UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
ELISÂNGELA DE OLIVEIRA RIBEIRO CAVALCANTE
DESENVOLVIMENTO DE UMA TÉCNICA IMUNOENZIMÁTICA (ELISA) QUANTITATIVA PARA A PESQUISA DE ANTICORPOS IgG ANTI-DNA NATIVO
(DNAds) NO LÚPUS ERITEMATOSO SISTÊMICO
CAMPINAS 2017
ELISÂNGELA DE OLIVEIRA RIBEIRO CAVALCANTE
DESENVOLVIMENTO DE UMA TÉCNICA IMUNOENZIMÁTICA (ELISA) QUANTITATIVA PARA A PESQUISA DE ANTICORPOS IgG ANTI-DNA NATIVO
(DNAds) NO LÚPUS ERITEMATOSO SISTÊMICO
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de mestra em Ciências Médicas, na área de concentração de Ciências Biomédicas.
ORIENTADOR: Prof. Dr. CLÁUDIO LÚCIO ROSSI
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA ELISÂNGELA DE OLIVEIRA RIBEIRO CAVALCANTE, E ORIENTADA PELO Prof. Dr. CLÁUDIO LÚCIO ROSSI.
CAMPINAS 2017
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE MESTRADO
ELISÂNGELA DE OLIVEIRA RIBEIRO CAVALCANTEORIENTADOR: CLÁUDIO LÚCIO ROSSI
MEMBROS:
1. PROF. DR. CLÁUDIO LÚCIO ROSSI
2. PROF. DR. CRISTÓVÃO LUIS PITANGUEIRA MANGUEIRA
3. PROFA. DRA. CÉLIA REGINA GARLIPP
Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho ao meu avô, Jorge, que foi também pai, por ter sempre me motivado a buscar conhecimento.
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Cláudio Lúcio Rossi, pela confiança e paciência, pelo conhecimento compartilhado e pela oportunidade de desenvolver este trabalho.
À Dra. Lisandra Akemi Suzuki, pela ajuda no desenvolvimento desse trabalho e pelas conversas bem-humoradas.
Aos meus pais e irmã, por acreditar em mim e me ajudarem de todas as formas para que eu pudesse chegar até aqui.
Aos meus amigos que, de maneira indireta, tornaram este caminho mais fácil e alegre.
RESUMO
O lúpus eritematoso sistêmico (LES) é uma doença autoimune crônica caracterizada pela produção de anticorpos direcionados a uma grande variedade de componentes da própria pessoa, incluindo antígenos intracelulares do núcleo celular. A detecção de anticorpos contra o DNA nativo (ds) é um dos critérios de classificação para o diagnóstico do LES. O presente estudo teve como objetivo desenvolver uma técnica imunoenzimática (ELISA) quantitativa para a detecção de anticorpos IgG anti-DNAds. O desempenho da técnica ELISA foi comparado com o teste de imunofluorescência indireta com Crithidia luciliae (CLIFT) como referência. Anticorpos IgG anti-DNAds foram pesquisados por ELISA e CLIFT em amostras de soros de 127 pacientes com LES, 56 pacientes com outras doenças e 37 pessoas sadias. A técnica ELISA apresentou sensibilidade de 92,9% e especificidade de 94,6%, enquanto a sensibilidade e especificidade da técnica CLIFT foram de 85,8% e 100%, respectivamente. O teste Q de Cochran foi utilizado para comparar as sensibilidades e especificidades das reações (diferenças entre os resultados foram consideradas significantes quando p ≤ 0,05). De acordo com a análise estatística, a técnica ELISA apresentou sensibilidade significativamente maior do que a obtida com a técnica CLIFT (p=0,0027), enquanto a técnica CLIFT apresentou especificidade significativamente maior do que a obtida com a técnica ELISA (p=0,0253). A técnica ELISA também pode ser utilizada para determinar a avidez dos anticorpos IgG anti-DNAds. Os índices de avidez desses anticorpos em 15 amostras de soros de pacientes com LES, selecionadas aleatoriamente, variaram de 58,5% a 96,9%. A técnica ELISA para a pesquisa de anticorpos IgG anti-DNAds desenvolvida nesse estudo apresentou ótimos resultados em termos de sensibilidade e especificidade, podendo ser útil em pesquisa e rotina diagnóstica.
ABSTRACT
Systemic lupus erythematosus (SLE) is a chronic systemic autoimmune disease characterized by the production of antibodies to a large variety of self-components, including intracellular antigens of the cell nucleus. The detection of anti -double-stranded (ds) DNA antibodies is part of the classification criteria for diagnosing SLE. In this study, a quantitative enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of anti-dsDNA IgG antibodies was developed. The performance of the ELISA was compared with the Crithidia luciliae indirect immunofluorescence test (CLIFT) as a reference. Anti-dsDNA IgG antibodies were screened by ELISA and CLIFT in serum samples from 127 patients with SLE, 56 patients with other diseases and 37 healthy persons. The ELISA had a sensitivity of 92.9% and specificity of 94.6%, whereas the sensitivity and specificity of the CLIFT were 85.8% and 100%, respectively. The Cochran Q test was used to compare the sensitivities and specificities of the reactions (differences among results were considered significant when p ≤ 0.05). Based on the statistical analysis, the ELISA had a significantly greater sensitivity than the CLIFT (p=0.0027), whereas the CLIFT had a significantly greater specificity than the ELISA (p=0.0253). This assay may also be used to determine the avidity of anti-dsDNA IgG antibodies. The avidity indices of these antibodies in serum samples from 15 randomly selected patients with SLE ranged from 58.5% to 96.9%. The ELISA for the detection of anti-dsDNA IgG antibodies developed in this work showed excellent results in terms of sensitivity and specificity and could be useful in research and routine diagnostics.
ILUSTRAÇÕES
Técnica ELISA para determinação da avidez de anticorpos IgG anti-DNAds.
LISTA DE FIGURAS, TABELAS E QUADROS
p. Figura 1.Curva ROC para avaliação do desempenho da técnica ELISA ... 44 Figura 2.Anticorpos anti-DNAds detectados pela técnica ELISA. ... 45
Tabela I. Prevalência mundial do LES. ... 19/20
Tabela II. Índices de avidez (IAv) dos anticorpos IgG anti-DNAds em 15 amostras de soros de pacientes com LES ... 46
Quadro I. Critérios clínicos adotados pelo ACR (1997) e SLICC (2012) para o diagnóstico do LES. ... 33/34 Quadro II. Critérios imunológicos adotados pelo ACR (1997) e SLICC (2012) para o diagnóstico do LES. ... 35
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
LES - Lúpus eritematoso sistêmico SNC - Sistema nervoso central IFI - Imunofluorescência indireta ANA - Anticorpo antinuclear DNAds - DNA nativo (fita dupla) RNP - Ribonucleoproteína
ACR - American College of Rheumatology
SLICC - Systemic Lupus International Collaborating Clinics UV - Ultravioleta
LCEC - Lúpus cutâneo eritematoso crônico LCES - Lúpus cutâneo eritematoso subagudo LCEA - Lúpus cutâneo eritematoso agudo
RPC - Relação entre as concentrações de proteína/creatinina VHS - Velocidade de hemossedimentação
Anti-Sm - Anticorpos direcionados contra o antígeno Smith (Sm) ELISA - Ensaio imunoenzimático
RIA - Radioimunoensaio C. luciliae - Crithidia luciliae
CLIFT - IFI utilizando o hemoflagelado Crithidia luciliae como substrato PLL - Poli-L-lisina
SAB - Soroalbumina bovina
Anti-DNAss - Anticorpos direcionados contra DNA de fita simples DITC - Doença indiferenciada do tecido conjuntivo
DMTC - Doença mista do tecido conjuntivo CIE - Contraimunoeletroforese
PCNA - Anticorpos contra o antígeno de proliferação celular Anti-LA - Anticorpo anticoagulante lúpico
aCL - Anticorpo anticardiolipina LE - Lúpus eritematoso
RPR - Teste rápido para a pesquisa de reagina plasmática SLEDAI - SLE Disease Activity Index
ECLAM - European Consensus Lupus Activity Measurement EULAR - European League Against Rheumatism
TMB - Tetrametilbenzidina H2O2 - Peróxido de hidrogênio
CMV - Citomegalovírus FR - Fator reumatoide
HBsAg - Antígeno de superfície do vírus da hepatite B HBeAg - Antígeno “e” do vírus da hepatite B
VCA - Antígeno do capsídeo viral do vírus Epstein-Barr EBNA - Antígeno nuclear do vírus Epstein-Barr
TA - Temperatura ambiente UA - Unidades arbitrárias
SST - Solução salina tamponada com fosfatos 0,15M, pH=7,4 T - Tween 20
SST-T - SST contendo 0,05% de Tween 20 SST-T-SAB - SST-T contendo 0,05% de SAB H2SO4 - Ácido sulfúrico
CMVi - Citomegalovirose IAv - Índice de avidez
PTT - Tempo de tromboplastina parcial
FTA-Abs - IFI para a pesquisa de anticorpos anti-Treponema pallidum TPI - Teste de imobilização do Treponema pallidum
E. coli - Escherichia coli
DNP - Desoxiribonucleoproteína DTC - Doença do tecido conectivo VPP - Valor preditivo positivo VPN - Valor preditivo negativo
CREST - Esclerose sistêmica de forma limitada Fm - Flavobacterium menignosepticum Sp - Streptococcus pyogenes Sm - Seratia marcescens St - Salmonella typhimurium Pv - Proteus vulgalis Ag: Antígeno UI - Unidades internacionais
SUMÁRIO p. INTRODUÇÃO ... 16 Aspectos históricos ... 16 Epidemiologia ... 18 Etiopatogênese ... 21 Quadro Clínico ... 22 Manifestações musculoesqueléticas ... 23 Manifestações hematológicas ... 23 Manifestações pulmonares ... 23 Manifestações cutâneas ... 24 Manifestações renais ... 24 Manifestações cardiovasculares ... 25 Manifestações neuropsiquiátricas... 26 Manifestações gastrointestinais ... 26 Manifestações oculares ... 26 Achados Laboratoriais ... 27 Diagnóstico... 32 Tratamento ... 35
Considerações sobre as técnicas ELISA utilizadas para a pesquisa de anticorpos anti-DNAds ... 36 OBJETIVO ... 37 MATERIAL E MÉTODOS... 38 Reagentes ... 38 Casuística ... 38 CLIFT... 39
Padrões positivo e negati vo para anticorpos anti-DNAds ... 40
Determinação das concentrações ótimas dos reagentes ... 40
Linearidade da conversão do substrato ... 40
ELISA ... 41
Determinação da variação inter-ensaio ... 42
Análise dos dados ... 42
Determinação da avidez dos anticorpos IgG anti-DNAds ... 42
ASPECTOS ÉTICOS ... 43 RESULTADOS ... 44 DISCUSSÃO... 47 CONCLUSÃO... 90 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 91 ANEXOS ...111
INTRODUÇÃO
O lúpus eritematoso sistêmico (LES) é uma doença autoimune crônica, que se caracteriza pela produção de anticorpos direcionados a um grupo amplo e heterogêneo de componentes da própria pessoa, podendo afetar diversos órgãos, resultando em várias manifestações clínicas e anormalidades laboratoriais.1–5
Aspectos históricos
O termo lúpus (lobo em latim) foi utilizado pela primeira vez na era medieval, para descrever erupções cutâneas, pois se acreditava que as lesões observadas eram geradas pela mordida de lobos. Este termo continuou sendo utilizado no século XIX para pacientes que apresentavam úlceras e necrose na face.6,7
Acredita-se que a primeira vez que a palavra lúpus foi utilizada para caracterizar uma doença foi em 855 d.C. O arcebispo Herbernus relatou em seu livro Miracles of St. Martin o caso de um bispo de Liège (conhecido como Hildricus) que possuía uma doença denominada lúpus. Os sintomas clínicos apresentados eram principalmente a formação de úlceras por todo o corpo. Segundo o relato, Hildricus se curou da doença milagrosamente após permanecer sete dias no santuário de São Martin.8
No século XII, o cirurgião Rogerius Frugardi e seus alunos descreveram o lúpus como uma condição rara de úlcera na pele. Essa ideia foi confirmada por Philippus von Hohenheim (Paracelsus), que defendia a ideia de tratamento do lúpus com sangria, devido ao fato dos tecidos danificados pela doença possuírem maior quantidade de sangue.6,9
Em 1790, o dermatologista Robert Willan classificou e ilustrou as doenças de pele, baseando-se em suas observações clínicas. O lúpus foi descrito como uma doença destrutiva e ulcerativa que podia acometer a face e nariz. O trabalho de Willan foi concluído e publicado em 1813 pelo dermatologista Thomas Bateman, com o lúpus sendo descrito como uma doença capaz de causar erupção nodular que progredia para a úlcera, geralmente observada na pele.6,9
Em 1846, o dermatologista Ferdinand von Hebra observou dois tipos de lesões no lúpus, manchas em forma de disco e manchas menores confluentes. O termo ‘borboleta’ foi utilizado pela primeira vez por Von Hebra para caracterizar o eritema malar característico de pacientes com lúpus.3,7,10
Em 1850, o dermatologista Pierre Cazenave utilizou pela primeira vez o termo lúpus eritematoso, caracterizado como uma condição rara, encontrada frequentemente em mulheres jovens que acometia principalmente a face.7,11
De acordo com suas observações, os pacientes apresentavam manchas vermelhas arredondadas levemente elevadas que aumentavam de tamanho e, em alguns casos, estendiam-se por toda a face. Apenas as bordas das manchas eram proeminentes e o centro mantinha a coloração natural. As lesões apresentavam calor e vermelhidão, porém nenhuma dor ou coceira.6 Em
1972, o dermatologista Moritz Kaposi, discípulo de von Hebra, observou outras manifestações clínicas em pacientes com lúpus, além das lesões cutâneas, e sugeriu que a doença fosse classificada em discoide (lesões cutâneas) e disseminada (presença de nódulos subcutâneos, artrite com hipertrofia sinovial, linfadenopatia, febre, perda de peso, anemia e envolvimento do sistema nervoso central - SNC).3,10
A relação entre fotossensibilidade e eritema malar foi descrita pelo cirurgião Jonathan Hutchinson, em 1888.6 A expressão lúpus eritematoso
sistêmico foi usada pela primeira vez pelo médico William Osler, em 1895, após a realização de uma pesquisa com pacientes apresentando lesões na pele, dor no peito, rins comprometidos, derrames e envolvimento do cérebro.3,6,7,12
A nefrite lúpica e a acroasfixia (posteriormente conhecida como fenômeno de Raynaud) foram descritas pelo dermatologista James Sequeira e pelo cirurgião Hermann Balean, em 1902; o envolvimento pulmonar foi observado pelos médicos Alfred Kraus e Carl Bohac, em 1908, e o envolvimento cardíaco descrito pelos médicos Emanuel Libman e Benjamin Sacks, em 1923.6
Em 1948, os hematologistas Malcolm Hargraves e Robert Morton e a técnica de laboratório Helen Richmond observaram em pacientes com lúpus disseminado células com inclusão basófila, resultantes da presença de uma substância que reagia com os constituintes dos núcleos celulares, que foram
denominadas células LE.6,13 Em 1958, o médico George Friou mostrou que
essa substância era uma gamaglobulina e seu alvo dentro do núcleo era o complexo histonas-DNA. Friou denominou esta globulina de fator antinuclear e posteriormente descreveu um teste de imunofluorescência indireta (IFI) para detectar a presença desses fatores.6,14 A descoberta das células LE e seu
mecanismo de atuação mostraram que o LES era uma doença autoimune. Por vários anos, a detecção de células LE foi o teste mais utilizado para o diagnostico laboratorial da doença. A partir da década de 50, outros marcadores sorológicos relacionados ao diagnóstico do lúpus foram descritos, como o teste de IFI para a pesquisa de anticorpos antinucleares (ANAs) e o teste da sífilis falso positivo (descrito originalmente em 1900).1,10 Nos anos
seguintes, novos autoanticorpos responsáveis pelos sintomas clínicos observados no LES foram descobertos, incluindo anticorpos contra DNA nativo (DNAds), antígenos nucleares (ribonucleoproteína - RNP, Smith, Ro e La) e fosfolípides e novas técnicas foram implementadas para a sua detecção.1,6
Em 1971, o American College of Rheumatology (ACR) estabeleceu a primeira lista de critérios classificatórios para o diagnóstico do LES.15 Em
1982, uma revisão da classificação incluiu novos testes sorológicos tornando os critérios mais sensíveis e específicos.16 Em 1997, uma nova revisão excluiu
dos critérios a detecção de células LE e alterou a interpretação dos testes relativos à detecção de anticorpos antifosfolípides.17 Em 2012, a organização
Systemic Lupus International Collaborating Clinics (SLICC) revisou os critérios propostos pelo ACR (1997), incluindo novos critérios clínicos e laboratoriais, estabelecendo, outra classificação para o diagnóstico do LES. Nessa classificação, os testes sorológicos e a concentração de componentes do sistema complemento ganharam maior importância para o diagnóstico da doença.18,19
Epidemiologia
Embora o LES possa acometer pessoas de qualquer gênero, idade e etnia, independente da região em que se encontram,1,20 a doença é
observada predominantemente em mulheres adultas, em uma proporção de aproximadamente 9 mulheres para cada homem.1,4 Cerca de 15% a 20% dos
casos de LES ocorrem na infância, com a doença causando danos mais severos nessa fase da vida.21
A incidência e a prevalência mundial do LES variam substancialmente, sendo influenciadas por fatores étnicos, geográficos e ambientais.22,23 A incidência do LES é maior em algumas etnias; populações
não-caucasianas são três a quatro vezes mais suscetíveis à doença do que a população caucasiana.4,23,24 LES com envolvimento cutâneo tem sido
frequentemente descrito em países tropicais, devido à exposição à luz ultravioleta (UV).22
O LES já foi descrito na Europa, América do Norte, América do Sul, África, Ásia e Austrália.25 A incidência mundial do LES varia de 0,3 a 31,5 casos
novos em 100.000 pessoas por ano.4,23 No Brasil, existem poucos estudos para
avaliar a incidência da doença em nosso meio. Estudos realizados nas cidades de Natal/RN e Cascavel/PR mostraram que a incidência da doença em Natal (8,7 casos novos/100.000 pessoas/ano) foi maior que incidência em Cascavel (4,8 casos novos/100.000 pessoas/ano). A diferença na incidência da doença nestas duas regiões pode ser explicada pelo fato da população afrodescendente ser maior em Natal e pelo fato dessa cidade apresentar maior incidência de raios UV do que Cascavel, devido à sua posição geográfica.26,27
As taxas de prevalência mundial do LES variam de 3,2 a 517,5 casos em 100.000 pessoas.4,23 A Tabela I mostra a prevalência do LES em diversos
países, ressaltando a maior prevalência da doença em mulheres. Tabela I. Prevalência mundial do LES.
País Prevalência
(no de casos/100.000 habitantes)
Geral Mulheres Homens
Reino Unido 24,0-517,5 35,0-177,0 3,7 Espanha 17,5-34,1 29,2-57,9 5,8-8,3 Itália 57,9-81,0 100,1 12,0 França 47,0 ND ND Turquia 59,0 104,0 12,0 Grécia 39,5-110,0 69,3 9,5
Tabela I (cont.). Prevalência mundial do LES.
País Prevalência
(no de casos/100.000 habitantes)
Geral Mulheres Homens
Islândia 35,9 62,0 7,2 Suécia 39,0-85,0 64,8-144 11,7-25,0 Irlanda 25,4 ND ND Noruega 44,9-51,8 89,3-91,0 9,7-10,7 Dinamarca 21,9-28,3 ND ND Rússia 9,0 15,8 0,5 Ucrânia 14,9 23,8 3,7 Cazaquistão 20,6 35,9 1,8 EUA 42,0-300,0 45,0-408,2 4,4-54,0 Canadá 31,9-51,0 271,0-322,0 32,0 Brasil 98,0 110,0 90,0 Argentina 58,6 83,2 23,0 Venezuela 70,0 ND ND Curaçau 47,0 83,8 8,5 México 60,0 80,0 40,0 Cuba 60,0 100,0 0,0 Barbados 84,1 152,6 10,1 África * * * Taiwan 37,0-97,5 66,6-179,4 8,4-28,5 Coreia do Sul 18,8-26,5 35,7-45,8 5,5-7,5 Malásia 43,0 ND ND China 30,0-37,6 60,0-67,8 0-6,2 Japão 3,7-37,7 6,6-68,4 0,83-7,0 Índia 3,2 ND ND Paquistão 50,0 ND ND Irã 40,0-190,0 250,0 110,0 Iraque 53,6 88,7 ND Austrália 19,3-92,8 127,0 ND
Adaptada de Carter et al., 2016. ND: Não documentado. *Não foram encontrados estudos sobre a prevalência do LES no local.
A incidência e a prevalência do LES parecem estar aumentando, devido principalmente às mudanças relacionadas aos critérios de classificação e aos testes laboratoriais, cada vez mais sensíveis e específicos.28
Etiopatogênese
A etiologia do LES não é completamente conhecida, porém acredita-se que a interação de fatores genéticos, ambientais e hormonais influencie o desenvolvimento da doença.29–31
A ocorrência da doença em uma mesma família foi notada em 1954 pelo cirurgião Leonhardt e confirmada em 1976 pelos médicos Frank Arnett e Lawrence Shluman.32,33 O reconhecimento da predisposição genética, a
verificação da doença em gêmeos monozigóticos e a associação com marcadores genéticos esclareceram vários aspectos do LES.1,3
No LES foram descritos mais de 50 loci relacionados à suscetibilidade da doença, com raros casos sendo associados à deficiência de apenas um gene. Provavelmente, diferentes aspectos envolvidos na desregulação da resposta imune, como fagocitose, apresentação de antígenos e apoptose, são controlados por diferentes genes ou pela interação entre os mesmos.34 O intervalo 1q23-24 do cromossomo 1 tem sido associado à doença
em pacientes de diversas populações. Os loci que estão mais associados com o risco de desenvolvimento do LES são: ITGAM, FcγR, PRDM1-ATG5 e TNFAIP3.28,34
O principal fator ambiental que parece influenciar a ocorrência da doença é a exposição à luz UV. Cerca de 70% dos pacientes apresentam ativação da doença após a exposição a esse tipo de luz.35 Outros fatores como
a exposição à sílica, tabagismo e medicações também são considerados importantes para o desenvolvimento do LES.28,29,34 Alterações epigenéticas,
como a hipometilação do DNA, também têm sido descritas como possível causa da doença.36 Alguns estudos sugerem que a autoimunidade observada
no LES possa ser ocasionada pela desregulação do sistema imune, após uma infecção por vírus, bactéria ou fungo. Entre os vírus mais frequentemente associados à doença, destacam-se o vírus Epstein-Barr, o parvovírus B19, o citomegalovírus e os retrovírus.37,38
Vários estudos demonstraram que o desequilíbrio hormonal, principalmente alterações relacionadas aos hormônios sexuais e da tireoide, pode modular a incidência e severidade do LES.1 Na fase adulta, há
predominância da doença no sexo feminino (9 mulheres/1 homem), indicando efeito do hormônio estrogênio.35 Alguns estudos sugerem que mulheres que
utilizam contraceptivos à base de estrógeno podem apresentar maior risco de desenvolver a doença. O estrógeno representa um papel importante na resposta imune, devido a estimulação de células do sistema, incluindo timócitos, células B, células TCD4 e TCD8 e macrófagos.34,35
Independente da causa, o sistema imune de pacientes com LES não é capaz de diferenciar moléculas próprias de antígenos externos.39 A formação
de autoanticorpos depende do recrutamento, ativação e expansão dos linfócitos B autorreativos e células TCD4 pelos autoantígenos apresentados. Células dendríticas apresentadoras de antígenos são necessárias para a ativação das células B e TCD4 e contribuem com a produção de citocinas, que em associação com os autoanticorpos, promovem a grande maioria das lesões teciduais observadas no LES.1,40 Os autoanticorpos produzidos no LES
exercem seu efeito patogênico por meio de quatro mecanismos principais: (a) formação de imunocomplexos e deposição nos órgãos, com ativação do sistema complemento (anti-DNAds e anti-nucleossomos); (b) ligação a constituintes de superfície e citólise ou citotoxicidade (anti-Ro/La, anti-P-ribossomal, anti-linfócito, anti-eritrócito e anti-fosfolípide); (c) penetração em células e indução de disfunção celular (anti-DNAds e anti-U1RNP) e (d) ligação à moléculas extracelulares por reatividade cruzada (anti-cromatina, anti-DNAds e anti-fosfolípide).2 Os autoanticorpos caracterizados como patogênicos
possuem alta especificidade e afinidade. Autoanticorpos também podem ocorrer em pessoas sadias, geralmente com baixa especificidade e afinidade.39
Quadro Clínico
O LES é uma doença que apresenta manifestações clínicas que podem acometer diversos órgãos e sistemas. Geralmente, períodos de atividade e remissão da doença se alternam.1,41
Manifestações musculoesqueléticas
O comprometimento musculoesquelético no LES é muito frequente (entre 69% a 95% dos pacientes), sendo artrite, artralgia, osteonecrose e miopatia (ou miosite) os sintomas mais observados. Geralmente, a partir desses sintomas o diagnóstico inicial da doença é estabelecido. Comumente, a artrite e artralgia no LES são intermitentes, não erosivas e causam dor em pequenas articulações, como joelhos, articulações do carpo e dedos. Em alguns casos, deformidades denominadas “Artropatia de Jaccoud” comprometem a funcionalidade do local acometido (geralmente tendões e cápsulas).41,42
Manifestações hematológicas
Desequilíbrios hematológicos são frequentes em pacientes com LES, devido à própria doença ou decorrentes do tratamento medicamentoso.43
As principais manifestações hematológicas observadas nesses pacientes são a trombofilia e citopenia (anemia, trombocitopenia, leucopenia, linfopenia e neutropenia).1 A anemia, causada por mecanismos imunes e não imunes, é
comum no LES, com 57% a 78% dos pacientes apresentando essa anormalidade no curso da doença, caracterizada pelo nível de hemoglobinas <12 g/dL em mulheres e <13,5 g/dL nos homens. A trombocitopenia discreta (100.000 a 150.000 plaquetas/mm3) é observada em 25% a 50% dos pacientes,
enquanto trombocitopenia acentuada (<50.000 plaquetas/mm3) somente em
10%. A leucopenia (<4.000 leucócitos/mm3) em duas ou mais ocasiões pode
ser observada em até 50% dos pacientes. A linfopenia (<1.500 linfócitos/mm3)
em duas ou mais ocasiões pode ser observada em 20% a 75% dos pacientes.35,43,44 Anticorpos contra fatores de coagulação (VIII, IX, XI e XIII)
podem causar alterações nos testes de coagulação e sangramentos.35
Manifestações pulmonares
Geralmente, os pulmões são afetados mais tardiamente do que outros órgãos, embora complicações pulmonares sejam frequentes no curso da doença, afetando 50% a 70% dos pacientes com LES.35 Os principais
sintomas clínicos observados são: pleurite, pneumonite, hemorragia alveolar difusa e hipertensão pulmonar.1,45
Manifestações cutâneas
O comprometimento cutâneo é muito comum em pacientes com LES, sendo a pele um dos órgãos mais afetados pela doença (aproximadamente 80% dos pacientes). Estudos têm mostrado que queratinócitos expostos aos raios UV se tornam apoptóticos e liberam material nuclear capaz de estimular o sistema imune a produzir autoanticorpos, originando um processo de inflamação local. A inflamação gerada resultará na formação de lesões teciduais, como o eritema malar, lesões discoides e alopecia.20,35,46 O eritema malar é uma lesão sobre a pele das bochechas e
nariz, também conhecida como ‘asa de borboleta’, que pode ser dolorida ou prurida. As lesões discoides na pele apresentam forma arredondada de diferentes tamanhos com coloração avermelhada, podendo também ser doloridas ou pruridas. Lúpus com apenas comprometimento cutâneo pode ser classificado quanto a sua severidade em lúpus cutâneo eritematoso crônico (LCEC), lúpus cutâneo eritematoso subagudo (LCES) e lúpus cutâneo eritematoso agudo (LCEA).1,47
Manifestações renais
O envolvimento renal no LES é bastante frequente, podendo ocorrer em 50% a 70% dos pacientes. Geralmente, as manifestações renais surgem entre dois a cinco anos após o início da doença, e quando se apresentam como uma das primeiras manifestações do LES (3% a 6%) pioram o prognóstico dos pacientes.35 Os complexos imunes que se depositam nos rins, principalmente
aqueles compostos de DNA/anti-DNA, podem induzir a ativação do sistema complemento, podendo causar lesões sérias, como a nefrite lúpica.35,46 A
presença de proteinúria persistente (>0,5 g/24h) e a relação entre as concentrações de proteína/creatinina (RPC) na urina >1,0, indicativa de proteinúria renal, têm sido consideradas marcadores de nefrite lúpica.48,49
o-intersticiais, epiteliais (podócitos), endoteliais, mesenquimais e vasculares, que variam entre os pacientes e podem evoluir de um padrão de lesão a outro.1,50
A nefrite lúpica pode resultar em falência renal e/ou cardiovascular, sendo classificada histologicamente em seis classes (I a VI), de acordo com a Organização Mundial de Saúde. Na nefrite de classe I, raramente observada em pacientes com LES (glomerulonefrite mesangial mínima), não é possível observar alterações nos glomérulos pelas técnicas de microscopia óptica, eletrônica e imunofluorescência. A nefrite de classe II (glomerulonefrite mesangial proliferativa) se caracteriza pela presença de hipercelularidade ou expansão da matriz mesangial em microscopia óptica, geralmente com evolução benigna. A nefrite de classe III (glomerulonefrite proliferativa focal) se caracteriza pela presença de lesões segmentares ou globais em menos de 50% dos glomérulos em microscopia óptica, geralmente com evolução favorável, sem sequelas importantes. A nefrite de classe IV (glomerulonefrite proliferativa difusa), usualmente a mais observada em pacientes com LES, se caracteriza pela presença de lesões segmentares ou globais em mais de 50% dos glomérulos em microscopia óptica. A nefrite de classe V (glomerulonefrite membranosa) pode ocorrer em combinação com as classes II ou IV e se caracteriza pela presença de depósitos imunes subepiteliais (global ou segmentar) em microscópio óptico, eletrônico ou de imunofluorescência. A nefrite de classe VI (glomerulonefrite esclerosante avançada) se caracteriza pela presença de glomérulos esclerosados (≥90%) globalmente. As alterações histopatológicas observadas nos pacientes podem evoluir da forma aguda à crônica, geralmente da mais discreta para a mais grave.35,39
Manifestações cardiovasculares
O envolvimento cardiovascular é bastante frequente em pacientes com LES, sendo descrito em 50% a 89% dos pacientes no curso da doença.35
A manifestação clínica mais frequente é a pericardite, seguidas por miocardite e endocardite, com lesões coronarianas sendo mais raras.41,45 Embora os
mecanismos que resultam em manifestações cardiovasculares no LES não estejam totalmente esclarecidos, diversos fatores, incluindo ativação de monócitos, presença de anticorpos anti-fosfolipídes, desregulação do sistema
complemento, estresse oxidativo, hipertensão, diabetes, tabagismo, patologias renais, falha renal e a presença de diversos autoanticorpos, parecem estar envolvidos.1,28
Manifestações neuropsiquiátricas
O acometimento do sistema nervoso é uma das manifestações mais sérias do LES, podendo envolver os sistemas nervoso central, periférico e autônomo e síndromes psiquiátricas. A literatura registra uma grande variação (15% a 75%) dessas manifestações nas populações estudadas, provavelmente devido à ausência de métodos diagnósticos padronizados.35 As manifestações
neurológicas incluem desordens cognitivas, doenças cerebrovasculares, convulsões e cefaleia. Distúrbios psiquiátricos e cognitivos do SNC também são bastante frequentes. Sintomas psiquiátricos como ansiedade, depressão, psicose, alucinações e alterações no humor também são observados nos pacientes. As manifestações cognitivas incluem déficits de memória e atenção, dificuldade de aprendizado e raciocínio, estado confusional e demência.1,51
Manifestações gastrointestinais
O acometimento gastrointestinal ocorre em 25% a 40% dos pacientes com LES.35 Geralmente, envolve dor abdominal, que pode ser
causada por patologias gastrointestinais ou pelo efeito colateral das medicações ministradas. Na maioria das vezes, os sintomas são causados por vasculite mesentérica lúpica ou enterite lúpica e trombose.1,42 O envolvimento
do pâncreas ocorre em aproximadamente 8% dos pacientes e disfagia em 1,5% a 25%. A monilíase é frequente nos pacientes em uso de altas doses de corticoide e imunossupressores. Queixas de boca seca podem ser relatadas, devido a síndrome de Sjögren secundária ao LES.35
Manifestações oculares
Aproximadamente 30% dos pacientes com LES apresentam algum acometimento ocular que pode causar sequelas na visão. Manifestações no nervo óptico, periórbita e anexos oculares podem estar presentes. O sintoma mais comumente observado em pacientes lúpicos é a ceratoconjuntivite seca,
comum em pacientes com síndrome de Sjögren secundária ao LES. Nesses casos, a produção da secreção lacrimal é interrompida, causando ressecamento dos olhos.1,52 Outra manifestação bastante frequente é a
retinopatia, resultante da inflamação de pequenos vasos, obliterados por material amorfo, formando áreas de necrose e hialinização.35 Manifestações
neuro-oftalmológicas podem ocorrer em 3% a 30% dos pacientes com LES, sendo a neuropatia óptica, formada secundariamente à vasculite de pequenas arteríolas do nervo, um dos principais sintomas. O resultado desse processo é a perda progressiva e dolorosa da visão do paciente.53
Achados laboratoriais
No LES, vários testes laboratoriais podem estar alterados, indicando anemia (normocrômica, normocítica ou hemolítica com Coombs direto positivo), leucopenia, plaquetopenia, reticulocitose, proteinúria, hematúria e cilindrúria. A velocidade de hemossedimentação (VHS), muitas vezes elevada, tem sido utilizada para o acompanhamento da doença.35 As determinações das
concentrações dos componentes C3 e C4 do sistema complemento e da sua atividade funcional (CH50) são úteis para o diagnóstico e monitoramento da doença.18,54
O LES se caracteriza pela produção de autoanticorpos contra vários componentes da própria pessoa. Em 2015, Yaniv et al.,2 descreveram um total
de 180 autoanticorpos mais prevalentes no LES, alguns reconhecidamente importantes para o diagnóstico sorológico da doença. Atualmente, o diagnóstico sorológico do LES é baseado principalmente na pesquisa de ANAs, anti-DNAds e anticorpos direcionados contra o antígeno Smith (anti-Sm).5,17,18
A pesquisa de ANAs tem sido realizada por meio de IFI, utilizando como substrato células HEp2 (linhagem tumoral de células epiteliais humanas de carcinoma de laringe) fixadas em lâminas de imunofluorescência (padrão ouro).55 Nessa técnica, autoanticorpos presentes no soro se ligam a antígenos
do núcleo das células HEp2 e, após a adição de um conjugado fluorescente, que se liga ao complexo autoimune formado, a reação pode ser visualizada em microscópio de imunofluorescência com excitação ultravioleta, com títulos de IFI ≥1/160 sendo considerados significativos. Vale salientar que não existe
correlação entre o título detectado na IFI e a gravidade da doença.56–58 Além do título, o padrão de imunofluorescência nuclear também é considerado importante para o diagnóstico. Os padrões homogêneo, pontilhado fino e pontilhado grosso são mais comumente observados em pacientes com LES.58–
60 A IFI é capaz de detectar ANAs em aproximadamente 95% dos pacientes
com LES. Entretanto, esses anticorpos podem também ser detectados em outras doenças autoimunes, incluindo síndrome de Sjögren, esclerose sistêmica, polimiosite e dermatomiosite e mesmo em pessoas presumivelmente sadias.61 Ensaios imunoenzimáticos (ELISA) também podem ser utilizados para
a pesquisa de ANAs no soro de pacientes com suspeita de LES.58,62,63
Um teste ANA-IFI positivo pode ser complementado pela pesquisa de anticorpos anti-DNAds.64 Esses anticorpos são encontrados de forma
característica em pacientes com LES, sendo marcadores da doença segundo os critérios propostos pelo ACR (1997) e SLICC (2012).1,16,18,57 Alguns estudos
mostraram que anticorpos anti-DNAds de alta avidez estão mais associados com a atividade da doença, principalmente quando há acometimento renal.65
Existem diferentes técnicas para a pesquisa de anticorpos anti-DNAds, com sensibilidades e especificidades distintas. Atualmente, as principais técnicas utilizadas para a detecção de anticorpos anti-DNAds são a IFI utilizando o hemoflagelado Crithidia luciliae (C. luciliae) como substrato (CLIFT) e ELISA.
O teste de Farr (radioimunoensaio, RIA) já foi muito utilizado para a pesquisa de anticorpos anti-DNAds, porém hoje em dia têm caído em desuso, devido à necessidade do emprego de materiais radioativos.56,66–68 Nesse teste, o DNAds utilizado como antígeno é marcado com isótopo radioativo. Os anticorpos anti-DNAds presentes na amostra de soro ligam-se ao antígeno, os complexos DNA/anti-DNAds são separados do DNA não ligado por meio de precipitação com sulfato de amônio e os complexos imunes contendo DNA radiomarcado são quantificados em um contador gama. O teste de Farr é capaz de expressar resultados de forma quantitativa, possui alta sensibilidade e especificidade e detecta anticorpos de alta avidez.69,70
Na técnica CLIFT, o soro a ser testado é adicionado a delimitações de lâminas de imunofluorescência contendo os hemoflagelados (C. luciliae)
fixados; os anticorpos que se ligarem ao cinetoplasto da C. luciliae podem ser detectados, após interação com anticorpos anti-imunoglobulina humana (total ou anti-IgG, anti-IgM ou anti-IgA) marcados com fluoresceína, em microscópio de imunofluorescência.69,71,72 Nessa técnica, o soro testado é titulado e a última
diluição com resultado positivo é considerada o título da reação.73 Para o
diagnóstico da doença, a detecção de anticorpos IgG apresenta valor superior a detecção de anticorpos para outros isotipos. A maioria dos kits comerciais considera significativo títulos de anticorpos IgG ≥1:10.67,72 O teste CLIFT pode
detectar anticorpos IgG de alta e baixa avidez, ainda que a detecção de anticorpos IgG de alta avidez seja mais frequente. Nessa técnica, os anticorpos reconhecem material nucleico do cinetoplasto do hemoflagelado, composto basicamente de DNAds, tornando a reação altamente específica para o LES. Embora com alta especificidade, vários trabalhos têm mostrado que a técnica CLIFT apresenta menor sensibilidade do que as técnicas Farr e ELISA. Outras desvantagens da técnica CLIFT incluem, a expressão de resultados semiquantitativos e a dependência de um operador para a sua leitura, que pode levar a subjetividade de interpretação dos resultados. Também pode ocorrer variação entre resultados realizados com kits diferentes, devido as diferentes formas de preparação do substrato.56,74,75
Na técnica ELISA, o DNAds acoplado a um suporte plástico, usualmente o poliestireno, é reconhecido por anticorpos específicos presentes na amostra sendo analisada (o tratamento prévio do poliestireno com poli-L-lisina - PLL, sulfato de protamina ou soroalbumina bovina - SAB auxilia a fixação do material nucleico ao plástico). A presença de anticorpos é detectada pela adição de um conjugado, composto de anticorpos anti-imunoglobulina humana total, ou anti-IgG, anti-IgM ou anti-IgA, marcados com uma enzima. A adição de um substrato adequado para a enzima, resultará em diferentes graus de coloração, dependendo da concentração de anticorpos, que podem ser medidos colorimetricamente. A técnica ELISA pode detectar anticorpos de baixa e alta avidez e anticorpos de diversos isotipos. Para o diagnóstico da doença, a detecção de anticorpos IgG apresenta valor superior a detecção de anticorpos para outros isotipos.76–78 A principal desvantagem desse teste é a dificuldade de determinar qual valor de cut-off deve ser utilizado para a
interpretação dos resultados.68 Devido ao grande número de variações
metodológicas, a comparação entre resultados obtidos com diferentes técnicas é muito difícil.62 A técnica ELISA permite o processamento simultâneo de um
grande número de amostras, podendo gerar resultados quantitativos, dependendo da metodologia empregada, com sensibilidade relativamente alta.67,76
Os anticorpos anti-DNAds são altamente heterogêneos em relação à sua especificidade, classe, subclasse e avidez.65,79 Reações cruzadas entre
anticorpos anti-DNAds e anticorpos direcionados contra o DNA de fita simples (anti-DNAss) têm sido descritas.80 Anticorpos anti-DNAds têm sido detectados
em outras doenças incluindo, artrite reumatoide,81 síndrome de Sjögren,82
esclerose sistêmica,83 sarcoidose,84 doença indiferenciada do tecido conjuntivo
(DITC),85 doença mista do tecido conjuntivo (DMTC),86 poli/dermatomiosite,87
doenças hepáticas crônicas,88 hepatite crônica ativa,80 hepatite B,89,90 hepatite
C,91 hepatite autoimune,92 doença de Crohn,93 miastenia grave,94 tireoidite
autoimune, gastrite autoimune, anemia hemolítica autoimune,92 vasculite,95
cirrose biliar primária,88 síndrome antifosfolípide,96 e fenômeno de Raynaud.80
Anticorpos anti-DNAds também podem ser detectados com baixa frequência em pessoas sadias.97 Na maioria dos pacientes com LES são encontrados
anticorpos anti-DNAds, predominantemente da classe IgG, associados com a patogênese da doença, principalmente no acometimento renal, fazendo com que esses anticorpos tenham maior relevância clínica para o diagnóstico e acompanhamento da doença. Esses anticorpos têm sido detectados nos glomérulos de pacientes com nefrite e são considerados altamente específicos , quando comparados aos anticorpos anti-DNAds das classes IgM e IgA, encontrados em menor quantidade nos pacientes e aparentemente sem nenhuma associação com a atividade da doença.98,99
Nos últimos anos, as técnicas CLIFT e ELISA têm sido amplamente utilizadas para a pesquisa de anticorpos anti-DNAds no LES. A literatura registra uma grande variação no desempenho dessas técnicas. A técnica CLIFT tem apresentado sensibilidades e especificidades variando de 8,2% a 97% e 43,8% a 100%, respectivamente. A técnica ELISA tem apresentado
sensibilidades e especificidades variando de 14,7% a 98% e 29% a 100%, respectivamente.58,67,80,91,100–106
A detecção de anticorpos anti-Sm pode ser feita através das técnicas de contraimunoeletroforese (CIE), imunoblot e ELISA. A técnica ELISA tem sido comumente utilizada para a pesquisa de anticorpos anti-Sm, devido a sua facilidade de execução, sensibilidade e reprodutibilidade.107 A técnica ELISA
para a pesquisa de anticorpos anti-Sm têm apresentado sensibilidades e especificidades variando de 7% a 50% e 55% a 100%, respectivamente.108,109
O papel do anticorpo anti-Sm na patogênese da doença ainda não é completamente conhecido, porém sabe-se que este anticorpo é direcionado contra proteínas Sm, associadas à tradução de proteínas no organismo. Esses anticorpos também podem ser encontrados nos glomérulos de pacientes com LES, principalmente na nefrite lúpica.110
Além dos anticorpos anti-DNAds, anti-Sm e ANAs, outros anticorpos podem ser úteis para o diagnóstico da doença. Nos últimos anos, vem ganhando destaque a detecção de anticorpos contra nucleossomos. A técnica ELISA utilizada para a pesquisa desses anticorpos apresenta variações de sensibilidade e especificidade de 60,9% a 89,7% e 88,4% a 98,9%, respectivamente.111,112 Anticorpos anti-nucleossomo podem ser utilizados
como marcadores adicionais para o diagnóstico do LES, pois apresentam correlação com a atividade da doença, especialmente em pacientes com nefrite.35
Anticorpos antifosfolípides podem ser detectados em 12% a 34% dos pacientes lúpicos e em 1% a 5% de pessoas sadias. Esses anticorpos reconhecem fosfolípides no endotélio vascular, podendo causar manifestações clínicas variadas, incluindo tromboses arteriais e venosas, plaquetopenia, abortos de repetição, insuficiência adrenal, pré-eclâmpsia e valvulopatias.35,62
Entre os anticorpos antifosfolípides encontrados em pacientes com LES destacam-se os anticorpos anticoagulante lúpico (anti-LA) e anticardiolipina (aCL). Anticorpos anti-LA, direcionados contra proteínas ligadas a fosfolípides, principalmente a β2-glicoproteina e protrombina, podem ser encontrados em 15% a 34% dos pacientes; anticorpos aCL, direcionados contra fosfolípides
carregados negativamente, como a cardiolipina, podem ser encontrados em 12% a 30% dos pacientes.35,39,113
Outros anticorpos menos específicos para o LES, também são considerados relevantes para o diagnóstico da doença, ainda que não façam parte dos critérios ACR ou SLICC. Os anticorpos anti-Ro/SSA e anti-La/SSB são observados em cerca de 40% e 15% dos pacientes lúpicos, respectivamente. Estes anticorpos não são específicos para a doença, porém sua detecção pode ser útil em pacientes que não apresentam anticorpos anti-DNAds. Os anticorpos anti-Ro/SSA e anti-La/SSB estão relacionados ao acometimento cutâneo e lúpus neonatal e são detectados em pacientes com síndrome de Sjögren secundária ao LES. Ambos podem ser detectados por vários ensaios imunológicos, incluindo imunodifusão dupla e ELISA. Anticorpos anti-RNP são encontrados comumente em pacientes lúpicos, em associação com anti-Sm, e podem ser detectados através de ELISA em aproximadamente 40% dos casos.39,69
Os anticorpos anti-proteína P ribossomal, associados a manifestações neuropsiquiátricas, embora apresentem alta especificidade para o LES, são detectados em somente 10% a 20% dos pacientes. Anticorpos contra o antígeno de proliferação celular (PCNA), embora contribuam para o diagnóstico do LES, raramente são encontrados.35
Além dos diferentes anticorpos encontrados na doença, os níveis de complemento sérico total (CH50) e dos seus componentes C3 e C4 também são pesquisados em pacientes com LES, podendo apresentar níveis abaixo dos valores de referência na fase de atividade da doença.18,35,54
Diagnóstico
O diagnóstico do LES tem sido baseado em consensos nacionais e internacionais. O último consenso brasileiro sobre o tema (Consenso de Lúpus Eritematoso Sistêmico, 2008), determinou que o diagnóstico do LES deve ser baseado nos critérios clínicos e imunológicos propostos pelo ACR em 1982 e revisados em 1997.5,16,17 O diagnóstico de LES é firmado caso o paciente
O consenso internacional sobre o LES mais recente foi proposto pelo SLICC em 2012, incluindo novos critérios clínicos e laboratoriais.18,114 De
acordo com esse consenso, o diagnóstico do LES é confirmado caso o paciente apresente quatro ou mais dos critérios propostos, possuindo pelo menos um critério clínico e um critério imunológico.18,19 Os critérios clínicos e imunológicos
propostos pelo ACR (1997) e SLICC (2012) são mostrados nos Quadros I e II, respectivamente.
Quadro I. Critérios clínicos adotados pelo ACR (1997) e SLICC (2012) para o diagnóstico do LES.
MANIFESTAÇÃO ACR (1997) SLICC (2012)
Musculoesquelética
*Artrite não erosiva com dor e edema ou derrame articular em pelo menos duas articulações periféricas
*Sinovite com inchaço, derrame ou sensibilidade em pelo menos duas articulações
*Rigidez matinal (tempo > 30 min.)
Hematológica
*Anemia hemolítica com reticulocitose OU
leucopenia (<4.000/mm3
em pelo menos duas ocasiões)
*Linfopenia (<1.500/mm3)
*Trombocitopenia
(<100.000/mm3 em pelo
menos duas ocasiões)
*Anemia hemolítica
*Leucopenia (<4.000/mm3 em
pelo menos 1 ocasião) OU linfopenia
(<1.000/mm3 em pelo menos uma
ocasião)
*Trombocitopenia
(<100.000/mm3 em pelo menos
uma ocasião)
Pulmonar
*Pleurite (dor pleurítica, atrito auscultado pelo médico OU evidência de derrame pleural)
*Pleurite (tempo > 24h) OU derrame pleural OU esfregaço pleural
Quadro I (cont.). Critérios clínicos adotados pelo ACR (1997) e SLICC (2012) para o diagnóstico do LES.
MANIFESTAÇÃO ACR (1997) SLICC (2012)
Cutânea
*Eritema malar *Lesão discoide *Fotossensibilidade *Úlceras orais/nasais
*LCEA (eritema malar, lúpus bolhoso, necrólise epidérmica tóxica, erupção cutânea maculopapular e
fotossensibilidade) na ausência de dermatomiosite OU LCES (lesões psoriasiforme e/ou policíclicas anulares sem cicatrização com ocasional despigmentação pós-inflamatória ou telangiectasia)
*LCEC (lesões discoidais
clássicas ou generalizadas, lúpus hipertrófico, paniculite lúpica, lúpus da mucosa, LE tumidus, lúpus chilblains, lúpus
discoide/sobreposição de líquen plano
*Úlceras orais/nasais *Alopecia de tração
Renal *Proteinúria persistente
(>0,5 g/24h) * Relação proteína/creatinina na urina > 1,0 Cardíaca *Pericardite documentada por eletrocardiograma OU evidência de derrame pericárdico
*Pericardite com dor (> 24h) OU derrame pericárdico OU
esfregaço pericárdico OU pericardite documentada por eletrocardiograma
Neurológica *Convulsão ou psicose
*Convulsão *Psicose
*Estado confusional agudo *Mononeurite múltipla
*Neuropatia periférica ou craniana LCEA: lúpus cutâneo eritematoso agudo, LCES: lúpus eritematoso cutâneo subagudo, LCEC: lúpus cutâneo eritematoso crônico, LE: lúpus eritematoso, lúpus chilblains: forma rara de lúpus eritematoso cutâneo. Fonte: Tan et al., 1982; Hochberg, 1997; Petri et al., 2012.
Quadro II. Critérios imunológicos adotados pelo ACR (1997) e SLICC (2012) para o diagnóstico do LES.
MANIFESTAÇÃO ACR (1997) SLICC (2012)
Imunológica
*Títulos anormais de ANAs por imunofluorescência ou ensaio equivalente (na ausência de lúpus induzido por drogas)
*Presença de anticorpo anti-DNAds, anti-Sm ou
antifosfolípides determinada através de:
▪ Teste positivopara anticoagulante lúpico ▪ Teste RPR falso-positivo (tempo ≥ 6 meses) ▪ Nível médio/alto de anticorpos anticardiolipina (IgG ou IgM)
*Concentração de ANAs acima do nível de referência
*Concentração de anti-DNAds acima do nível de referência (ou o dobro da referência, se testado por ELISA)
*Presença de anticorpos anti-Sm *Presença de anticorpos
antifosfolípides, determinada através de:
▪ Teste positivopara anticoagulante lúpico
▪ Teste RPR falso-positivo
▪ Nível médio/alto de anticorpos anticardiolipina (IgA, IgG ou IgM)
▪ Teste positivo para anti- β2-glicoproteina I (IgA, IgG ou IgM)
*Baixa concentração de
complemento (C3, C4 ou CH50) *Teste Coombs direto positivo (na ausência de anemia hemolítica)
Fonte: Tan et al., 1982; Hochberg, 1997; Petri et al., 2012.
A atividade da doença é avaliada levando em consideração aspectos clínicos, testes funcionais e achados laboratoriais, sendo monitorada por Índices de Atividade da Doença, como o SLE Disease Activity Index (SLEDAI) e European Consensus Lupus Activity Measurement (ECLAM).115
Tratamento
O ACR e a força-tarefa European League Against Rheumatism (EULAR) desenvolveram diretrizes para o tratamento medicamentoso do LES.116 A escolha da medicação é particular para cada paciente, determinada
após a verificação da severidade da doença, avaliando a função dos órgãos/sistemas acometidos e sintomas observados. Os medicamentos utilizados protegem os órgãos da agressão inflamatória provocada pela
autoimunidade e induzem a remissão da doença, porém não impedem nem revertem a condição causadora da desregulação do sistema imune. De um modo geral, medicamentos antimaláricos, corticosteroides, anti-inflamatórios e imunossupressores são utilizados no tratamento do LES.35,46
Considerações sobre as técnicas ELISA utilizadas para a pesquisa de anticorpos anti-DNAds
Atualmente, a grande maioria das técnicas ELISA utilizadas para a pesquisa de anticorpos anti-DNAds, utilizando como matriz o poliestireno, são qualitativas ou, no máximo, semiquantitativas. Uma reação quantitativa para a pesquisa de anticorpos específicos requer que todos os reagentes utilizados, exceto aquele sendo testado, estejam presentes em excesso. Na padronização da reação, é essencial que a atividade enzimática seja medida durante a porção linear da reação, quando a concentração do substrato é muito maior do que a concentração da enzima. A padronização da técnica envolve também a utilização de padrões com concentrações conhecidas de anticorpos, que devem ser utilizados em todos os ensaios, sendo as reatividades das amostras testadas determinadas em relação às concentrações de anticorpos específicos presentes nos padrões incluídos no teste.117–119
OBJETIVO
O presente trabalho teve como objetivo desenvolver uma técnica ELISA quantitativa para a pesquisa de anticorpos IgG anti-DNAds, que também pudesse ser utilizada para a determinação da avidez desses anticorpos.
MATERIAL E MÉTODOS Reagentes
Todos os sais, bases e ácidos utilizados no preparo de soluções pertenciam às marcas Merck (Darmstadt, Alemanha) ou Sigma-Aldrich (Saint Louis, EUA). Os reagentes Tween 20 (P1379), SAB (A3059), PLL (P6282), DNAds de timo de vitelo (D4522), S1 nuclease de Aspergillus oryzae (N5661),
anticorpo anti-IgG humana conjugada com peroxidase (A8667), tetrametilbenzidina (TMB) (T3405) e peróxido de hidrogênio (H2O2) (H1009),
utilizados na reação ELISA, pertenciam a marca Sigma-Aldrich.
Casuística
No presente estudo, foi utilizada uma bateria de 220 amostras de soros com a seguinte composição: pacientes com LES, n=127 (122 mulheres, 5 homens, idade média=34 anos); pacientes com outras doenças, n=56 (36 mulheres, 20 homens, idade média=48 anos) (artrite reumatoide, n=26; síndrome de Sjögren, n=3; esclerose sistêmica, n=3; mieloma múltiplo, n=9; hepatite B, n=6; hepatite A, n=4; citomegalovirose - CMV, n=3 e mononucleose infecciosa, n=2), e pessoas sadias, n=37 (23 mulheres, 14 homens, idade média=41 anos). Todas as amostras de soros foram obtidas da rotina do Laboratório de Imunologia da Divisão de Patologia Clínica de pacientes atendidos no Hospital de Clínicas da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp). Todos os soros de pessoas sadias foram obtidos de funcionários e alunos da Unicamp, sem histórico de LES.
Vinte e um (16,5%) dos 127 pacientes com LES apresentavam pesquisa de anticorpos anti-Sm positiva (a pesquisa foi realizada com kits ELISA da marca Orgentec, Mainz, Alemanha). Todos os pacientes com artrite reumatoide apresentaram pesquisa positiva de fator reumatoide (FR) e anticorpos IgG anti-CCP3 (a pesquisa de FR foi realizada por nefelometria, utilizando o Sistema BN Prospec II, Siemens, Marburg, Alemanha; a pesquisa de anticorpos IgG anti-CCP3 foi realizada utilizando kits Quanta-Lite CCP3 IgG ELISA, Inova Diagnostics Inc, San Diego, California, EUA). Os três pacientes com síndrome de Sjögren apresentavam pesquisa de anti-SSA (Ro) positiva e os três pacientes com esclerose sistêmica apresentavam pesquisa de
anticorpos anti-Scl70 positiva (a pesquisa desses anticorpos foi realizada utilizando kits ELISA ENA Screen - Orgentec Diagnostika, Mainz, Alemanha). Dos nove pacientes com mieloma múltiplo, quatro pacientes apresentavam mieloma de IgG (valores de IgG >4.000 mg/dL) e cinco pacientes apresentavam mieloma de IgA (valores de IgA >1.800 mg/dL), sendo a pesquisa dessas imunoglobulinas realizada por nefelometria (utilizando o Sistema BN Prospec II). Os quatro pacientes com hepatite A apresentavam pesquisa de anticorpos IgM e IgG reagente para o vírus; os seis pacientes com hepatite B apresentavam pesquisa de HbsAg reagente; somente um desses pacientes tinha pesquisa HbeAg positiva (a pesquisa de anticorpos para as hepatites A e B foi realizada com o sistema Architect, Abbott Ireland, Sligo, Irlanda). Os três pacientes com CMV apresentavam pesquisa de IgM e IgG positivas, utilizando o sistema VIDAS (BioMérieux, Marcy l’eEtoile, França). Os dois pacientes com mononucleose apresentavam pesquisa de IgM e IgG anti-VCA positivas, com pesquisa de EBNA negativa (a pesquisa de anticorpos IgM e IgG foi realizada com o sistema VIDAS, enquanto a pesquisa de anticorpos anti-EBNA foi realizada com o sistema Architect).
CLIFT
A técnica CLIFT foi realizada com os kits Scimedx, (Scimedx, New Jersey, EUA) ou Immuno Concepts N.A Ltda (Sacramento, California, EUA), seguindo as instruções dos fabricantes. Títulos de CLIFT ≥1/10 foram considerados significativos. Resumidamente, 10 µl dos soros sendo testados diluídos a 1:10 em tampão apropriado e dos controles positivo e negativo dos kits foram adicionados às delimitações de lâminas contendo C. luciliae. As lâminas foram incubadas em câmara úmida, por 30 min., em temperatura ambiente (TA). Após a incubação com os soros e controles, as lâminas foram submetidas a duas lavagens de cinco min. cada com tampão apropriado. Após a secagem das lâminas, a cada delimitação das mesmas foram adicionados 10 µl do conjugado (anticorpos anti-IgG humana marcados com fluoresceína). As lâminas foram novamente incubadas em câmara úmida, por 30 min., em TA. Em seguida, as lâminas foram novamente submetidas a duas lavagens com o tampão apropriado. Após a lavagem, foram adicionadas a cada lâmina quatro
ou cinco gotas de glicerina tamponada e, sem exercer muita pressão, uma lamínula foi colocada sobre cada lâmina. As reações foram visualizadas em microscópio de imunofluorescência, com um aumento de 40x (Olympus BX-40, Olympus Corporation, Tóquio, Japão).
Padrões positivo e negativo para anticorpos anti-DNAds
Um pool positivo para anticorpos anti-DNAds foi preparado misturando soros de dez pacientes com LES que apresentavam pesquisa de anticorpos anti-DNAds positiva por CLIFT e ELISA em ensaios prévios. O pool negativo para anticorpos anti-DNAds, foi preparado misturando soros de dez pessoas sadias que apresentavam pesquisa de anticorpos anti-DNAds negativa por CLIFT e ELISA em ensaios prévios. Após centrifugação dos pools positivo e negativo a 7.200 x g, por uma hora, a 4ºC (centrífuga Sigma, 2k15), os sobrenadantes foram retirados com auxílio de seringa e agulha, aliquotados e estocados a - 20ºC até o momento do uso. Ao pool positivo foi designado um valor de 100 unidades arbitrárias (UA) de anticorpos IgG anti-DNAds/mL. Esse pool foi diluído com solução salina tamponada com fosfatos (SST) 0,15M pH=7,4 contendo 0,05% de Tween 20 (T) e 0,05% de SAB (SST-T-SAB), para a confecção de padrões contendo diferentes concentrações de anticorpos IgG anti-DNAds (100 UA/mL, 50 UA/mL, 25 UA/mL, 12,5 UA/mL, 6,25 UA/mL, 3,12 UA/mL e 1,56 UA/mL).
Determinação das concentrações ótimas dos reagentes
A técnica ELISA foi padronizada usando quantidades em excesso de todos os reagentes, exceto aquele sendo testado. Para a titulação do antígeno, foram testadas concentrações de DNA variando de 0,3 a 100 μg/mL. Para a titulação do conjugado (anticorpos anti-IgG humana marcados com peroxidase) foram testadas diluições variando de 1:500 a 1:64.000.
Linearidade da conversão do substrato
A linearidade da conversão do substrato foi determinada utilizando um padrão sérico contendo 50 UA/mL. A taxa de conversão do substrato foi
analisada a diferentes intervalos de tempo de incubação (1 min. a 30 min.), em TA, no escuro.
ELISA
Cavidades de placas de poliestireno (Nunc MaxiSorp®, Thermo
Fisher Scientific, EUA) foram tratadas com 100 μl de uma solução de PLL diluída a 20 μg/mL em tampão carbonato-bicarbonato 0,1M, pH=9,5 durante duas horas em TA e overnight a 4ºC. Após três lavagens com SST (200 μl em cada cavidade), foram adicionados às cavidades das placas 100 μl de uma solução de DNAds de timo de vitelo diluído a 20 μg/mL em tampão Tris-NaCl-HCl, 0,15M, pH=8,0. Após incubação das placas por 3h30min em TA, as cavidades das placas foram lavadas uma vez com SST contendo 0,05% de Tween 20 (SST-T) e às mesmas foram adicionados 100 μl de uma solução SAB a 0,1% em SST-T. As placas foram incubadas por 10 min. em TA e suas cavidades lavadas uma vez com SST-T. Em seguida, foram adicionados às cavidades das placas 100 μl de uma solução de S1 nuclease de Aspergillus oryzae contendo 40 U/mL, diluída em tampão acetato de sódio-ácido acético glacial 50 mM, pH=4,6, contendo 5 mg/mL de SAB, e as placas foram incubadas por 1h30min em TA. Após três lavagens com SST-T, foram adicionadas às cavidades das placas 100 μl dos padrões e das amostras de soros diluídas a 1:200 em SST-T-SAB. Após incubação por uma hora em TA e três lavagens com SST-T, foram adicionados às cavidades das placas 100 μl do conjugado diluído a 1:4.000 em SST-T. Após 45 min. de incubação em TA e três lavagens com SST-T, foram adicionadas às cavidades das placas 100 μl do sistema substrato (0,42 mM de TMB e 1,42 mM de H2O2) em tampão acetato
de sódio/ácido acético glacial, 0,1M, pH=5,5. Após incubação no escuro, em TA, por dez min., as reações foram bloqueadas pela adição de 50 μl de uma solução de ácido sulfúrico (H2SO4) a 2N em cada cavidade da placa. Em cada
placa de reação, foram incluídos padrões positivos, contendo 100 UA/mL, 50 UA/mL, 25 UA/mL, 12,5 UA/mL, 6,25 UA/mL, 3,12 UA/mL e 1,56 UA/mL e o padrão negativo. A leitura das absorbâncias das reações foi realizada a 450 nm em leitora de ELISA Multiskan (Labsystems, Helsinki, Finlândia). As amostras de soros e os padrões foram testados em triplicata e a absorbância média foi
determinada. A curva obtida com os padrões positivos foi utilizada para transformar as absorbâncias médias das amostras de soros dos pacientes em UA/mL. O cut-off da técnica ELISA foi determinado utilizando uma curva ROC (Receiver Operating Characteristic).
Determinação da variação inter-ensaio
A variação inter-ensaio foi determinada usando um padrão sérico contendo 50 UA/mL em 14 dias alternados. O padrão foi testado sempre em triplicata e a absorbância média utilizada para o cálculo do coeficiente de variação.
Análise dos dados
O teste Q de Cochran foi usado para comparar as sensibilidades e especificidades das reações.120 Diferenças entre os resultados foram
consideradas significantes quando p ≤ 0,05. Os testes estatísticos utilizados para a determinação da sensibilidade e especificidade da técnica ELISA foram realizados utilizando o programa computacional SAS System for Windows (Statistical Analysis System), versão 9.4 (SAS Institute Inc, 2002-2008, Carly, NC, EUA).
Determinação da avidez dos anticorpos IgG anti-DNAds
A determinação da avidez dos anticorpos IgG anti-DNAds foi realizada em 15 amostras de soros de pacientes com LES, escolhidas ao acaso. Para a determinação da avidez, na técnica ELISA padronizada, foi incluída uma incubação com 200 μL de ureia 6M em SST ou apenas SST (controle), por 15 min, em TA, após a incubação com as amostras de soros, seguida de três lavagens com SST, antes da incubação com o conjugado. A leitura das absorbâncias das reações foi realizada a 450 nm em leitora de ELISA Multiskan (Labsystems, Helsinki, Finlândia). As amostras de soros foram testadas em triplicata e a absorbância média determinada. Os índices de avidez da IgG (IAvIgG) foram determinados utilizando a fórmula descrita a seguir:
IAvIgG = 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏â𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑜𝑏𝑡𝑖𝑑𝑎 𝑐𝑜𝑚 𝑜𝑠 𝑠𝑜𝑟𝑜𝑠 𝑡𝑟𝑎𝑡𝑎𝑑𝑜𝑠 𝑐𝑜𝑚 𝑢𝑟𝑒𝑖𝑎 𝑒𝑚 𝑆𝑆𝑇
ASPECTOS ÉTICOS
Esse estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Faculdade de Ciências Médicas da Unicamp, de acordo com as resoluções do Comitê Brasileiro de Ética em Pesquisa (parecer no 1.135.867 de 02/07/2015).
RESULTADOS
Experimentos de titulação do DNAds mostraram que a menor concentração da preparação antigênica que produziu reatividade máxima foi alcançada com 10 μg/mL. Todas as reações ELISA foram realizadas utilizando DNAds a uma concentração de 20 μg/ml. Experimentos de titulação do conjugado definiram que a menor concentração desse reagente que produziu reatividade máxima foi alcançada com a diluição 1:8.000. Todas as reações ELISA foram realizadas com conjugado diluído a 1:4.000. Estudos de linearidade mostraram que as taxas de conversão do substrato foram lineares por pelo menos 12 min. Todas as reações ELISA foram bloqueadas 10 min. após a adição do sistema substrato e lidas em seguida.
A Figura 1 mostra a curva ROC produzida com os resultados obtidos com a bateria de soros de pacientes com LES, pacientes com outras doenças e pessoas sadias.
Figura 1. Curva ROC para avaliação do
desempenho da técnica ELISA.
Utilizando o cut-off determinado pela curva (7,65), a técnica ELISA foi positiva em 118 (92,91%) das 127 amostras de soros de pacientes com LES e em cinco (8,92%) das 56 amostras de soros de pacientes com outras doenças (dois com artrite reumatoide, um com hepatite B, um com esclerose sistêmica e um com mononucleose infecciosa). A técnica ELISA não foi positiva em nenhuma das 37 amostras de soros do grupo de pessoas sadias.
