Atividade anti-inflamatória de Mo-CBP

4.1.1. Avaliação do efeito de Mo-CBP4, via endovenosa, sobre a migração de

neutrófilos para a cavidade peritoneal induzida por carragenina

Ratos Wistar machos (n = 5) foram tratados previamente com 0,5 mL de uma solução de Mo-CBP4 nas doses de 0,1, 1 ou 10 mg/kg ou salina (controle negativo), via endovenosa. Trinta minutos depois, os animais receberam intraperitonealmente o estímulo inflamatório carragenina (Cg; 500 µg/cavidade), dissolvida em 1 mL de salina estéril. Quatro horas depois, o lavado peritoneal foi obtido injetando 10 mL de salina contendo 5 UI/mL de heparina na cavidade peritoneal dos animais. O abdômen do animal foi massageado suavemente e, através de uma incisão, foram coletados cerca de 7 mL do fluido peritoneal com pipeta de Pasteur de plástico.

As contagens total e diferencial dos leucócitos foram realizadas seguindo a metodologia descrita por Souza e Ferreira (1985). Para tal, 20 µL do fluido coletado foram diluídos em 380 µL de reagente de Turk (ácido acético 2%; violeta genciana 0,2%) e, após homogeneização, a contagem total dos leucócitos foi realizada em microscópio óptico utilizando a câmara de Neubauer. A contagem diferencial foi realizada utilizando esfregaços corados em lâminas. Neste procedimento, 50 µL do lavado foram submetidos à centrifugação a 400 x g, durante 10 minutos (citocentrífuga, modelo 2000D - Cientec). Após esse procedimento, as células foram coradas utilizando panótico rápido e a contagem realizada em microscópio óptico binocular (modelo 021, Quimis®). Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão. do número de neutrófilos x 103_{/mL de fluido peritoneal.}

4.1.2. Avaliação do efeito de Mo-CBP4, via oral, sobre a migração de neutrófilos

para a cavidade peritoneal induzida por zymosan

A metodologia usada foi descrita por Doherty e colaboradores (1985), com algumas alterações. Camundongos Swiss fêmeas (n = 5) foram tratados previamente

com Mo-CBP4 (10, 20 e 40 mg/kg) ou salina (controle negativo), via oral por gavagem em um volume de 0,5 mL. Uma hora depois, os animais receberam intraperitonealmente o estímulo inflamatório zymosan (Zy; 2,0 mg/cavidade) dissolvido em 300 µL de salina estéril. Quatro horas depois da administração de zymosan, foi obtido o lavado peritoneal injetando 3 mL de salina contendo 5 UI/mL de heparina na cavidade peritoneal dos animais. O abdomen do animal foi massageado suavemente e, através de uma incisão, foram coletados cerca de 2 mL do fluido peritoneal com pipeta de Pasteur de plástico. Dexametasona (Dex; 1,0 mg/kg s.c.) foi administrada 30 minutos antes do agente inflamatório, representando o controle positivo por se tratar de uma droga anti-inflamatória padrão.

As contagens total e diferencial dos leucócitos foram realizadas como descrito anteriormente. Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão. do número de neutrófilos x 103_{/mL de fluido peritoneal.}

4.1.2.1. Avaliação da atividade anti-inflamatória de Mo-CBP4 após aquecimento

Para avaliar a estabilidade de Mo-CBP4 frente à desnaturação térmica, a proteína foi solubilizada em salina e aquecida por 1 hora a 100 °C. Após esse procedimento, camundongos foram tratados com Mo-CBP4, aquecida ou não, na dose de 40 mg/kg, via oral, 1 hora antes da injeção i.p. do agente inflamatório zymosan. A migração dos neutrófilos foi avaliada conforme descrito anteriormente no item 4.1.2. Salina e dexametasona (1,0 mg/kg, s.c.) foram utilizadas como controle negativo e positivo, respectivamente. Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão do número de neutrófilos x 103_{/mL de fluido peritoneal.}

4.1.2.2. Avaliação da participação do sítio de ligação ao carboidrato na atividade anti- inflamatória de Mo-CBP4

Para avaliar se o sítio lectínico de Mo-CBP4 estaria envolvido no seu mecanismo de ação anti-inflamatória, a proteína foi previamente incubada com o açúcar específico, N-acetil-D-glucosamina (GlcNAc) 0,1 M, por 1 hora, à temperatura ambiente. Em seguida, os animais foram tratados com a proteína (40 mg/kg, v.o.), incubada ou não com GlcNAc, 1 hora antes da administração do zymosan. Um grupo

foi tratado apenas com o açúcar 1 hora antes da injeção do agente inflamatório, para descartar qualquer atividade inerente a tal substância. A migração dos neutrófilos foi avaliada conforme descrito anteriormente no item 4.1.2. Salina e dexametasona (1,0 mg/kg, s.c.) foram utilizadas como controle negativo e positivo, respectivamente. Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão do número de neutrófilos x 103_{/mL de fluido peritoneal.}

4.1.2.3. Avaliação do efeito de Mo-CBP4 sobre a liberação de citocinas pró- e anti-

inflamatórias

Animais foram previamente tratados com Mo-CBP4 (40 mg/kg) via oral e, 1 hora depois, o agente inflamatório zymosan (2,0 mg/cavidade) foi injetado intraperitonealmente. Salina foi usada como controle negativo. Duas horas depois da indução da peritonite, os camundongos foram levemente anestesiados com éter etílico e amostras de sangue foram coletadas através do plexo retro-orbital, utilizando capilares contendo EDTA (2%). O soro foi obtido por centrifugação do sangue durante 10 minutos, a 600 x g. O fluido peritoneal foi obtido como descrito anteriormente.

Para determinar as concentrações de IL-_{1 , TNF-α e IL-10, foi utilizado o} ensaio de imunoadsorção ligada à enzima (ELISA), baseado em protocolo já descrito (Cunha et al., 2000). Placas de microtitulação (96 poços) foram sensibilizadas com 50 µL de tampão PBS, contendo 2,0 µg/mL de anticorpo monoclonal anti-IL-_{1 , anti-TNF-} α ou anti-IL-10 de soro de carneiro. As placas foram incubadas por 12 horas a 4 °C e, após esse período, lavadas de 3 a 5 vezes com tampão PBS contendo 0,05% de Tween 20. Em seguida, foram adicionados 50 µL de albumina sérica bovina 1% (solução de bloqueio) e procedida incubação durante 2 horas à temperatura ambiente. As placas foram novamente lavadas como descrito anteriormente e, em seguida, adicionadas das amostras testes (fluido e soro), em triplicata. Curvas-padrão foram obtidas utilizando concentrações crescentes de IL-1 , TNF-α e IL-10, diluídas em PBS-Tween. Após um período de incubação de 24 horas a 4 °C, foram adicionados os anticorpos monoclonais biotinilados anti-IL-1 , anti-TNF-α e anti-IL-10, diluídos BSA 1% e Tween 0,05%. Após 1 hora à temperatura ambiente, as placas foram lavadas e foram adicionados 50 µL do complexo HRP – avidina, diluído 1:5000. A reação foi interrompida com H2SO4 1 M e a absorbância foi medida a 490 nm em

espectrofotômetro. As concentrações de citocinas contidas nas amostras foram determinadas a partir da curva padrão. Os resultados foram expressos em picogramas de citocinas/mL de soro ou de fluido peritoneal.