (grupo A) e 701 amostras foram testadas com ELISA utilizando DNAds recombinante (grupo B). Anticorpos anti-DNAds foram detectados por pelo menos um dos métodos utilizados em 150 (7,3%) das 2.061 amostras testadas. As técnicas ELISA-EliA (TM+R), Farr-Amersham e CLIFT in house,