estatísticas significativas (p < 0,05) tanto entre os grupos de varrões (G1, G2 e G3) avaliados nos períodos D0 e D60. Observa-se que os animais do grupo G1 foram melhores com relação aos três parâmetros espermáticos escolhidos, seguidos daqueles definidos nos grupos G2 e G3, com base principalmente na porcentagem de espermatozoides normais. Observou-se que a suplementação com o complexo mineral vitamínico por 60 dias não causou variações significativas nos parâmetros de motilidade e vigor espermático nos varrões do grupo G1. No entanto, incrementos (p < 0,05) foram detectados na motilidade espermática dos grupos G2 e G3 e vigor espermático nas amostras dos varrões do G2, para comparações entre os períodos D0 e D60 (Tabela 3).
O tratamento com suplemento mineral vitamínico apresentou efeito positivo sobre a percentagem de espermatozoides normais nos varrões dos grupos G2 e G3 (p < 0,05), mas tal efeito não foi observado para animais do grupo G1 (p < 0.05; Tabela 4). A ocorrência de defeitos como gota citosplasmática proximal e distal e defeitos de cauda, no entanto,
117 apresentaram reduções significativas em todos os grupos de varrões 60 dias após a suplementação. Não houve efeito significativo de período sobre os defeitos de cabeça, enquanto um aumento significativo (p < 0,05) foi observado sobre os defeitos de peça intermediária. As médias dos resultados dos testes de integridade de membrana (sptz reativos ao teste hiposmótico), bem como as percentagens de espermatozoides vivos com acrossoma íntegro apresentaram incrementos significativos (p < 0,05), enquanto os percentuais de espermatozoides vivos e mortos com dano no acrossoma reduziram significativamente entre os períodos D0 e D60 para os três grupos avaliados no presente estudo (Tabela 5).
118
Tabela 3. Motilidade e vigor espermático (média ± erro padrão) de grupos (G1, G2 e G3) de suínos adultos antes (D0) e 60 dias após (D60) a suplementação com complexo vitamínico-mineral.
Variável Grupos
Dias em relação à suplementação
D0 D60 Variação (%) (D60/D0) Motilidade* G1 85,0 ± 2,0a 86,3 ± 2,4a 1,5 G2 67,5 ± 2,5b 86,3 ± 2,4a 27,9 G3 77,5 ± 4,8ab 86,8 ± 3,1a 12,0 Vigor* G1 4,0 ± 0,0a 4,1 ± 0,2a 2,5 G2 3,0 ± 0,2b 4,4 ± 0,1a 46,7 G3 3,8 ± 0,3a 4,0 ± 0,2a 5,2
Letras minúsculas indicam as variações (p < 0,05) entre os grupos dos animais (G1, G2 e G3), para cada período de avaliação (D0 e D60). Variáveis sobrescritas com asteriscos apresentaram efeito significativo (p < 0,05) de período (D0 e D60), conforme observados nas figuras 1A e 1B.
119
Tabela 4. Morfologia espermática (média ± erro padrão) de grupos de suínos adultos suplementados com complexo vitamínico-mineral. No dia 0, realizou-se a primeira coleta de semen e subsequente suplementação dos animais. Amostras adicionais de sêmen foram avaliadas no dia 60.
Variável Grupos
Dias em relação à suplementação
D0 D60 Variação (%) (D60/D0) Espermatozoides normais (%)* G1 83,0 ± 1,8a 85,4 ± 2,3a 2,9 G2 69,4 ± 1,3ab 80,8 ± 3,6a 16,4 G3 54,1 ± 9,7b 76,8 ± 6,8a 41,9 Defeito de peça intermediária* G1 2,3 ± 1,3a 4,6 ± 1,3a 100 G2 1,9 ± 0,8a 6,8 ± 1,2a 257,8 G3 2,8 ± 1,3a 4,8 ± 1,5a 71,4 Gota citoplasmática proximal* G1 3,6 ± 1,1a 2,5 ± 1,3a 44 G2 2,4 ± 1,6a 0,1 ± 0,1a 2300 G3 10,3 ± 4,1a 2,1 ± 1,8a 390,4 Gota citoplasmática distal* G1 1,6 ± 0,2a 0,8 ± 0,7b 100 G2 3,8 ± 2,4a 0,1 ± 0,1b 3700 G3 12,5 ± 6,2a 3,7 ± 1,5a 237,8 Defeitos de cauda* G1 9,3 ± 2,2b 6,0 ± 1,5a 55 G2 20,6 ± 2,9a 10,3 ± 2,5a 100 G3 17,5 ± 5,3ab 8,2 ± 1,6a 113,4
Letras minúsculas indicam as variações (p < 0,05) entre os grupos dos animais (G1, G2 e G3), para cada período de avaliação (D0 e D60). Variáveis sobrescritas com asteriscos
120 apresentaram efeito significativo (p < 0,05) de período (D0 e D60) conforme observado nas figuras 1C e 1D.
121
Tabela 5. Parâmetros funcionais espermáticos (média ± erro padrão) de grupos de suínos adultos suplementados com complexo vitamínico-mineral. No dia 0, realizou-se a primeira coleta de sêmen e subsequente suplementação dos animais. Amostras adicionais de sêmen foram avaliadas no dia 60.
Variável Grupos
Dias em relação à suplementação
D0 D60 Variação (%) (D60/D0) Espermatozoides reativos ao teste hiposmótico* G1 68,3 ± 6,4a 76,2 ± 1,4a 11,5 G2 63,4 ± 3,7a 78,5 ± 3,9a 23,8 G3 55,5 ± 9,7a 80,0 ± 2,9a 44,1 Espermatozoides vivos com acrossoma
íntegro*
G1 32,9 ± 9,1a 68,1 ± 2,6a 106,9
G2 20,9 ± 8,4a 70,7 ± 2,1a 238,3
G3 25,6 ± 7,5a 61,9 ± 6,1a 141,8
Espermatozoides vivos com dano no
acrossoma*
G1 49,3 ± 6,8a 24,4 ± 3,6a 102
G2 48,8 ± 3,2a 16,4 ± 1,1a 197,6
G3 47,0 ± 6,7a 26,2 ± 2,4a 79,4
Espermatozoides mortos com danos no
acrossoma*
G1 10,1 ± 5,1a 1,3 ± 0,5a 676,9
G2 19,1 ± 4,5a 2,7 ± 0,8a 607,4
G3 17,4 ± 4,2a 2,5 ± 0,7a 596
Letras minúsculas indicam as variações (p < 0,05) entre os grupos dos animais (G1, G2 e G3), para cada período de avaliação (D0 e D60). Variáveis sobrescritas com asteriscos apresentaram efeito significativo (p < 0,05) de período (D0 e D60), conforme observados nas figuras 1E e 1H.
122
9.3 Proteínas do plasma seminal 9.3.1 Mapas eletroforéticos
O perfil eletroforético bidimensional das proteínas seminais dos suínos no período D0 é mostrado na figura 2, onde foram detectados, em média 245,8 ± 69,5 spots proteicos/gel, com 36 spots consistentemente presentes em todos os 12 géis utilizados na análise. No segundo período (D60), foram detectados 263,8 ± 88,5 spots/gel e também 36 spots expressos em todos os 12 géis. O incremento no número de spots/gel entre os períodos D0 e D60 não foi significativo (p > 0.05) e também não houve efeito da suplementação sobre a intensidade dos spots avaliados nos mapas do plasma seminal (figura 3).
123
(A1) (A2)
(B1) (B2)
Figura 2. Mapas bidimensionais das proteínas do plasma seminal de suínos. A figura
(A1) representa o mapa proteico do período D0 de um dos cachaços, e a figura (A2) representa o período D60 do mesmo animal. Da mesma forma a figura (B1) representa o mapa protéico de um segundo cachaço no período D0, e (B2) representa o do período D60 do mesmo.
Figura 3. Mapas bidimensionais das proteínas
identificadas por espectrometria de massa.
as do plasma seminal de suínos, com a representação em 3D de q
124 e quatro spots proteicos que foram
125
9.3.2 Cromatografia
O procedimento cromatográfico permitiu a separação de cinco picos diferentes (Figura 4), sendo os dois primeiros picos (P1 e P2) formados por proteínas sem afinidade pela heparina, os quais representaram 61,6 % das proteínas do plasma seminal. Os outros três picos (P3, P4 e P5), com protéinas que apresentaram níveis crescentes de afinidade pela heparina, compuseram 38,4 % das proteínas do fluído seminal e, dentre estes últimos três picos, o P5 foi o pico com maior área. As comparações das áreas dos picos do período D0, para cada varrão, com as áreas dos respectivos picos avaliados no período D60 não apresentaram diferenças significativas (p > 0,05; Figura 5).
126
Figura 4. Cromatograma de afinidade à heparina do plasma seminal suíno. A linha azul
representa as unidades de absorbância de 280 nm e a verde, as porcentagens do tampão de eluição (17, 24, 46 and 100 mM NaCl) aplicadas à coluna HiTrap de Heparina (1 mL). P1 e P2 representam as frações do plasma seminal sem afinidade à heparina e P3, P4 e P5, as proteinas com afinidade.
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 ml mAu 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0
127
Figura 5. Cromatogramas de afinidade à heparina do plasma seminal suíno. A linha
azul representa o perfil de proteínas do plasma seminal com afinidade pela heparina antes da suplementeção (D0) e a linha ponteada vermelha representa o mesmo perfil 60 dias após (D60) a suplementação de um mesmo animal, medidas em unidades de absorbância de 280 nm. Cada letra (A - F) representa o cromatograma de animais diferentes.
A B
C D
E F
128
9.4 Suplementação das fêmeas
A suplementação com o mix vitamínico – mineral fornecida aos três grupos de fêmeas (marrãs, porcas de primeiro parto e de segundo parto) não apresentou efeitos significativos (p > 0,05) sobre o número de leitões nascidos vivos, peso ao nascimento, peso ao desmame e intervalo desmama-cio (IDC; Tabela 6).
Tabela 6. Médias e desvio padrão dos parâmetros reprodutivos das fêmeas suínas
(marrãs, porcas de primeiro parto e porcas de segundo parto) suplementadas ou não via subcutanea com o complexo vitamínico-mineral Selen-fos® e Zimag®.
Categoria/ Ordem de parto Tratamento Número de leitões vivos Peso nascimento (kg) Peso desmama (kg) IDC (Dias) Marrãs Mix Selen-Fos® e Zimag® 12,2 ± 2,5 1,3 ± 0,2 5,3 ± 0,7 - Controle 11,6 ± 2,7 1,3 ± 0,2 5,1 ± 0,5 - Primeiro parto Mix Selen-Fos® e Zimag® 11,6 ± 2,8 1,6 ± 0,3 5,9 ± 0,6 10,9 ± 10,2 Controle 11,4 ± 3,5 1,5 ± 0,3 5,9 ± 1,1 8,5 ± 7,6 Segundo parto Mix Selen-Fos® e Zimag® 13,2 ± 2,4 1,7 ± 0,5 6,6 ± 1,1 8,2 ± 8,9 Controle 12,8 ± 2,8 1,8 ± 0,4 6,4 ± 0,7 9,5 ± 8,0
129
10DISCUSSÃO
Um dos objetivos desta pesquisa foi avaliar o efeito da suplementação subcutânea do mix vitamínico – mineral na produção de sêmen, qualidade espermática do plasma seminal suíno. Nas características dos ejaculados (volume, concentração espermática e espermatozoides totais do ejaculado) não houve diferença estatística antes e 20, 40 e 60 dias após a suplementação. Estes resultados concordam com outras pesquisas onde também não acharam diferenças na produção de espermatozoides usando selênio e/ou vitamina E via oral (Segerson et al, 1981; Marin-Guzman et al, 1997; Lovercamp et al, 2013). No entanto, Jacino et al, (2002), avaliando fontes orgânicas e inorgânicas de selênio aliadas a vitamina E em cachaços, não encontraram efeito dos tratamentos sobre a motilidade ou volume do ejaculado, porém, a concentração espermática foi maior quando os animais foram suplementados com fontes quelatadas de selênio. López et al, (2010) indicaram que os varrões alimentados com dietas suplementadas com selênio orgânico produzem ejaculados com maior concentração espermática comparados com os varrões que foram alimentados com dietas suplementadas com selênio inorgânico.
No presente estudo os parâmetros motilidade, vigor, integridade da membrana espermática (HOST), e morfologia, apresentaram, de maneira geral, melhora a partir de 60 dias após a suplementação. Marin-Guzman et al, (1997) também observou melhora na motilidade espermática de cachaços suplementados oralmente com Se (0,5 ppm). O incremento na motilidade pode ser explicado devido ao fato do selênio estar envolvido diretamente na movimentação flagelar do gameta, uma vez que Brown e Burk, (1973) e Calvin et al, (1981) observaram aumento da concentração de selênio na peça intermediária de espermatozoides de ratos previamente suplementados com esse mineral via injetável. É na peça intermediária que se encontram as mitocôndrias responsáveis pela geração de energia (ATP) no processo de movimentação flagelar (Calvin et al., 1981). No presente estudo, observou-se um pequeno, mas significativo aumento dos defeitos de peça intermediária 60 dias após a suplementação. É possível que este aumento seja reflexo de maior atividade metabólica energética ocorrida na peça intermediária, dado o aumento na concentração de Se naquele segmento, e esta maior atividade energética seja acompanhada de conseqüente estresse oxidativo, embora tal aumento seja de baixa magnitude, não superando os limites de defeitos totais pré-
130 estabelecidos para varrões adultos utilizados em monta natural ou inseminação artificial (Clifford, 1997). Marin-Guzman et al, (2000) avaliando quatro tipos de dietas, suplementadas com selênio (0 e 0,5 ppm) ou com vitamina E (0 e 220 UI/kg de dieta)
observaram redução na concentração de ATP do espermatozoide na dieta não suplementada. Este efeito pode diminuir a motilidade espermática e reduzir as taxas de fecundação. A vitamina E não apresentou efeito neste parâmetro (Marin-Guzman, Mahan, e Whitmoyer 2000). Estienne, (2009) também observou aumento da porcentagem de espermatozoides com motilidade quando suplementou via oral 10 cachaços com Se (0,3 ppm). Lopez et al, (2010) suplementando varrões com fontes de selênio orgânico e inorgânico (0,4 mg/kg de alimento com Na2SeO3/kg e 80 mg de vitamina E/kg), observou diferença nas análise dos parâmetros estimados no CASA: velocidade de retilínea, retidão e linearidade, 60 e 120 dias após a suplementação. Já Lovercamp et al, (2013), não encontraram diferenças significativas nos parâmetros de qualidade espermática dos varrões também suplementados com fontes de selênio orgânico e inorgânico (0,3 ppm).
A suplementação oral de vitaminas e minerais em cachaços pode ser dificultada por barreiras fisiológicas para sua ação devido à: presença de micotoxinas; interação entre minerais e vitaminas; estresse térmico; armazenamento inadequado dos ingredientes que compõe a dieta, como alta temperatura e umidade, além da presença de metais pesados na dieta e doenças (Estiene, 2005). Por isso, os resultados observados nos trabalhos nem sempre são concordantes. A suplementação injetável oferece maior probabilidade de que os minerais e vitaminas serão absorvidos e utilizados para os fins a que se destinam.
Associado a melhora na motilidade, o aumento da porcentagem de espermatozoides com morfologia normal no grupo de cachaços suplementados pode ter sido devido à vitamina E. Marin-Guzman et al, (1997) pela suplementação oral de machos com vitamina E (220 UI/kg de dieta) encontraram melhora de motilidade e morfologia dos espermatozoides, diminuindo principalmente a incidência de gotas citoplasmáticas, embora os resultados desta dieta fossem inferiores aos resultados da dieta com suplementação de selênio. Estudos realizados por (Jacino et al, 2002) mostram que varrões suplementados com dietas que continham selênio orgânico apresentavam melhor morfologia espermática que os varrões suplementados com selênio inorgânico. Já López et al, (2010), e Lovercamp et al, (2013) não observaram
131 diferenças significativa entre os diferentes tratamentos para nenhum parâmetro morfológico.
Marin-Guzman et al, (1997) encontraram aumento da concentração da enzima glutationa-peroxidase no plasma seminal de suínos quando estes foram suplementados com selênio. Cerolini et al, (2001) demonstraram que amostras de sêmen com alta viabilidade após a descongelação apresentavam alta atividade da enzima Glutationa Peroxidase e Superóxido Dismutase, esta última enzima dependente de Zn e Cu (Lewis e Southern, 2001). O zinco desempenha vários papéis no sistema reprodutor masculino, um deles são a participação na atividade da ribonuclease que é altamente ativa durante a mitose de espermatogônias e meiose de espermatócitos, participa na maturação espermática e na preservação do epitélio germinativo e dos túbulos seminíferos e melhorar a motilidade dos espermatozoides (Cheah, 2011). Estes minerais foram acrescentados na suplementação dos machos do presente experimento, o que pode explicar a maior viabilidade das amostras do sêmen quando os machos foram suplementados.
Existe uma falta de informações sobre as necessidades nutricionais dos cachaços com respeito à influência sobre a produção de proteínas do plasma seminal. Assim, outro objetivo do trabalho foi avaliar o efeito da suplementação subcutânea do complexo vitamínico- mineral no perfil proteico do plasma seminal dos cachaços, sendo avaliado tanto pela eletroforese 2D como pela cromatografia, mas em nenhuma destas duas técnicas foram observadas diferenças significativaentre os períodos avaliados (D0 e D60). Sugere-se então que a ação da suplementação tem o efeito mais restrito aos testículos e ao epidídimo, influenciando a espermatogênese e a maturação espermática, e pouco ou nenhum efeito sobre as secreções das glândulas sexuais assessorias principal fonte dos elementos presentes no plasma seminal.
A importância do planejamento nutricional para a melhoria do desempenho reprodutivo de matrizes é cada vez mais reconhecida por especialistas em nutrição animal, e começa a ganhar força também entre criadores. Na suinocultura comercial, atividade que se desenvolve geralmente em sistema de confinamento total, a correta formulação e o balanceamento das dietas, com o uso de rações e suplementos minerais, é necessidade básica para a manutenção dos índices de fertilidade da granja.
Uma importância extrema é dada tanto às categorias de porcas lactantes como gestantes, pois todo sucesso da produção de suínos decorre da produção de leitões
132 (Ferreira et al, 2007). Devido a isso, muitas pesquisas foram e têm sido desenvolvidas com o objetivo de atender ao máximo os requerimentos dos animais nesta fase produtiva (CVC, 1998; NRC, 1998; Rostagno et al, 2005). Guias nutricionais específicas para cada linhagem de fêmea são desenvolvidos visando o máximo desempenho reprodutivo das fêmeas (PIC, 2012). Esta pode ser uma provável explicação para que não fossem encontrados resultados significativamente diferentes quando as fêmeas do experimento foram suplementadas com vitaminas e minerais, pois estas guias nutricionais específicas para a linhagem C20 Topigs foram adotados para a formulação da dieta das matrizes.
No entanto, Esquerra et al, (2011) encontraram diferenças no número de nascidos vivos, peso ao nascimento e desmame quando suplementaram matrizes com fontes de microminerais orgânicos, ao contrário do presente trabalho. Estas diferenças podem ser explicadas, pois os referidos autores avaliaram um grupo de 18.000 matrizes por um período de até o sétimo parto. Como as necessidades nutricionais das matrizes aumentam com o aumento da idade reprodutiva (Rostagno et al., 2005), este fato pode explicar esta diferença entre os dois trabalhos.
A suplementação com o complexo vitamínico mineral (Selen-Fos® e Zimag®) pode ser de grande utilidade nas centrais de sêmen das granjas de suínos já que está suplementação melhora significativamente as características seminais dos cachaços, estimulando especialmente aqueles machos que mesmo apresentando bons parâmetros reprodutivos não são todos animais elite, concluindo então que a suplementação leva a gera uma homogenidade dos animais do plantel. A suplementação não promoveu efeito significativo, nem nas proteínas do plasma seminal dos machos, nem nos parâmetro reprodutivos avaliados nas fêmeas, este último provavelmente devido à nutrição balanceadas das fêmeas, em que todas as exigências nutricionais são atendidas pela ração nutricional para aquelas categorias estudada.
133
11AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem a empresa Formilvet® por fornecer os materiais e os suplementos vitamínico-mineral, e a granja Xerez por permitir o uso do estabelecimento e dos animais.
134
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