Todos os sais, bases e ácidos utilizados no preparo de soluções pertenciam às marcas Merck (Darmstadt, Alemanha) ou Sigma-Aldrich (Saint Louis, EUA). Os reagentes Tween 20 (P1379), SAB (A3059), PLL (P6282), DNAds de timo de vitelo (D4522), S1 nuclease de Aspergillus oryzae (N5661),
anticorpo anti-IgG humana conjugada com peroxidase (A8667), tetrametilbenzidina (TMB) (T3405) e peróxido de hidrogênio (H2O2) (H1009),
utilizados na reação ELISA, pertenciam a marca Sigma-Aldrich.
Casuística
No presente estudo, foi utilizada uma bateria de 220 amostras de soros com a seguinte composição: pacientes com LES, n=127 (122 mulheres, 5 homens, idade média=34 anos); pacientes com outras doenças, n=56 (36 mulheres, 20 homens, idade média=48 anos) (artrite reumatoide, n=26; síndrome de Sjögren, n=3; esclerose sistêmica, n=3; mieloma múltiplo, n=9; hepatite B, n=6; hepatite A, n=4; citomegalovirose - CMV, n=3 e mononucleose infecciosa, n=2), e pessoas sadias, n=37 (23 mulheres, 14 homens, idade média=41 anos). Todas as amostras de soros foram obtidas da rotina do Laboratório de Imunologia da Divisão de Patologia Clínica de pacientes atendidos no Hospital de Clínicas da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp). Todos os soros de pessoas sadias foram obtidos de funcionários e alunos da Unicamp, sem histórico de LES.
Vinte e um (16,5%) dos 127 pacientes com LES apresentavam pesquisa de anticorpos anti-Sm positiva (a pesquisa foi realizada com kits ELISA da marca Orgentec, Mainz, Alemanha). Todos os pacientes com artrite reumatoide apresentaram pesquisa positiva de fator reumatoide (FR) e anticorpos IgG anti-CCP3 (a pesquisa de FR foi realizada por nefelometria, utilizando o Sistema BN Prospec II, Siemens, Marburg, Alemanha; a pesquisa de anticorpos IgG anti-CCP3 foi realizada utilizando kits Quanta-Lite CCP3 IgG ELISA, Inova Diagnostics Inc, San Diego, California, EUA). Os três pacientes com síndrome de Sjögren apresentavam pesquisa de anti-SSA (Ro) positiva e os três pacientes com esclerose sistêmica apresentavam pesquisa de
anticorpos anti-Scl70 positiva (a pesquisa desses anticorpos foi realizada utilizando kits ELISA ENA Screen - Orgentec Diagnostika, Mainz, Alemanha). Dos nove pacientes com mieloma múltiplo, quatro pacientes apresentavam mieloma de IgG (valores de IgG >4.000 mg/dL) e cinco pacientes apresentavam mieloma de IgA (valores de IgA >1.800 mg/dL), sendo a pesquisa dessas imunoglobulinas realizada por nefelometria (utilizando o Sistema BN Prospec II). Os quatro pacientes com hepatite A apresentavam pesquisa de anticorpos IgM e IgG reagente para o vírus; os seis pacientes com hepatite B apresentavam pesquisa de HbsAg reagente; somente um desses pacientes tinha pesquisa HbeAg positiva (a pesquisa de anticorpos para as hepatites A e B foi realizada com o sistema Architect, Abbott Ireland, Sligo, Irlanda). Os três pacientes com CMV apresentavam pesquisa de IgM e IgG positivas, utilizando o sistema VIDAS (BioMérieux, Marcy l’eEtoile, França). Os dois pacientes com mononucleose apresentavam pesquisa de IgM e IgG anti-VCA positivas, com pesquisa de EBNA negativa (a pesquisa de anticorpos IgM e IgG foi realizada com o sistema VIDAS, enquanto a pesquisa de anticorpos anti-EBNA foi realizada com o sistema Architect).
CLIFT
A técnica CLIFT foi realizada com os kits Scimedx, (Scimedx, New Jersey, EUA) ou Immuno Concepts N.A Ltda (Sacramento, California, EUA), seguindo as instruções dos fabricantes. Títulos de CLIFT ≥1/10 foram considerados significativos. Resumidamente, 10 µl dos soros sendo testados diluídos a 1:10 em tampão apropriado e dos controles positivo e negativo dos kits foram adicionados às delimitações de lâminas contendo C. luciliae. As lâminas foram incubadas em câmara úmida, por 30 min., em temperatura ambiente (TA). Após a incubação com os soros e controles, as lâminas foram submetidas a duas lavagens de cinco min. cada com tampão apropriado. Após a secagem das lâminas, a cada delimitação das mesmas foram adicionados 10 µl do conjugado (anticorpos anti-IgG humana marcados com fluoresceína). As lâminas foram novamente incubadas em câmara úmida, por 30 min., em TA. Em seguida, as lâminas foram novamente submetidas a duas lavagens com o tampão apropriado. Após a lavagem, foram adicionadas a cada lâmina quatro
ou cinco gotas de glicerina tamponada e, sem exercer muita pressão, uma lamínula foi colocada sobre cada lâmina. As reações foram visualizadas em microscópio de imunofluorescência, com um aumento de 40x (Olympus BX-40, Olympus Corporation, Tóquio, Japão).
Padrões positivo e negativo para anticorpos anti-DNAds
Um pool positivo para anticorpos anti-DNAds foi preparado misturando soros de dez pacientes com LES que apresentavam pesquisa de anticorpos anti-DNAds positiva por CLIFT e ELISA em ensaios prévios. O pool negativo para anticorpos anti-DNAds, foi preparado misturando soros de dez pessoas sadias que apresentavam pesquisa de anticorpos anti-DNAds negativa por CLIFT e ELISA em ensaios prévios. Após centrifugação dos pools positivo e negativo a 7.200 x g, por uma hora, a 4ºC (centrífuga Sigma, 2k15), os sobrenadantes foram retirados com auxílio de seringa e agulha, aliquotados e estocados a - 20ºC até o momento do uso. Ao pool positivo foi designado um valor de 100 unidades arbitrárias (UA) de anticorpos IgG anti-DNAds/mL. Esse pool foi diluído com solução salina tamponada com fosfatos (SST) 0,15M pH=7,4 contendo 0,05% de Tween 20 (T) e 0,05% de SAB (SST-T-SAB), para a confecção de padrões contendo diferentes concentrações de anticorpos IgG anti-DNAds (100 UA/mL, 50 UA/mL, 25 UA/mL, 12,5 UA/mL, 6,25 UA/mL, 3,12 UA/mL e 1,56 UA/mL).
Determinação das concentrações ótimas dos reagentes
A técnica ELISA foi padronizada usando quantidades em excesso de todos os reagentes, exceto aquele sendo testado. Para a titulação do antígeno, foram testadas concentrações de DNA variando de 0,3 a 100 μg/mL. Para a titulação do conjugado (anticorpos anti-IgG humana marcados com peroxidase) foram testadas diluições variando de 1:500 a 1:64.000.
Linearidade da conversão do substrato
A linearidade da conversão do substrato foi determinada utilizando um padrão sérico contendo 50 UA/mL. A taxa de conversão do substrato foi
analisada a diferentes intervalos de tempo de incubação (1 min. a 30 min.), em TA, no escuro.
ELISA
Cavidades de placas de poliestireno (Nunc MaxiSorp®, Thermo
Fisher Scientific, EUA) foram tratadas com 100 μl de uma solução de PLL diluída a 20 μg/mL em tampão carbonato-bicarbonato 0,1M, pH=9,5 durante duas horas em TA e overnight a 4ºC. Após três lavagens com SST (200 μl em cada cavidade), foram adicionados às cavidades das placas 100 μl de uma solução de DNAds de timo de vitelo diluído a 20 μg/mL em tampão Tris-NaCl- HCl, 0,15M, pH=8,0. Após incubação das placas por 3h30min em TA, as cavidades das placas foram lavadas uma vez com SST contendo 0,05% de Tween 20 (SST-T) e às mesmas foram adicionados 100 μl de uma solução SAB a 0,1% em SST-T. As placas foram incubadas por 10 min. em TA e suas cavidades lavadas uma vez com SST-T. Em seguida, foram adicionados às cavidades das placas 100 μl de uma solução de S1 nuclease de Aspergillus oryzae contendo 40 U/mL, diluída em tampão acetato de sódio-ácido acético glacial 50 mM, pH=4,6, contendo 5 mg/mL de SAB, e as placas foram incubadas por 1h30min em TA. Após três lavagens com SST-T, foram adicionadas às cavidades das placas 100 μl dos padrões e das amostras de soros diluídas a 1:200 em SST-T-SAB. Após incubação por uma hora em TA e três lavagens com SST-T, foram adicionados às cavidades das placas 100 μl do conjugado diluído a 1:4.000 em SST-T. Após 45 min. de incubação em TA e três lavagens com SST-T, foram adicionadas às cavidades das placas 100 μl do sistema substrato (0,42 mM de TMB e 1,42 mM de H2O2) em tampão acetato
de sódio/ácido acético glacial, 0,1M, pH=5,5. Após incubação no escuro, em TA, por dez min., as reações foram bloqueadas pela adição de 50 μl de uma solução de ácido sulfúrico (H2SO4) a 2N em cada cavidade da placa. Em cada
placa de reação, foram incluídos padrões positivos, contendo 100 UA/mL, 50 UA/mL, 25 UA/mL, 12,5 UA/mL, 6,25 UA/mL, 3,12 UA/mL e 1,56 UA/mL e o padrão negativo. A leitura das absorbâncias das reações foi realizada a 450 nm em leitora de ELISA Multiskan (Labsystems, Helsinki, Finlândia). As amostras de soros e os padrões foram testados em triplicata e a absorbância média foi
determinada. A curva obtida com os padrões positivos foi utilizada para transformar as absorbâncias médias das amostras de soros dos pacientes em UA/mL. O cut-off da técnica ELISA foi determinado utilizando uma curva ROC (Receiver Operating Characteristic).
Determinação da variação inter-ensaio
A variação inter-ensaio foi determinada usando um padrão sérico contendo 50 UA/mL em 14 dias alternados. O padrão foi testado sempre em triplicata e a absorbância média utilizada para o cálculo do coeficiente de variação.
Análise dos dados
O teste Q de Cochran foi usado para comparar as sensibilidades e especificidades das reações.120 Diferenças entre os resultados foram
consideradas significantes quando p ≤ 0,05. Os testes estatísticos utilizados para a determinação da sensibilidade e especificidade da técnica ELISA foram realizados utilizando o programa computacional SAS System for Windows (Statistical Analysis System), versão 9.4 (SAS Institute Inc, 2002-2008, Carly, NC, EUA).
Determinação da avidez dos anticorpos IgG anti-DNAds
A determinação da avidez dos anticorpos IgG anti-DNAds foi realizada em 15 amostras de soros de pacientes com LES, escolhidas ao acaso. Para a determinação da avidez, na técnica ELISA padronizada, foi incluída uma incubação com 200 μL de ureia 6M em SST ou apenas SST (controle), por 15 min, em TA, após a incubação com as amostras de soros, seguida de três lavagens com SST, antes da incubação com o conjugado. A leitura das absorbâncias das reações foi realizada a 450 nm em leitora de ELISA Multiskan (Labsystems, Helsinki, Finlândia). As amostras de soros foram testadas em triplicata e a absorbância média determinada. Os índices de avidez da IgG (IAvIgG) foram determinados utilizando a fórmula descrita a seguir:
IAvIgG = 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏â𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑜𝑏𝑡𝑖𝑑𝑎 𝑐𝑜𝑚 𝑜𝑠 𝑠𝑜𝑟𝑜𝑠 𝑡𝑟𝑎𝑡𝑎𝑑𝑜𝑠 𝑐𝑜𝑚 𝑢𝑟𝑒𝑖𝑎 𝑒𝑚 𝑆𝑆𝑇