A determinação da histerese termal foi avaliada para todos os peptídeos de primeira e segunda geração, e de acordo com os resultados obtidos nenhum peptídeo apresentou valor de histerese termal. Entretanto foi possível observar que os peptídeos Pa-MAP 1.3 e Pa-MAP 2.0 apresentaram afinidade pelos cristais de gelo. Este resultado foi determinado pela observação de modificações nos cristais de gelo, o qual ficou em no formato bipiramidal característico para AFPs. Esta modificação no cristal de gelo foi observada para ambos os peptídeos testados com a concentração de 60 mg.mL-1 (Tabela 9).
Tabela 9. Avaliação da capacidade dos peptídeos de primeira (Pa-MAP 1.4) e segunda (Pa-MAP 2.0) geração em inibir o crescimento do cristal de gelo, sendo determinado o valor de histerese termal (HT). Todos as amostras foram solubilizadas com tampão bicarbonato 100 mM, pH 8,1 para o ensaio.
7.6 ANÁLISE IN SILICO DA ESTRUTURA TRIDIMENSIONAL DOS PEPTÍDEOS DA PRIMEIRA E SEGUNDA GERAÇÃO
Os modelos tridimensionais dos peptídeos de primeira e segunda geração foram construído utilizando a estrutura tridimensional do peptídeo anticongelante tipo I com códigos
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pdb 1wfb resolvido por difração de raio-X e encontrado em Pleuronectes americanus (Sicheri et al., 1995). Esta estrutura tridimensional apresentou conformação em α-hélice e os resíduos de treonina espaçados em 16,6 Å determinando o motivo de 11 resíduos de aminoácidos. Nos alinhamentos entre as sequencias primárias dos peptídeos de primeira e segunda geração com o molde 1wfb apresentaram 48, 59, 55, 50, 43, 53, 53, 53 e 57% dos resíduos idênticos (Figura
24A a 32A).
A validação dos peptídeos de primeira e segunda geração foi conduzida utilizando o programa PROCHECK o qual avalia por meio do mapa de Ramachandran e o g-score (qualidade do modelo em relação aos parâmetros de ângulos diedros e das forças covalentes da cadeia principal) a confiabilidade do modelo em relação ao molde (Tabela 9). Os peptídeos Pa-MAP 1.2; Pa-MAP 1.3; Pa-MAP 1.4; Pa-MAP 1.5; Pa-MAP 1.6; Pa-MAP 1.7; Pa-MAP 1.8; Pa- MAP 1.9 e Pa-MAP 2.0 foram validados com a análise do mapa de Ramachandran os quais apresentaram valores confiáveis, todos na região dos resíduos favoráveis a formação de estrutura secundária em α-hélice (Figura 24B a 32B). O valor de g-score para os peptídeos o qual se refere a uma qualidade total das estruturas tridimensionais levando em consideração os parâmetros físico-químicos como distribuição de Phi-psi, de Chi1-chi2, Chi3 e chi4 e Omega foram confiáveis, com valores que dentro da normalidade. Outra avaliação realizada foi à sobreposição estrutural dos peptídeos de primeira e segunda geração com o molde (1wfb) utilizado para a construção tridimensional, os quais apresentaram 1,92; 0,45; 0,47; 0,68; 1,06; 1,41; 0,65; 0,63 e 0,4 estes valores indicam pouca variação estrutural, sendo reflexo resultante da conservação da sequência primária (Tabela 10). Em adição a sequência dos peptídeos foi submetida à predição da estrutura secundária in silico pelo servidor SOPMA, o qual demonstra o provável conteúdo de
estrutura secundária, seja ela α-hélice, fita-β, turn e coil. Para os peptídeos Pa-MAP 1.2; Pa- MAP 1.3; Pa-MAP 1.4; Pa-MAP 1.5; Pa-MAP 1.6; Pa-MAP 1.7; Pa-MAP 1.8; Pa-MAP 1.9 e Pa-MAP 2.0 todos apresentam 100% de probabilidade para conformação em α-hélice, com exceção Pa-MAP 1.6 o qual apresentou 93% para a conformação da estrutura secundária em α- hélice. As predições observadas no servidor SOPMA reforçaram ainda mais a ideia da conformação em α-hélice também observado para os modelos tridimensionais após as validações (Figura 24C a 32C).
Tabela 10. Resumo dos valores obtidos para as regiões do Mapa de Ramachandran e os valores de g-score para todos os peptídeos de primeira e segunda geração.
Peptídeo
Mapa de Ramachandran (Região)
g- score RMSD (Ǻ) Favorável (%) Permitida (%) Generosamente (%) Não permitida (%) Pa-MAP 1.2 96,3 3,7 0,0 0,0 0,15 1,92 Pa-MAP 1.3 100,0 0,0 0,0 0,0 0,16 0,45 Pa-MAP 1.4 100,0 0,0 0,0 0,0 0,14 0,47 Pa-MAP 1.5 96,2 3,8 0,0 0,0 0,18 0,68 Pa-MAP 1.6 95,2 0,0 4,8 0,0 0,14 1,06 Pa-MAP 1.7 100,0 0,0 0,0 0,0 0,17 1,41 Pa-MAP 1.8 100,0 0,0 0,0 0,0 0,13 0,65 Pa-MAP 1.9 100,0 0,0 0,0 0,0 0,18 0,4 Pa-MAP 2.0 100,0 0,0 0,0 0,0 0,12 0,4
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Figura 24. Alinhamento, validação e modelo final para Pa-MAP 1.2. (A) Alinhamento entre o molde e o Pa-MAP 1.2. (B) Mapa de Ramachandran avaliando os ângulos torsionais Phi e Psi para o modelo final do pep 1.2. (C) Representação tridimensional em cartoon do peptídeo Pa-MAP 1.2 construído por modelagem comparativa usando o programa Modeller 9v11. Em bastão estão representados os resíduos de lisina (azul) e treonina (amarelo). Para visualização foi utilizado o programa PyMol v0.99.
Figura 25. Alinhamento, validação e modelo final para Pa-MAP 1.3. (B) Mapa de Ramachandran avaliando os ângulos torsionais Phi e Psi para o modelo final do pep 1.3. (C) Representação tridimensional em cartoon do peptídeo Pa-MAP 1.3 construído por modelagem comparativa usando o programa Modeller 9v11. Em bastão estão representados os resíduos de lisina (azul) e treonina e leucina (amarelo). Para visualização foi utilizado o programa PyMol v0.99.
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Figura 26. Alinhamento, validação e modelo final para Pa-MAP 1.4. (B) Mapa de Ramachandran avaliando os ângulos torsionais Phi e Psi para o modelo final do Pa-MAP 14. (C) Representação tridimensional em cartoon do peptídeo Pa-MAP 1.4 construído por modelagem comparativa usando o programa Modeller 9v11. Em bastão estão representados os resíduos de lisina (azul) e treonina (amarelo). Para visualização foi utilizado o programa PyMol v0.99.
Figura 27. Alinhamento, validação e modelo final para Pa-MAP 1.5. (A) Alinhamento múltiplo entre o molde e o
Pa-MAP 1.5. (B) Mapa de Ramachandran avaliando os ângulos torsionais Phi e Psi para o modelo final do Pa-MAP
1.5. (C) Representação tridimensional em cartoon do peptídeo Pa-MAP 1.5 construído por modelagem comparativa usando o programa Modeller 9v11. Em bastão estão representados os resíduos de lisina (azul) e treonina (amarelo). Para visualização foi utilizado o programa PyMol v0.99.
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Figura 28. Alinhamento, validação e modelo final para Pa-MAP 1.6. (A) Alinhamento múltiplo entre o molde e o
Pa-MAP 1.6. (B) Mapa de Ramachandran avaliando os ângulos torsionais Phi e Psi para o modelo final do Pa-MAP
1.6. (C) Representação tridimensional em cartoon do peptídeo Pa-MAP 1.6 construído por modelagem comparativa usando o programa Modeller 9v11. Em bastão estão representados os resíduos de lisina (azul) e treonina (amarelo). Para visualização foi utilizado o programa PyMol v0.99.
Figura 29. Alinhamento, validação e modelo final para Pa-MAP 1.7. (A) Alinhamento múltiplo entre o molde e o
Pa-MAP 1.7. (B) Mapa de Ramachandran avaliando os ângulos torsionais Phi e Psi para o modelo final do Pa-MAP
1.7. (C) Representação tridimensional em cartoon do peptídeo Pa-MAP 1.7 construído por modelagem comparativa usando o programa Modeller 9v11. Em bastão estão representados os resíduos de lisina (azul) e treonina e leucina (amarelo). Para visualização foi utilizado o programa PyMol v0.99.
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Figura 30. Alinhamento, validação e modelo final para Pa-MAP 1.8. (A) Alinhamento múltiplo entre o molde e o
Pa-MAP 1.8. (B) Mapa de Ramachandran avaliando os ângulos torsionais Phi e Psi para o modelo final do Pa-MAP
1.8. (C) Representação tridimensional em cartoon do peptídeo Pa-MAP 1.8 construído por modelagem comparativa usando o programa Modeller 9v11. Em bastão estão representados os resíduos de lisina (azul) e treonina e leucina (amarelo). Para visualização foi utilizado o programa PyMol v0.99.
Figura 31. Alinhamento, validação e modelo final para Pa-MAP 1.9. (A) Alinhamento, validação e modelo final para Pa-MAP 1.9. (A) Alinhamento múltiplo entre o molde e o Pa-MAP 1.9. (B) Mapa de Ramachandran avaliando os ângulos torsionais Phi e Psi para o modelo final do Pa-MAP 1.9. (C) Representação tridimensional em cartoon do peptídeo Pa-MAP 1.9 construído por modelagem comparativa usando o programa Modeller 9v11. Em bastão estão representados os resíduos de lisina (azul) e treonina e leucina (amarelo). Para visualização foi utilizado o programa PyMol v0.99.
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Figura 32. Alinhamento, validação e modelo final para Pa-MAP 2.0. (A) Alinhamento múltiplo entre o molde e o
Pa-MAP 2.0. (B) Mapa de Ramachandran avaliando os ângulos torsionais Phi e Psi para o modelo final do Pa-MAP
2.0. (C) Representação tridimensional em cartoon do peptídeo Pa-MAP 2.0 construído por modelagem comparativa usando o programa Modeller 9v11. Em bastão estão representados os resíduos de lisina (azul) e treonina (amarelo). Para visualização foi utilizado o programa PyMol v0.99.
Em resumo dentre todos os peptídeos da primeira e segunda geração, podemos identificar claramente uma evolução nas atividades em relação à atividade antibacteriana (devido a não realização de outros ensaios com todos os peptídeos da segunda geração) e uma perda da afinidade a cristais de gelo, consequentemente uma perda da atividade anticongelante. Os peptídeos com melhor desempenho sobre micro-organismo na primeira geração foi o Pa-MAP que se tornou também o molde juntamente com o Pa-MAP 1.3 devido a afinidade ao gelo, para o redesenho de outros peptídeos na segunda geração. Ainda na primeira geração foi possível identificar algumas atividades interessantes como contra células tumorais em cultura, no caso obtidas para os peptídeos Pa-MAP 1.2, Pa-MAP 1.3, Pa-MAP 1.4. Outra atividade explorada foi nos ensaios anticongelantes para os peptídeos da primeira e segunda geração os quais não demonstraram efeito anticongelante (não apresentaram valores de histerese termal), mas por outro lado foi possível demonstrar que os peptídeos Pa-MAP 1.3 e Pa-MAP 2.0 da primeira e segunda geração apresentaram afinidade pelos cristais de gelo causando clara modificação na geometria do cristal. Outra interessante característica observada para os peptídeos da primeira geração foi a ausência de toxicidade frente a eritrócitos e células de mamíferos, portanto esta excelente característica para a indústria farmacêutica no desenvolvimento de produtos biotecnológicos também foi conservada na segunda geração. Em adição, os peptídeos da segunda geração Pa-MAP 1.5 e Pa-MAP 1.9 apresentaram valores de MIC menores sendo interessantes no desenvolvimento de fármacos contra bactérias Gram-negativas. As estruturas tridimensionais teóricas para todos os peptídeos da primeira e segunda geração foram em α-hélice, e seus momentos hidrofóbicos foram mais bem explorados na segunda geração, reflexo disso pode ser visto nos valores de MICs encontrados para alguns representantes dessa geração (Tabela 11).
124 Tabela 11. Resumo das características físico-químicas avaliadas para todos os peptídeos da primeira e segunda geração como carga, taxa de hidrofobicidade, média relativa do momento hidrofóbico e comprimento.
* MIC para os ensaios antibacterianas somente contra E. coli.
Peptídeo Carga
Taxa de Hidrofobicidade
(%)
Média Relativa do Momento Hidrofóbico
Comprimento (aa)
MIC antibacteriana* (μM)
Escala Kyte & Doolittle Escala Eisenberg
Pa-MAP 1.2 +1 75 0,19 0,12 29 0,0 Pa-MAP 1.3 +3 77 0,03 0,04 27 0,0 Pa-MAP 1.4 +6 66 0,12 0,11 27 0,0 Pa-MAP 1.5 +6 78 0,38 0,32 28 3,2 Pa-MAP 1.6 0 60 0,42 0,29 23 0,0 Pa-MAP 1.7 +4 64 0,39 0,28 28 0,0 Pa-MAP 1.8 +3 67 0,13 0,07 28 0,0 Pa-MAP 1.9 +4 64 0,38 0,26 28 6,0 Pa-MAP 2.0 +6 64 0,38 0,32 28 0,0 Pa-MAP -1 73 0,17 0,10 26 30,0 Pleurocidina +4 44 0,29 0,28 25 3,5 Pardaxina 0 45 0,08 0,04 33 3,0
8 DISCUSSÃO
A incidência emergente de mecanismos de resistência a antimicrobianos desenvolvidos por patógenos é atualmente uma séria ameaça à saúde pública mundial. A resistência desenvolvida por micro-organismos patogênicos é especialmente perigosa para pacientes imunocomprometidos e aqueles submetidos à quimioterapia anti-câncer ou terapia após o transplante de órgãos (Khameneh et al., 2010). Patógenos oportunistas tais como bactérias, vírus e fungos podem invadir diferentes tecidos e causar infecções sistêmicas, que são considerados uma ameaça à vida do paciente (Cutler, 2007). Além disso, as doenças infecciosas causadas por micro-organismos resistentes a antibióticos têm contribuído para tornar a situação ainda pior, principalmente para aqueles pacientes cujo tratamento com medicamentos disponíveis atualmente tornou-se menos eficiente (Foubister, 2003; Carrillo-Munoz et al., 2006).
Devido a todos esses fatos, peptídeos com múltiplas atividades têm sido extremamente atraente para o controle eficiente dos episódios naturais de resistência em micro-organismos, principalmente porque eles mostram baixos efeitos tóxicos em células de mamíferos (Hilpert et al., 2005). Estas moléculas podem ser obtidas a partir de uma ampla variedade de fontes, incluindo micro-organismos, plantas, anfíbios, insetos, moluscos e peixes, que apresentam um amplo espectro de atividade (Bechinger, 2010). No presente trabalho, avaliamos dentro de uma série de peptídeos ricos em alaninas, alguns candidatos desenhados a partir dos motivos anticongelantes observados em AFPs isolados do peixe polar, P. americanus, o qual apresenta motivos anticongelantes repetidos (X11T, onde X representa qualquer aminoácido com maior probabilidade de ser alanina), como descrito e caracterizado anteriormente por Holmberg e
126
colaboradores (Holmberg, Lilius e Bulow, 1994). De acordo com o proposto, os resultados obtidos permitiram verificar múltiplas atividades deletérias para bactérias, fungos, vírus e células cancerosas e, por outro lado, também foi possível observar modificações na geometria do gelo em alguns peptídeos da primeira e segunda geração originados a partir destes motivos anticongelantes. As múltiplas atividades antimicrobianas já foram bem caracterizadas na literatura sendo observada em diversas classes de peptídeos. Uma das classes de peptídeos multifuncionais são as defensinas, que são pequenos peptídeos básicos ricos em cisteína encontrados em numerosos organismos, incluindo plantas, fungos e seres humanos. As defensinas são normalmente ativas contra um amplo espectro de organismos, tais como bactérias Gram-positivas e -negativas, vírus, fungos e nematóides (Pelegrini e Franco, 2005). Além desta, outra classe de peptídeos antimicrobianos é destaque, como os ciclótideos, peptídeos cíclicos amplamente estudados e isolados de plantas os quais apresentam numerosas atividades, incluindo antimicrobiana, citotóxica inseticida, uterotônica, antiviral, e em alguns casos os integrantes desta família demonstram atividade hemolítica e anti-helmíntica (Pinto et al., 2012). Recentemente, um peptídeo isolado da planta Cocos nucifera, chamado Cn-AMP1, também foi caracterizado como um peptídeo multifuncional o qual apresenta funções antibacteriana, antifúngica, anti-tumoral e a atividade imunomodulatória (Mandal et al., 2009; Silva et al., 2012). Peptídeos de origem animal como a magainina (Xenopus laevis), mastoporano (Vespa simillima), fowlicidina (Gallus gallus) e LL-37 (Homo sapiens) também demonstraram múltiplas funções, incluindo antimicrobiana, anticancerígena, antiviral, inseticida e hemolítica caracterizando-os como peptídeos multifuncionais (Zasloff, Martin e Chen, 1988; Yi e Li, 2010; Baek et al., 2011; Lee et al., 2011). Além disso, os peptídeos antimicrobianos isolados de peixes teleósteos têm sido associados à
atividades multifuncionais. Entre eles podem ser citados pardaxina (Pardachirus marmoratus), a hepcidina (Oreochromis mossambicus), epinecidina (Epinephelus coioides), piscidina (Morone chrysops), misgurina (Misgurnus anguillicaudatus), peptídeos do NRC (Pleuronectes americanus), myxinidina (Myxine glutinosa) e CodCath (Gadus morhua) os quais já foram bem caracterizados na literatura com múltiplas atividades contra bactérias, fungos e vírus (Park et al., 1997; Douglas et al., 2003; Subramanian, Ross e Mackinnon, 2009; Vad et al., 2010; Broekman et al., 2011; Chang et al., 2011; Lee et al., 2011).
Em primeiro lugar, para demonstrar os múltiplos efeitos do peptídeo estudado, Pa-MAP, ele foi testado contra vários agentes patogênicos infecciosos. A maioria das atividades bactericidas é relacionada na literatura com resíduos catiônicos (Franco, 2011; Mandal et al., 2012). Apesar do fato dos resíduos de arginina e lisina catiônicos demonstrarem um papel importante para a atividade antimicrobiana, Pa-MAP é desprovido de tais resíduos, apresentando principalmente resíduos de aminoácidos hidrofóbicos com uma histidina e um resíduo de ácido aspártico localizado na região N-terminal amidada. Para investigar se a cadeia lateral deste resíduo His1 pode ser protonado a pH 7,0, o pH ao qual foram realizados ensaios antimicrobianos, o seu valor pKa foi determinada por titulação potenciométrica e mostrou ser 6,0, de acordo com o valor esperado para o aminoácido livre ou para as cadeias laterais de histidina expostas à água. Isto indica que a atividade antimicrobiana pode ser impulsionada principalmente por interações hidrofóbicas. Resultado similar também foi observado por Fernandes e colaboradores, os quais desenvolveram um programa para predição de potenciais peptídeos antimicrobianos utilizando redes neurais. Neste trabalho os autores concluem que a taxa de hidrofobicidade (fator de agregação), analisada pelo programa TANGO, é o parâmetro físico-
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químico que melhor determina a predição de peptídeos antimicrobianos (Fernandes, Rigden e Franco, 2012). Além disso, a Pa-MAP mostrou uma maior atividade em relação a bactéria Gram- negativa (MIC = 30 μM para espécie E. coli) em comparação com bactéria Gram-positiva (MIC > 115 μM para espécie S. aureus). Em adição os peptídeos da primeira e segunda geração também foram avaliados contra as espécies S. aureus e E. coli. Os peptídeos da primeira geração Pa-MAP 1.2, Pa-MAP 1.3 e Pa-MAP 1.4 não apresentaram eficiência na inibição do desenvolvimento destas bactérias e somente o Pa-MAP 1.2 apresentou atividade por volta de 30 % de inibição contra a espécie E. coli com uma concentração de 107μM. Em contraste, após os resultados obtidos para os peptídeos da primeira geração um redesenho foi proposto com o objetivo de aumentar a eficiência (potencializar a ação) dos motivos anticongelantes contra microorganismos patogênicos e na segunda geração foi possível detectar que os peptídeos Pa- MAP 1.5 e Pa-MAP 1.9 demonstraram MIC com valores de 3,2 e 6,0 μM, estes valores podem ser explicados devido a dois fatores: ao aumento do conteúdo de lisina (aumento das interações eletrostáticas, o primeiro contato), demonstrados nos peptídeos com cargas de +6 e +4, e manutenção da alta taxa de hidrofobicidade observada em AFPs, com 78 e 64 % já que os peptídeos da primeira geração como Pa-MAP apresenta taxa de hidrofobicidade em torno de 70%. Estes fatores podem determinar a estabilização do peptídeo no interior da membrana das bactérias Gram-negativas (o segundo contato: ancoragem). Além destas avaliações os peptídeos da segunda geração Pa-MAP 1.6, Pa-MAP 1.7 e Pa-MAP 1.8 apresentaram efeitos deletérios no desenvolvimento do crescimento bacteriano da espécie E. coli com atividades por volta de 20 a 60% nas concentrações máximas utilizadas de 120, 96, 98 μM e somente o Pa-MAP 2.0 não demonstrou atividade antibacteriana. Uma explicação para a falta de atividade para estes
peptídeos pode estar relacionada com a conformação tridimensional, a qual provavelmente favoreceu a formação de uma α-hélice não anfipática, as estruturas demonstraram que os resíduos carregados positivamente (lisina) estão posicionados entre os resíduos hidrofóbicos como leucina e treonina, provavelmente bloqueando o primeiro contato guiado por interações eletrostáticas.
Pa-MAP também mostrou atividade deletéria contra micélio e levedura fungos pertencentes ao filo Ascomycota. Com este peptídeo amidado, os resíduos de aminoácidos polares Thr2, Ser4, Asp5, Thr13, Asn16 e Ser24 criam um ambiente polar para a interação com as membranas do fungo. Composições similares foram observadas em um peptídeo a partir de frutos antifúngico Trapa natans com efeitos inibitórios sobre a espécie Candida tropicalis na formação de biofilme (Mandal et al., 2011). Além disso, os nossos resultados são semelhantes aos encontrados para os peptídeos antifúngicos depositados no antimicrobial database (APD), que demonstrou uma faixa de índice GRAVY de -0,900 a 1,505 (Fehlbaum et al., 1996; Lee et al., 2005) reforçando a ideia de que as interações hidrofóbicas promovidas pelos múltiplos resíduos de alanina e por Met24 são responsáveis para o segundo passo da interação com a desestabilização do esqueleto de carbono dos lipídeos da membrana celular destes micro-organismos.
Pa-MAP também apresentou atividade antiviral. Isto foi possivelmente observado devido à presença de resíduos de aminoácidos hidrofóbicos, que podem interagir com o envelope viral, e também com os fosfolipídios encontrados na superfície viral dando início ao segundo contato de ancoragem (Chang, Griesgraber e Wagner, 2001; Lee et al., 2004). Descrições anteriores mostraram vários peptídeos antivirais que apresentaram atividade diretamente proporcional em relação à proporção hidrofóbico, o que sugere que os resíduos hidrofóbicos e aromáticos também são importantes para a atividade antiviral. Lee e colaboradores (Lee et al., 2004) relataram que o
130
aumento da relação hidrofóbico para magaínina-cecropina A-2 análogo dos peptídeos híbridos causou um aumento significante na atividade inibitória sobre células virais de HIV-1.
Outra preocupação importante para caracterização de peptídeos na aplicação farmacêutica consiste em avaliar as atividades prejudiciais para as células de mamíferos e a células eucarióticas proveniente de linhagens de células tumorais. Estes desafios podem ser feitos de duas formas diferentes: uma contra células saudáveis para sondar a segurança e toxicidade do peptídeo e outra contra células de tumor para o desenvolvimento de fármacos anticancerígenos. Pa-MAP mostrou clara atividade para diferentes linhas de células de tumor em cultura, assim como os peptídeos da primeira geração Pa-MAP 1.2, Pa-MAP 1.3 e Pa-MAP 1.4 e o único peptídeo testado da segunda geração Pa-MAP 2.0. A hipótese tanto da atividade antitumoral como as atividades antivirais para Pa-MAP, pode estar relacionado com a maior razão de hidrofobicidade (73%) encontrada neste peptídeo e à presença de Thr2, Leu12, Thr13 e Met25 reforçam a ideia desta hipótese. Outro ponto que ajuda a reforçar esta hipótese são as presenças dos mesmos resíduos nos peptídeos da primeira geração que também apresentaram atividades, tais como os resíduos do Pa-MAP 1.2 nas posições Thr3, Thr6, Thr14, Val15, Thr16, Leu24 e Thr25; do Pa-MAP 1.3 nas posições Leu8, Thr9, Leu17, Thr18, Leu26 e Thr27; do Pa-MAP 1.4 nas posições Thr9, Thr18 e Thr27 e do Pa-MAP 2.0 nas posições Thr1, Thr10, Thr19 e Thr28. Estes resíduos foram comumente também encontrados em peptídeos anticancerígenos, como observado para pardaxina 1, a partir de um peptídeo multifuncional isolado de Pardachirus marmoratus, e em um peptídeo promíscuo isolado de Epinephelus coioides (Pan et al., 2007). Outro estudo recente demonstrou que a atividade antitumoral foi melhorada com o aumento da hidrofobicidade para o peptídeo derivado a partir de uma pequena proteína de replicação (Repa) da espécie E. coli
o qual apresentou comprimento de 26 resíduos de aminoácidos e uma estrutura em α-hélice (Zhang et al., 1998; Huang et al., 2012). Uma análise mais detalhada de hidropaticidade realizada por meio do índice GRAVY (Wilkins et al., 1999) foi possível verificar que os peptídeos