como variáveis independentes e os parâmetros seminais como variáveis dependentes (Figura 4). As variações no percentual de espermatozoides com defeitos na peça intermediaria apresentaram relação com a quantidade de “CH4 and secreted domains of swine IgM”, fibronectin 1, IgG-binding protein, lactadherin e complement factor H precursor no plasma seminal, de acordo com modelos de regressão e valores de R² de 0,41 a 0,61 (p < 0,05 ). A percentagem de espermatozoides com defeitos de cauda esteve associada com as primeiras quatro proteínas acima descritas (R² = 0,34 a 0,74; p < 0,05). A motilidade espermática, por sua vez, apresentou uma associação significativa com a intensidade dos spots identificados como lactadherin (R² = 0,48, p < 0,05). As avaliações realizadas pela plataforma do “Metacore” indicam que as proteínas identificadas como fibronectin, lactadherin e IgG-binding protein associam-se a uma diversa gama de proteínas, vias de sinalização intracelular e fatores de transcrição, conforme mostrado na Figuras 5.
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Figura 4. Modelos de regressão associados a variações dos parâmetros espermáticos dos suínos em função das proteínas do plasma seminal. As variáveis dependentes (y) definem- se como percentagens de espermatozoides móveis e espermatozoides com defeitos na peça intermediária e na cauda. As variáveis independentes (x) referem-se à soma das intensidades dos spots identificados como cada uma das proteínas. Especificamente: Ch4 and secret domain of swine IgM/fibronectin 1 (FN1): soma da intensidade dos spots 22, 23 e 87 (A e B); IgG-binding protein: spots 55, 56, 57, 58, 59, 60 e 73 (C e D); Complement factor H: spots 88, 89, 90, 123, 124, 125, 126 e 127 (E); lactadherin: spots 42 e 43 (F, G e H). Os números dos spots referem-se aos mostrados na Figura 1, Tabela 1 e Tabela Suppl. 1.
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Figuras 5. Interactoma e redes de sinalizações associadas à proteinas do plasma seminal com relações empíricas com parâmetros espermáticos dos suínos. As análises foram realizadas pelo software MetaCore, v. 6.8 (http://portal.genego.com; GeneGo, St. Joneph, MI, USA). Legendas e símbolos mostrados no presente diagramasão descritos na Figura Suplementar 1.
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5DISCUSSÃO
Como é bem conhecido, o plasma seminal suíno é uma mistura complexa de fluídos que vêm dos testículos, epidídimo e glândulas sexuais acessórias, ricos em elementos orgânicos e inorgânicos. Proteínas do plasma seminal são moléculas de alto peso molecular que exercem várias funções relacionadas com o desenvolvimento, maturação e transporte de espermatozoides, a sobrevivência destes no trato reprodutivo feminino, capacitação e reação acrossômica, reconhecimento entre o espermatozóide e o ovócito e proteção contra microorganismos e danos oxidativos (Strzeżek et al, 2005; Jonáková et al, 2007; Caballero et al, 2008; Novak et al, 2010). No presente estudo, foram identificadas 39 proteínas diferentes que, em conjunto, representam 45,6 % da intensidade de todos os spots detectados nos géis 2-D do plasma seminal de cachaços adultos e reprodutivamente normais. Deste grupo de proteínas, as mais abundantes pertencem à família das espermadhesinas, glicoproteínas que são expressas em várias espécies de mamíferos, tais como touros {Citation}(Tedeschi et al, 2000; Moura et al, 2007), carneiros (Bergeron et al, 2005; Souza et al, 2012), cabras (Teixeira et al, 2006), peccary (Santos et al, 2014) e coelhos (resultados não publicados). Em todas estas espécies, as espermadesinas são componentes normalmente de baixa abundância, em contraste com o achado neste trabalho para os suínos domésticos, onde esta classe de proteínas representa, quantitativamente, 45,2 % de todos os spots proteicos detectados nos geis 2-D construídos com tiras de 24 cm e corados com azul de coomassie coloidal. Outros estudos mostraram que há uma grande contribuição das espermadesinas para a composição do plasma seminal dos suínos e, dependendo do método utilizado (cromatografia de afinidade, Western blot), estas proteínas de fato compõem de 75 a 90 % de todas as proteínas expressas no sêmen dos varrões (Dostàlovà et al, 1994; Calvete et al, 1995; Caballero et al, 2008).
Cinco membros da família das espermadesinas foram identificadas no presente estudo: PSP-I, PSP-II, AQN-1, AQN-3 e AWN-1. PSP-I e PSP-II representam as mais abundantes do flúido seminal e estas isoformas compõem um heterodímero, ligando-se ao acrossoma do espermatozoide (Calvete et al, 1995). Quando as células espermáticas são expostas in vitro ao complexo PSP-I/PSP-II, a integridade da membrana plasmática, motilidade e a atividade mitocondrial são preservadas (Caballero et al, 2009).
80 Heterodímeros das PSPs também modulam a invasão de leucócitos uma vez que o esperma é depositado no trato reprodutor feminino (Assreuy et al, 2002, 2003; Rodriguez-Martinez et al, 2005; Caballero et al, 2008). De fato, a análise conduzida na plataforma do STRING indica que o complexo PSP-I/PSP-II interage com MS4A8B, um membro da família de proteínas de membrana trans homóloga para o CD20 expresso em linfócitos B e T (Liang e Tedder, 2001; Xu et al, 2010). Tal interação pode mediar assim a proteção dos espermatozoides contra o sistema imune do trato reprodutor feminino. Proteínas MS4A inibem a propagação de linfócitos T por modulação do ciclo celular e a tradução de sinais das células B. No entanto, não está claro como as PSP-I/PSP-II interagem precisamente com MS4A8B para modular ação dos leucócitos.
As proteinas PSP-I/PSP-II também contribuem para a formação do reservatório espermático no oviduto, devido à interação com as glicoproteínas do epitélio do oviduto (Töpfer-Petersen, 1999) e estudos mostram que subpopulações de espermatozoides com maior quantidade de PSPs ligadas no acrossoma apresentam maior viabilidade, motilidade e melhor atividade mitocondrial (Caballero et al, 2006). A presença de PSPs pode contribuir também para a estabilização da membrana plasmática, evitando a capacitação espermática precoce o que, por sua vez, é responsável pela deterioração da membrana, a exocitose acrossomal e a morte celular (Kamaruddin et al. 2004; Barrios et al. 2005; Ignacio Caballero et al. 2006). Um estudo recente relatou a presença de AQN, AWN e PSPs nos exossomas do plasma seminal suíno (Piehl et al, 2013) e estes autores também relataram que a incubação do sêmen com essas vesículas reduz o fluxo de colesterol e aumenta a estabilidade da membrana. Espermadesinas também estão em prostasomas dos espermatozoides dos suínos participando potencialmente na remodelação acrossomal durante a capacitação espermática (Miles et al, 2013).
Espermadesinas AWN-1 e AQN-3, por sua vez, apresentam propriedades de ligação a fosfolipídios específicos, o que sugere que estas proteínas podem se aderir à membrana espermática durante a ejaculação, promovendo a estabilização do acrossoma (Dostálová et al, 1995). Tais componentes também participam da capacitação espermática e da interação espermatozoide-zona pelúcida nos Sus scrofa (Jonáková et al, 2000). Por outro lado, semelhante ao que ocorre com o complexo PSP-I/PSP-II, a AQN-1 interage com o epitélio do oviduto e contribui com o estabelecimento do reservatório espermático (Ekhlasi-
81 Hundrieser et al, 2005; Liberda et al, 2006). Ambas as proteínas AQN e AWN interagem com a proteína do plasma seminal pB1 (DQH) e ADAM3b, tal como indicado pela análise do STRING. DQH forma um complexo de espermadesinas, que apresenta atividade de ligação com fosforilcolina (Jonáková et al., 2007). ADAM3b, por sua vez, é um membro da A-desintegrin e da metaloproteinase (ADAM) normalmente expressa em células germinativas masculinas e que tem a capacidade de se ligar á zona pelúcida (Kim et al., 2009). Além disso, a AQN interage com a zonadhesin, outra molécula que se liga de forma específica à zonapelúcida (Tardif e Cormier, 2011).
A albumina está presente no plasma seminal dos suínos como uma série de isoformas de elevado peso molecular (76,1-78 kDa). A albumina é um componente comum do plasma seminal e desempenha um papel na proteção dos espermatozoides contra o estresse oxidativo causado por peroxidação lipídica. A albumina também parece agir em conjunto com a superóxido dismutase e a glutationa-peroxidase, esta última identificada no presente estudo na forma de “epidydimal secretory protein”, as quais interagem com as espécies reativas de oxigênio (ROS) derivadas do metabolismo celular (Murase et al, 2007). Análises realizadas sobre a interação das proteínas (dados não mostrados) indicam que a epididymal secretory glutathione peroxidase interage com a transferrina, a qual atua juntamente com a lactotransferrin, uma proteína de ligação ao ferro secretada pelas células de Sertoli, epitélio do epidídimo e glândulas sexuais acessórias (Wakabayashi et al, 1999). Ambas, transferrina e lactotransferrina, também identificadas em nosso estudo, são carreadoras de ferro que impedem a peroxidação lipídica espermática. Como o ferro é um íon importante para microorganismos patogênicos, a transferrina e a lactotransferrina também podem ser definidas como proteínas antimicrobianas (Farnaud e Evans, 2003).
As imunoglobulinas (Ig) foram previamente associadas a homens com subfertilidade auto-imune (Lukas e Keller, 1998). Estas proteínas ligam-se aos antígenos presentes na superfície do espermatozoide promovendo a aglutinação e imobilização, o que leva a uma reduzida capacidade de penetração do espermatozoide no muco cervical e falha na reação acrossômica e interação dos gametas (Liu et al., 1991; Bandoh et al., 1992). As imunoglobulinas (IgG, IgA, IgG e IgM) foram previamente detectadas no plasma seminal dos suínos adultos (Kaiser et al, 2000) e, no presente trabalho, IgG e IgM foram também identificadas nos geis 2-D do plasma seminal dos cachaços, a última na forma de CH4 and
82 secreted domains of swine IgM. A soma das intensidades dos spots que contêm IgM e uma outra proteína, a fibronectina 1 (spots # 22, 25 e 87; Figura 1, Tabela 1), apresentaram associação inversa com as variações de defeitos de peça intermediária e de cauda dos espermatozoides. Os modelos de regressão linear revelaram que, para cada aumento de ppm na soma da intensidades dos spots de IgM / fibronectina, a percentagem de tais defeitos diminuíram 0,0025 % e 0,0083 %, respectivamente (Figura 4A e 4B). A análise das interações das proteínas mostra que FN1 interage com várias integrinas e CD44, as quais são proteínas presentes na superfície do espermatozoide e com potencial de ligação com a osteopontina (OPN), uma importante proteína seminal associada à fertilidade de touros (Killian et al, 1993; Cancelar et al, 1997; Moura et al, 2006a). FN1 também interage com a albumina que, como mencionado anteriormente, está associado com a proteção dos espermatozoides contra o estresse oxidativo e peroxidação lipídica. Sugere-se, com base em tais informações, que FN é capaz de se ligar ao espermatozoide via integrinas da membrana e, atraves da interação com albumina, pode participar das reduções do intenso estresse oxidativo que ocorre na peça intermediária e cauda dos espermatozoides, principais segmentos de metabolismo energético para a função do espermatozoide e os principais geradores de ROS. A multifuncionalidade da FN também é explificada com a análise realizada com a ferramenta do Metadore, a qual indica interações diretas ou indiretas deste componente com metaloproteinases, receptores de fatores de crescimento e integrinas, o que sugere a participação do mesmo em processos celulares complexos durante a formação dos gametas masculinos.
A proteína de ligação de IgG no plasma seminal dos suínos apresentou relação inversa com os defeitos de peça intermediária e de cauda. Para cada aumento no ppm na soma da intensidades dos spots de IgG de ligação (# 55, 60 e 73, Figura 1, Tabela 1), os defeitos da peça intermediária e de cauda diminuem 0,00049 % e 0,0017 %, respectivamente, segundo os modelos de regressão (Figura 4C e 4D ). Proteínas de ligação à IgG do plasma seminal humano são capazes de reduzir as interações entre os anticorpos anti-espermáticos e células fagocíticas (Chiu e Chamley, 2003) e é possível, portanto, que tais proteínas reduzam os efeitos prejudiciais das Igs sobre a função e estrutura dos espermatozoides. Além disso, com base nas análises de interações, a proteína de ligação IgG interage com a tubulin gamma complex associated protein (TUBGCP2), a qual está
83 associada a reduzida motilidade espermática em homens (Chan et al, 2009). Dados obtidos da plataforma do software Metacore confirmam a capacidade da proteína de ligação de IgG de também modular sistemas de sinalização intracelular e transcrição gênica. Em geral, os atributos apresentados das proteínas de ligação à IgG poderiam explicar as associações empíricas entre este componente seminal e o número de espermatozoides com defeitos de peça intermediária e de cauda encontrados nos ejaculados dos suíno. No entanto, para o caso de IgM, os potenciais mecanismos pelos quais estas proteínas modulam específicos aspectos da morfologia espermáticas precisam ser melhor investigados.
A percentagem de células com defeito de peça intermediária apresentou uma relação quadrática com a intensidade dos spots identificados como complemento Fator H. Este padrão quadrático sugere que um aumento desta proteína reduz inicialmente a porcentagem de células anormais, mas que a expressão contínua deste componente pode ser deletéria, provocando um aumento do número de espermatozoides com defeito na peça intermediária (Figura 4E). As funções do complemento Fator H referem-se à manutenção da homeostase e a proteção de células hospedeiras e de tecidos contra danos causados pela ativação dos complementos (Rodriguez de cordoba et al, 2004). Estes autores confirmaram a presença do complemento fator H no plasma seminal e nos fluídos dos ovários e observou-se que a atividade deste fator foi de 6 a 10 vezes mais elevado no trato reprodutivo feminino. O fator H do plasma seminal dos suínos é secretado principalmente pelas células epiteliais das vesículas seminais, mas este componente também foi detectado na superfície dos acrossomas (Sakaue et al, 2010). Estes autores relataram que o fator H, tanto do plasma seminal e o do acrossoma, exibem a mesma atividade regulatória, protegendo as células espermáticas de danos dos complementosdo trato genital masculino e feminino. De fato, como evidenciado na busca na base de dados do “STIRNG”, o fator H interage com proteínas do complemento, tais como C3, fatores B e I, e com a proteína C-reativa, confirmando seu potencial para a regulação do sistema imunológico.
A lactaderina, também conhecida como P47 e “milk fat globule-EGF factor 8 protein” (MFGE8), foi a única proteína relacionada positivamente com a motilidade espermática (Figura 4F). Em concordância com esta associação, a mesma proteina também apresentou uma relação inversa com a porcentagem dos defeitos de peça intermediária e de cauda dos espermatozoides (Figura 4G e 4H), como as demais proteínas acima
84 mencionadas. Lactaderina foi previamente identificada, por imunocitoquímica, nos testículo de suínos e em todas as partes do epidídimo (Petrunkina et al, 2003) e é possivel, assim, que os espermatozoides recém-formados são liberados no lúmen seminífero e transportados para o epidídimo já com a lactaderina vinculada ao acrossoma. Estes autores também sugerem que a ligação desta proteína ao espermatozoide pode ser regulada quando ocorre a maturação espermáticano epidídimo e durante a capacitação e reação acrossómica. Como a maioria dos defeitos é originada durante a espermiogênese nos testículos, e a motilidade espermática é definida durante o trânsito do epidídimo, é possível que a lactaderina tenha uma importante participação em tais eventos, fato que acorda com as associações da mesma com os parâmetros espermáticos dos varrões. Além disso, a ligação de espermatozoides com a lactaderina epididimária facilitou a interação destes como os oócitos, em ratos (Raymond et al, 2009) e, em cachaços, a lactaderina foi isolada com a membrana plasmática dos espermatozoides devido á afinidade deste componente com glicoproteínas da zona pelúcida (Ensslin et al. 1998). De fato, com base na análise das associações de proteínas, a lactaderina interage com a proteína integrante de membrana 2B, que é capaz de se ligar ao espermatozoide. A MFGE8 também se liga com a apolipoproteínas A1 e A4, as quais participam no metabolismo do colesterol e são expressas no fluido do oviduto e contribuem para a capacitação espermática (Petrunkina et al, 2003). Outro estudo ainda indica que a lactaderina previne a ligação da E. coli nas células epiteliais intestinais de leitões, agindo como um promotor de proteção. Assim, é possível que a lactaderina possa exercer funções não somente durante a maturação e capacitação do espermatozoide, mas também contribuindo para a sobrevivência dos espermatozoides quando em contato com bactérias e para a capacidade de fertilização dos mesmos (Shahriar et a, 2006). Conforme mostrado através da análise com a base de dados do sistema “Metacore”, a MFGE8 extracelular interage com alpha-V e beta-3 integrinas e desencadeia a ativação de sistemas de mensageiros secundários, modulação de fatores de transcrição, o que sugere uma função da lactaderina sobre mecanismos de ação associados à gametogênese e função epididimária.
Em conclusão, descreve-se, no presente trabalho, o proteoma do plasma seminal dos suínos, o qual esta composto prioritariamente de várias classes de espermadesinas. Também reporta-se a existência de associações significativas entre proteínas do plasma seminal
85 (CH4 and secreted domains of swine IgM, fibronectin 1, IgG-binding protein, lactadherin e complement factor H precursor) e parâmetros espermáticos. Tais relações empíricas servirão como base para a determinação de marcadores moleculares da função espermática na espécie suína.
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