Determinação da massa molecular de Mo-CBP

Com a finalidade de se obter as massas moleculares da proteína íntegra, bem como de suas subunidades, Mo-CBP4 foi submetida à análise em espectrômetro de massa do tipo ESI-TOF. O espectro de massa desconvoluído da proteína íntegra (FIGURA 5) mostra um pico majoritário com massa molecular de 11,780 kDa, apesar do perfil eletroforético em condições desnaturantes mostrar duas bandas proteicas (27 kDa e 16 kDa). Mo-CBP4 reduzida e alquilada apresentou espectro de massa com dois picos principais: um menor com massa molecular de 3,888 kDa e um maior com 8,428 kDa (FIGURAS 6A e 6B, respectivamente), mostrando que a proteína possui duas cadeias de massas moleculares distintas ligadas por pontes dissulfeto.

5.2.2. Sequência de peptídeos trípticos de Mo-CBP4

Mo-CBP4 também foi submetida à digestão tríptica, seguida de análise em espectrômetro de massa do tipo ESI-Q-TOF MS/MS em uma tentativa de se obter sequência dos peptídeos gerados. Após busca em banco de dados e alinhamento com proteínas com sequências depositadas, foram identificados 4 peptídeos representativos apresentando alta similaridade com outras proteínas de sementes de

M. oleifera, além de albuminas 2S de outras espécies de planta como, Sesamum indicum, Corylus avellana e Capparis masaikai (TABELAS 2 e 3)..

Figura 05 - Espectro de massa de Mo-CBP4 íntegra por TOF-ESI-MS

Espectro desconvoluído de Mo-CBP4 (10 µg) mostrando um pico com massa molecular de 11,78 kDa.

Figura 6 – Espectro de massa de Mo-CBP4 reduzida por TOF-ESI-MS

Espectro desconvoluído da cadeia menor (A) e da cadeia maior (B) de Mo-CBP4 (5 µg) por TOF-ESI-MS.

A

Tabela 2 _{– Sequências dos peptídeos 1, 2 e 3 obtidas a partir da digestão tríptica de Mo-CBP}4

#_{ID corresponde ao número de identificação da proteína no NCBI. *,+ simbolizam identidade e similaridade, respectivamente, entre os resíduos dos peptídeos}

e aqueles depositados no banco de dados. Peptídeo 1 - QGPGRQPDFQR

Proteína Organismo Sequência Similaridade ID#

MO2.1 e MO2.2 M. oleifera 1 QGPGRQPDFQR 11 _*********** 100% P24303.1

2.1 protein M. oleifera 1 QGPGRQPDFQR 11 _*********** 100% CAC69951.1

Flocculating protein M. oleifera 1 QGPGRQPDFQR 11 _*********** 100% 2111235A

2S albumin precursor (I3) M. oleifera 86 QGPGRQPAFQR 96 _{******* ***} 91% AHG99683.1

Peptídeo 2 - CCQQLR

Proteína Organismo Sequência Similaridade ID#

2.1 protein M. oleifera 12 CCQQLR 17 _****** 100% CAC69951.1

2S albumin precursor (I4) M. oleifera 99 CCQQLR 104 _****** 100% AHG99684.1

2S albumin precursor (I3) M. oleifera 97 CCQQLR 102 _****** 100% AHG99683.1

2S albumin S. indicum 91 CCQQLR 96 _****** 100% ACI41245.1

2S albumin C. avellana 87 CCQQLR 92 _****** 100% ACO56333.1

2S albumin precursor (I2) M. oleifera 99 CCRQLR 104 _{** ***} 83% AHG99682.1

2S albumin precursor (I1) M. oleifera 99 CCRQLR 104 _{** ***} 83% AHG99681.1

Peptídeo 3 – NISPPCR

Proteína Organismo Sequência Similaridade ID#

2.1 protein M. oleifera 18 NISPPCR 24 _******* 100% CAC69951.1

Tabela 3 _{– Sequência do peptídeo 4 obtido a partir da digestão tríptica de Mo-CBP}4

Peptídeo 4 - QAVQLTHQQQGQVGPQQVR

Proteína Organismo Sequência Similaridade ID#

MO 2.1 M. oleifera 30 QAVQLTHQQQGQVGPQQVR 48

******************* 100% AAB34890.1

MO2.1 e MO2.2 M. oleifera 30 QAVQLTHQQQGQVGPQQVR 48

******************* 100% P24303.1

2.1 protein M. oleifera 30 QAVQLTHQQQGQVGPQQVR 48

******************* 100% CAC69951.1

Flocculating protein M. oleifera 30 QAVQLTHQQQGQVGPQQVR 48

******************* 100% 2111235A

2S albumin precursor (I3) M. oleifera 115 QAVQLTHQQQGQVGPQQVR 133

******************* 100% AHG99683.1

2S albumin precursor (I4) M. oleifera 117 QAVQLAHQQQGQVGPQQVR 135

******************* 100% AHG99684.1

2S albumin precursor (I2) M. oleifera 117 QAVQSAQQQQGQVGPQQV 134

**** +*********** 89% AHG99682.1

2S albumin precursor (I1) M. oleifera 117 QAVQSAQQQQGQVGPQQV 134

**** +*********** 89% AHG99681.1

Mabinlin I-1 B-chain C. masaikai 28 QAAHQQLYQGQIEGPRQVR 46

* *** ***+ ** *** 63% AAB31597.1

#_{ID corresponde ao número de identificação da proteína no NCBI. *,+ simbolizam identidade e similaridade, respectivamente, entre os resíduos dos peptídeos}

5.3. Determinação da sequência NH2-terminal

Previamente a determinação da sequência NH2-terminal de Mo-CBP4, foi necessário o isolamento das subunidades da proteína por cromatografia de fase reversa acoplada ao HPLC. Como pode ser verificado na FIGURA 7, o perfil cromatográfico da proteína reduzida e alquilada mostrou dois picos, onde, após análise em gel de poliacrilamida 17,5%, verificou-se que o primeiro pico correspondia à cadeia menor e o segundo pico a cadeia maior.

O sequenciamento NH2-terminal da subunidade de menor massa (cadeia A) gerou uma sequência de 19 resíduos de aminoácidos (QQQQCRQGQQTHQRQRVCQ). Após uma análise comparativa em banco de dados do NCBI observou-se que a sequencia gerada apresentou alta similaridade com as 4 isoformas do precursor de albumina 2S de M. oleifera (TABELA 4). Em relação a subunidade maior (cadeia B), foram gerados 21 resíduos da sequência NH2-terminal (ARRPAIQRCCQQLRNIQVQCR). Esta sequência apresentou alta similaridade com outras proteínas de sementes de M. oleifera, além de albuminas 2S de outras espécies como, Sesamum indicum, Solanum lycopersicum, Capparis masaikai, Helianthus

annuus (TABELA 5).

A Figura 8 mostra o alinhamento múltiplo das cadeias A e B com as isoformas do precursor de albumina 2S (I1, I2, I3 e I4) de M. oleifera com números de identificação no NCBI de AHG99681.1, AHG99682.1, AHG99683.1 e AHG99684.1. Os percentuais de identidade gerados para a cadeia A em comparação com as isoformas I1, I2, I3 e I4 foram de 62%, 61%, 72% e 74%, respectivamente. Em relação à cadeia B, os percentuais de identidade foram de 62%, 62%, 71% e 90% quando alinhadas às isoformas I1, I2, I3 e I4, respectivamente.

Figura 7 - Cromatografia líquida de alta eficiência em coluna de fase reversa de

Mo-CBP4

Mo-CBP4 (10 mg/mL) reduzida foi aplicada em coluna C18 (4,6 mm x 100 mm), previamente equilibrada com o solvente A. Solvente A: 5% acetonitrila e ácido trifluoroacético 0,05%; Solvente B: 90% acetonitrila. Para eluição foi utilizado um gradiente linear durante 50 minutos. A linha verde representa o gradiente de acetonitrila e a vermelha o perfil de eluição da proteína a 230 nm. Fluxo: 0,2 mL/h; Frações: 1 mL/tubo. SDS-PAGE de Mo-CBP4 em condições redutoras revelada com Coomassie Brilliant Blue R-250. Raia M – Marcadores de massa molecular. Raias 1 e 2 – Mo-CBP4 em condições não redutora e redutora, respectivamente. Raias 3 e 4 _{– picos P}2 e P1 correspondendo a cadeia maior e menor, respectivamente, de Mo-CBP4.

Tabela 4 _{– Análise comparativa da sequência NH}2-terminal da cadeia A de Mo-CBP4 com proteínas depositadas no NCBI

#_{ID corresponde ao número de identificação da proteína no NCBI. *,+ simbolizam identidade e similaridade, respectivamente, entre os resíduos da sequência}

NH2-terminal e aqueles depositados no banco de dados.

Cadeia A - QQQQCRQGQQTHQRQRVCQ

Proteína Organismo Sequência Similaridade ID#

2S albumin precursor (I3) M. oleifera 37 QQQRCRQ-QFQTHQRLRACQ 55

*** ** ** ***** * ** 75% AHG99683.1

2S albumin precursor (I4) M. oleifera