Estudo da citotoxicidade de Mo-CBP

4.3.1. Avaliação do potencial hemolítico utilizando eritrócitos de camundongos

Esta metodologia permite avaliar o potencial das substâncias teste em causar danos à membrana celular, seja pela formação de poros ou pela ruptura total da membrana. Para tanto, sangue foi coletado de camundongos Swiss (Mus

musculus) por via retro-orbital e diluído em 30 volumes de solução salina (NaCl 0,85%

+ CaCl2 0,01 M). As células foram lavadas 2 vezes em solução salina, seguida de centrifugação (1500 rpm/5 minutos) para redução da contaminação plasmática. Após esse procedimento, o precipitado foi ressuspendido em salina para obter uma suspensão de eritrócitos (SE) a 2%. Esse experimento foi realizado em placa de microtitulação de 96 poços, com a concentração da substância teste variando de 1,56 a 200 µg/mL. Cada poço da 1ª fileira recebeu 100 _{L da solução salina. Na 2ª fileira,} os poços receberam 80 _{L da solução salina e 20 L do veículo de diluição da} substância teste, neste caso, DMSO 10%. Aos poços da 3ª fileira, foram adicionados 80 _{L de solução salina e 20 L da substância teste em solução (1 mg/mL). Da 4ª} fileira em diante, os poços receberam 100 _{l da solução salina, excetuando-se os da} última fileira, que receberam 80 _{L de solução salina e 20 L de triton X-100 1%} (controle positivo). As diluições foram feitas da 3ª à 11ª cavidade, retirando-se 100 _L da solução da cavidade anterior e transferindo para a seguinte, de modo que as concentrações fossem sempre diluídas pela metade. Em seguida, 100 _{L da} suspensão de eritrócitos 2% foram plaqueados em todos os poços. Após incubação de 1 hora sob agitação constante à temperatura ambiente (26 _{ 2C), as amostras} foram centrifugadas (5000 rpm/ 3 minutos) e o sobrenadante foi analisado através da absorbância a 405 nm, usada para monitorar a liberação de hemoglobina.

4.3.2. Análise da citotoxicidade de Mo-CBP4 pelo teste do MTT

O teste do MTT (Mosmann, 1983) consiste em uma análise colorimétrica, baseada na conversão do sal 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2-H-brometo de tetrazolium (MTT) para formazan pela enzima succinil-desidrogenase presente na mitocôndria da célula viável, permitindo, dessa maneira, a quantificação do percentual de células vivas. Para tal, foram utilizadas linhagens de células tumorais e células normais humanas.

Células mononucleadas foram obtidas do sangue periférico de voluntários sadios, após centrifugação em gradiente de Ficoll. Estas foram removidas, lavadas com tampão fosfato e ressuspendidas em meio RPMI 1640, suplementado com 20% de soro fetal bovino, 100 U/mL penicilina, 100 µg/mL estreptomicina, para uma concentração final de final 3,0 × 105 _{células/mL. Fitohemaglutinina (3%) foi adicionada} para induzir a proliferação dos linfócitos.

As linhagens celulares HL-60, HCT-8 e SF295 foram cultivadas em frascos plásticos para cultura (Corning, 25 cm2_{, volume de 50 mL para células aderidas e 75} cm2_{, volume de 250 mL para células em suspensão), utilizando o meio de cultura} RPMI 1640, suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de antibióticos (penicilina/estreptomicina). As células foram incubadas em estufa a 37 °C, com atmosfera de 5% de CO2, seguida da observação do crescimento celular, com ajuda de microscópio de inversão, a cada 24 horas. Quando necessário, as células foram repicadas em meio de cultura novo, na concentração de 0,5 - 1,0 × 106 _{células/ mL.}

As células em suspensão ou monocamadas foram distribuídas em multiplacas de 96 cavidades, numa densidade de 0,3 × 106 _{células/mL para células} suspensas e 0,7 × 105 _{células/mL para as aderidas. Água estéril (controle negativo)} ou Mo-CBP4 foram incubadas durante 72 horas juntamente com a suspensão de células. De uma solução estoque de 5 mg/mL da lectina, foram realizadas diluições seriadas, resultando em concentrações que variaram de 0,09 a 25 µg/mL. Doxorrubicina foi utilizada como controle positivo. Após o período de incubação, as placas foram centrifugadas (1500 rpm/15 minutos) e os sobrenadantes descartados. Cada cavidade recebeu 200 µL da solução de MTT (10% em meio RPMI 1640) e foi incubada novamente durante 3 horas, em estufa a 37 °C, a 5% de CO2. Após esse período, as placas foram centrifugadas (3000 rpm/10 minutos), os sobrenadantes desprezados e os precipitados ressuspendidos em 150 µL de DMSO. Para

quantificação do sal reduzido nas células vivas, as absorbâncias foram lidas com o auxílio do espectrofotômetro de placa, no comprimento de onda de 595 nm. Os dados foram apresentados como concentração (µg/mL) citotóxica para 50% das células (CI50).

4.3.3. Teste de viabilidade celular pelo método do ATPlite™

Linhagens de células tumorais MCF-7 e Caco-2 foram cultivadas em frascos de cultura de 75 cm2_{, contendo o meio de cultura DMEM, suplementado com} 10% (v/v) de soro fetal de vitelo e 0,6% (v/v) de penicilina-estreptomicina (10000 unidades de penicilina e estreptomicina 10 mg/mL). Para as células Caco-2, também foi utilizado o meio DMEM, adicionado de aminoácidos não essenciais 0,0001 M. As culturas foram mantidas em estufa a 37 °C, 5% de CO2 e 100% de umidade relativa.

Para o ensaio de viabilidade, através do método do ATPlite™ (PerkinElmer, Groningen, Holanda), as células foram inicialmente tripsinizadas, quantificadas e ressuspendidas em meio de cultura para as concentrações finais de 20000 e 4000 células/poço. A placa de microtitulação de 96 poços foi semeada com 100 µL da suspensão de células e, em seguida, incubada durante 72 horas para MCF-7, ou 48 horas para as células Caco-2, a 37 °C, 5% de CO2 e 100% de umidade relativa.

Soluções estoque de Mo-CBP4 e concanavalina A (ConA), uma lectina sabidamente citotóxica, foram preparadas através da suspensão de 2,44 mg de cada proteína em 0,2 mL de PBS, resultando em soluções de 12200 µg/mL. Em seguida, as soluções estoque foram diluídas 14,3 vezes em DMEM e, a partir destas, feitas diluições seriadas. Todas as diluições foram adicionadas às suspensões de células, resultando no volume final de 117 µL em cada poço. A concentração final das amostras em cada poço variou de 30,6 a 244,5 µg/mL. Foram realizados controles nas mesmas condições, contendo somente DMSO e PBS a 1,7 e 7%, respectivamente. Após 24 horas de incubação, o meio de cultura foi renovado, utilizando uma pipeta manual, procedendo-se com a adição a cada poço de 50 µL de solução de lise de células de mamíferos (conteúdo do kit ATP-Lite). A placa foi agitada durante 2 minutos, usando um agitador de placas de microtitulação, seguida da adição de 50 µL de solução de substrato (kit ATP-Lite). A placa, coberta com selo adesivo, foi novamente agitada durante 1 minuto, adaptada ao escuro durante 10 minutos e a luminescência, então, medida, utilizando um leitor de microplacas multi-modo (BIO-

TEK Synergy HT, Winooski, VT, EUA). O ensaio foi realizado em triplicata para cada amostra. Ao final do experimento, as células foram visualizadas em microscópio acoplado a uma câmera digital para analisa-las quanto a integridade celular.

4.3.4. Análise estatística

Todos as análises foram realizadas pelo programa GraphPad Prism 6.0 (San Diego, CA, EUA). Diferenças significativas (p < 0,05) foram calculadas por análise de variância (ANOVA), seguida do teste de Student-Newman-Keuls.