Atividade Antimicrobiana

A concentração efetiva responsável pela inibição de 50% do crescimento da E.coli (CE50) na solução padrão foi comparada com as soluções submetidas aos processos de degradação, num período de exposição de 8 horas das bactérias às soluções.

A CE50 foi determinada pela exposição de soluções de lomefloxacina na faixa de 61,04 10-2 μg L-1 a 0,625 mg L-1 à E. coli em 8 h.Os valores de CE50 obtidos estiveram na faixa de 9,527 a 10,60 μg L-1, sendo o valor médio de 10,05 μg L-1, considerado como a CE50 da lomefloxacina para E.coli, com intervalo de confiança de 95%.

Estudos referentes a inibição do crescimento de E. coli demonstraram que concentrações de 1 a 10 μg L-1 de FQ já são capazes de inibir o crescimento microbiano (HE et al. 2014). Comparando o CE50 de outras FQ como ofloxacina: 8,22 μg L-1 (PERES et al. 2014) e da flumequina: 1,465 μg L-1 (RODRIGUES et al. 2013) com o da LOM (10,05 μg L-1), verifica-se que todos se encontram na faixa de concentração sugerida por He et al. 2014 capaz de inibir o crescimento da E.coli. Porém, conclui-se que a LOM apresenta maior CE50, sugerindo menor eficiência desta FQ para inibir a E.coli, ou seja, apresenta menor atividade antimicrobiana que essas outras fluoroquinolonas (ofloxacina e flumequina).

Mudança nos valores de CE50 das amostras submetidas aos processos de degradação foram avaliadas pelo cálculo do valor potencial equivalente, de acordo com a Equação 12:

𝑃𝐸𝑄 =

𝐶𝐸_50,𝑡 (Equação 12)

sendo PEQ o valor potencial equivalente, CE50,0 representa a concentração efetiva da amostra controle (0 minuto) e CE50,t representa a concentração efetiva da amostra submetida aos processos de degradação.

A redução da atividade antimicrobiana (A.A.) foi calculada pela Equação 13.

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Na peroxidação, em todas as concentrações de H2O2 avaliadas (CH2O2 = 0,335; 1,675 e 6,77 mmol L-1), a redução da A.A. não foi maior que 5%. No processo fotolítico, foi observada redução máxima de 89,3% da A.A. no maior tempo de ensaio (60 min) sob dose de radiação de 5267 mJ cm-2.

No POA-UV/H2O2, as maiores porcentagens de redução de A.A. também foram observadas no tempo de ensaio de 60 minutos, sendo: CH2O2 = 0,335 mmol L-1, redução de 91,5%, CH2O2 = 0,677 mmol L-1, 94,2%; CH2O2 = 1,675 mmol L-1, 95,9% e CH2O2 = 6,77 mmol L- 1

de 96,3%.

Comparou-se a degradação de LOM com a redução da A.A., nos tempos de 10 e 60 min para todos os processos fotolítico, peroxidação e peroxidação assistida por UV. O POA (UV/H2O2 - CH2O2 = 6,77 mmol L-1) apresentou a maior redução da atividade antimicrobiana, em 10 e 60 min, sendo de 66,7% e 96,7%, respectivamente, enquanto que somente o processo fotolítico apresentou uma redução de 36,6% e 89,3% (Tabela 19). Este fato pode ser justificado pela adição de peróxido de hidrogênio na solução submetida à radiação UV-C, formando radicais hidroxila que apresentam um grande potencial de redução e não são seletivos, oxidando a molécula de lomefloxacina em vários sítios.

Tabela 19. Comparação da degradação e da redução da atividade antimicrobiana nos processos de fotólise, peroxidação (CH2O2 =1,675 mmol L-1) e UV/H2O2 (CH2O2 = 6,7 10-2; 3,35 10-1; 6,7 10-1, 1,675 e 6,7 mmol L-1).

Processos Degradação (%) (10 minutos) Redução da atividade antimicrobiana (%) (10 minutos) Degradação (%) (60 minutos) Redução da atividade antimicrobiana (%) (60 minutos) Fotólise 58,4 ± 0,082 36,6 95,7 ± 0,017 89,3 UV/H2O2 (0,335 mmol L-1) 75,3 ± 0,026 50,3 97,6 ± 0,017 91,5 UV/H2O2 (0,677 mmol L-1) 61,1 ± 0,037 45,1 95,8 ± 0,06 94,2 UV/H2O2 (1,675 mmol L-1) 54,7 ± 0,098 49,8 96,5 ± 0,012 95,9 UV/H2O2 (6,77 mmol L-1) 66,6 ± 0,070 66,7 96,9 ± 0,01 96,3 H2O2 (1,675 mmol L-1) 2,4 ± 0,012 2,7 13 ± 0,058 2,05

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A total degradação e a completa remoção da atividade antimicrobiana da LOM não foi observada nos processos avaliados, mesmo após 60 min de ensaio e com a maior concentração de peróxido de hidrogênio.

Na Figura 23 observa-se as curvas dose-resposta obtida durante os processos de fotólise, peroxidação (CH2O2= 1,675 mmol L-1) e UV/H2O2 (CH2O2 = 0,335; 0,677; 1,675 e 6,77 mmol L-1). O deslocamento da curva das amostras para a direita da curva de controle (solução padrão) indica redução da atividade antimicrobiana. Isso significa que o CE50 das soluções submetidas aos processos de degradação é maior ao CE50 da solução padrão.

Figura 23. Curvas dose-resposta obtidas durante a degradação da lomefloxacina por fotólise, peroxidação (CH2O2 =1,675 mmol L-1) e UV/H2O2 (CH2O2 = 0,335; 0,677; 1,675 e 6,77 mmol L-1).

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Na Figura 24, foi correlacionado o valor de PEQ vs. a relação C/C0 a fim de avaliar a relação entre a degradação e a redução de A.A.. Para isso, foram escolhidos o processo fotolítico, onde não há formação de radicais hidroxila, e o POA (UV/H2O2 - CH2O2 = 6,77 mmol L-1), no qual foram verificadas as maiores reduções de A.A..

A redução da A.A. da solução de LOM submetida a degradação comportou-se de forma proporcionalmente direta com a diminuição da concentração da LOM devido à degradação promovida pelo processo aplicado. Nas Figuras 24 e 26 são apresentados os gráficos que correlacionam o decréscimo da concentração da LOM e a remoção da sua A.A, onde é proposto uma relação diretamente proporcional entre concentração do composto original e a A.A., sem levar em consideração o efeito dos intermediários formados (linha ideal linear). Quando a mólecula de LOM não é degradada (C/C0 = 1), sugere-se que a sua atividade antimicrobiana seja máxima, no caso, caracterizado pelo termo PEQ (CE50,0/CE50,t = 1), e a mínima concentração (C/C0 = 0), corresponde a máxima redução da A.A (PEQ = 0).

Figura 24. Correlação entre a concentração residual de lomefloxacina e o PEQ das soluções submetidas à fotólise e UV/H2O2 (CH2O2 = 6,77 mmol L-1).

A correlação observada nos dois processos (UV e UV/H2O2 – CH2O2 = 6,77 mmol L-1; r = 0,980 e 0,982, respectivamente) foram semelhantes, apresentando correlação entre a

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eficiência de degradação e a redução de A.A.. Os valores acima da reta linear representam que a concentração de LOM teve um maior decréscimo do que a remoção da A.A.

Foram obtidas também as curvas dose-resposta para todos os processos de ozonização (t = 0, 1, 2, 3, 4, 6, 8 e 9 min) em pH 3, 7 e 11 (Figura 25). No tempo de 9 min, em todos os valores de pH, observou-se maior deslocamento da curva para a direta, indicando maior perda da atividade antimicrobiana. Porém, nenhum dos processos foi capaz de remover totalmente a atividade antimicrobiana do LOM, mesmo com altas dosagens de ozônio.

Figura 25. Curvas dose-resposta obtidas durante a degradação da lomefloxacina por ozonização em diferentes doses de O3 e em diferentes valores de pH (3, 7 e 11).

Na ozonização foram observadas diferenças na redução da atividade antimicrobiana nos diferentes valores de pH, como pode ser observado na Tabela 20. A maior redução de A.A. foi verificada no maior tempo de ozonização (t = 9 min), sugerindo uma correlação entre essa redução e a degradação do fármaco.

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Tabela 20. Comparação da degradação e da redução da atividade antimicrobiana da ozonização em diferentes valores de pH (3, 7 e 11).

Processos Tempo de ozonização (min)

1 2 3 4 6 8 9 pH 3 Degradação (%) 49 50,2 55,0 57,9 66,4 73,8 80,4 Redução da A.A (%) 56,20 46,70 78,63 76,36 87,62 87,76 89,17 pH 7 Degradação (%) 22,8 33,0 38,7 51,5 57,2 56,7 74,3 Redução da A.A (%) 41,77 52,81 75,74 66,51 77,21 86,84 92,08 pH 11 Degradação (%) 24,4 47,0 52,5 62,4 80,8 88,5 93,0 Redução da A.A. (%) 37,99 42,25 63,60 68,45 89,46 90,82 94,97

A correlação em todos os ensaios de ozonização avaliados pode ser observada na Figura 26. De acordo com a distribuição dos pontos, observa-se que o ensaio em pH 11 corresponde a uma melhor correlação entre a degradação e a redução de A.A. (r = 0,982), por os pontos se comportarem próximos a reta linear ideal entre estes dois parâmetros. Para a ozonização em solução pH 3 e pH 7, os coeficientes de correlação (r) são: 0,960 e 0,948 e os pontos encontram- se mais dispersos à linha linear ideal.

Figura 26. Correlação entre a concentração residual de lomefloxacina e a PEQ das soluções submetidas à ozonização em pH 3, 7 e 11.

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A redução da A.A. das soluções de LOM submetidas aos processos de degradação está relacionada com a atuação dos oxidantes nos sítios da molécula de LOM que são responsáveis pela sua atividade antimicrobiana (Figura 27).

Figura 27 – Sítios de atuação da atividade antimicrobiana da LOM.

A redução da atividade antimicrobiana das fluoroquinolonas está ligada às alterações nos sítios da mólecula da quinolona, onde haveria a formação de ligações de hidrogênio entre os grupos receptores (-COOH, -C=O e -F) com o DNA-girase das bactérias, resultando na inibição da duplicação dos micro-organismos (SORTINO et al. 1998). O DNA-girase é uma enzima que ao ser inibida, provoca uma síntese descontrolada de RNA mensageiro e de proteínas, o que determina a morte das bactérias (RODRIGUES-SILVA et al. 2014; DODD et al. 2006; SHEN et al. 1989).

Portanto, pode-se justificar a maior redução da A.A. das fluoroquinolonas devido às alterações nos sítios da mólecula da quinolona (-COOH, -C=O e -F) responsáveis pela sua atividade antimicrobiana, provavelmente devido a ação não seletiva dos radicais hidroxila (Figura 3).

Observa-se também que durante todos os processos de degradação não houve aumento da atividade antimicrobiana quando comparado ao composto original, já que as curvas se apresentam a direita da amostra controle, indicando perda da atividade antimicrobiana.

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A redução da A.A. da lomefloxacina pelo processo oxidativo avançado corrobora com os estudos de PERES et al. 2014; RODRIGUES-SILVA et al. 2013b; DA SILVA et al. 2011; DODD et al. 2009 e PAUL et al. 2010 que também observaram redução da A.A. nas soluções de fluoroquinolonas submetidas aos POA.

5.5. Toxicidade aguda

A avaliação de testes de toxicidade aguda com a bactéria luminescente V. fischeri foi feita comparando as toxicidades das soluções iniciais (500 µg L-1; t = 0 min) e as soluções submetidas aos processos de degradação durante todo o período de ensaio.

Para determinar o CE50 da LOM em 15 minutos de ensaio, foi avaliada a concentração de 20 mg L-1, porém não foi observada nenhuma inibição. Esse fato já foi constatado por Backhaus et al. (2000), que também não observaram toxicidade à V. fischeri expostas à solução de quinolonas em um curto período de tempo. Portanto, conclui-se que as soluções iniciais de LOM (500 µg L-1) por serem concentrações bem mais baixas, também não apresentem toxicidade à V. fischeri quando expostas neste curto período.

Para a fotólise, observou-se inibição de luminescência em 34% no tempo de 60 min de ensaio (Figura 28). Comparando com a amostra inicial (t = 0 min), a toxicidade aumentou 22%, sugerindo a formação de intermediários de degradação mais tóxicos do que a LOM.

Figura 28. Inibição da luminescência da bactéria Vibrio fischeri durante o processo de fotólise.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 5 10 15 30 60 % Inib içã o Tempo (minutos) Fotólise

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É importante ressaltar que nos processos de peroxidação e no UV/H2O2, as soluções iniciais continham 500 µg L-1 LOM e também as concentrações iniciais de peróxido de hidrogênio (0,335 a 6,77 mmol L-1). Como este oxidante é tóxico para a bactéria V. fischeri, soluções de H2O2 (0 a 7 mmol L-1) também foram avaliadas usando o Microtox®.

A inibição da luminescência da bacteria foi diretamente proporcional à concentração de H2O2. Foi verificada uma correlação linear (r = 0,9942) para as concentrações do oxidante na faixa de 0 a 2,5 mmol L-1. Concentrações de H2O2 maiores que 2,5 mmol L-1 resultaram em uma inibição maior que 90%; indicando que este oxidante é tóxico em altas concentrações para os organismos testes utilizados (Figura 29). Por esta razão, plotou-se a concentração do residual de H2O2 e grau de inibição nos gráficos de peroxidação e UV/H2O2.

Figura 29. Inibição da luminescência da bactéria Vibrio fischeri pelo H2O2 (CH2O2 = 0 a 7 mmol L-1).

A toxicidade no processo de peroxidação não variou, devido ao baixo consumo do oxidante neste processo. Salienta-se que a toxicidade apresentada na Figura 30 possa estar relacionada ao residual do oxidante (44% de inibição), já que a degradação foi ineficaz (20% em 60 min de reação), não podendo ser sugerida a relação da toxicidade com a formação de intermediários. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 1 2 3 4 5 6 7 Inib içã o ( %) Concentração de H2O2 (mmol L-1)

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Figura 30. Inibição da luminescência bactéria Vibrio fischeri durante o processo de peroxidação (CH2O2 = 1,675 mmol L-1).

A inibição das soluções iniciais avaliadas nos processos UV/H2O2 está relacionada com a concentração de H2O2, já que a LOM não apresenta alta toxicidade (Figura 31). A inibição inicial foi de 2%, 76% e 95% para as soluções de peróxido de hidrogênio de 0,335 mmol L-1; 1,675 mmol L-1 e; 6,77 mmol L-1, respectivamente.

A inibição da luminescência no processo UV/H2O2, com a concentração de H2O2 = 0,335 mmol L-1, aumentou conforme o consumo do oxiidante durante o ensaio. Houve um consumo de aproximadamente 50% de H2O2, no entanto, a toxicidade aumentou, indicando a formação de intermediários mais tóxicos do que o composto original (Figura 31A).

Para o UV/H2O2 com 1,675 mmol L-1 H2O2, observou-se que a toxicidade diminuiu em 5 min, sendo esta redução proporcional ao consumo de peróxido. Entretanto, de 10 até 60 min de ensaio, a toxicidade aumentou, sugerindo a formação de intermediários tóxicos (Figura 31B). Neste caso, a toxicidade não pode ser diretamente relacionada ao residual do oxidante.

Para o UV/H2O2 com 6,77 mmol L-1 de H2O2 (Figura 31C), a inibição da luminescência pode ser relacionada tanto ao residual do oxidante como também à formação de intermediários mais tóxicos do que a LOM.

0 1 2 3 4 5 6 7 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 5 10 15 30 60 Resid ua l de peró x ido de hid ro g ênio (m m o l L -1) I nib içã o (%) Tempo (minutos) Inibição Residual

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Figura 31. Inibição da luminescência bactéria Vibrio fischeri durante o processo de UV/H2O2 (CH2O2 = (A) 0,335; (B) 1,675 e (C) 6,77 mmol L-1).

Diluições das amostras do processo UV/H2O2 - CH2O2 = 6,67 mmol L-1 também foram avaliadas, no entanto, não observou-se diferenças na porcentagem de inibição, sugerindo que a toxicidade esteja relacionada à formação de intermediários, já que há um consumo progressivo do oxidante ao longo do tempo.

Para a ozonização em diferentes valores de pH também foi realizado o teste de toxicidade aguda, seguindo o mesmo procedimento, ressaltando que, após a ozonização, o valor do pH foi ajustado entre 6 e 8 para que este parâmetro não influenciasse na avaliação da inibição da bactéria V. fischeri. As porcentagens de inibição pelo tempo de ozonização estão apresentadas na Figura 32.

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Figura 32. Inibição da luminescência bactéria Vibrio fischeri durante a ozonização da LOM em diferentes valores de pH.

As menores porcentagens de inibição foram observadas em pH 3, sugerindo a não formação de intermediários tóxicos, o oposto pode ser observado nos pH 7 e 11. As maiores porcentagens de inibição apresentadas nos pH 7 e 11, sugerem que os radicais hidroxila que reagem com a molécula de LOM, formando intermediários capazes de interagir com as bactérias, provocando sua inibição. Inclusive o potencial dos possíveis intermediários mais tóxicos vai aumentando com o tempo de ozonização. Pode estar havendo o aumento da concentração de alguns deles ou mesmo a formação de muitos outros em menores concentrações, porém com efeito sinérgico.

Foram analisados também os CE50 dos tempos de ozonização de 6, 8 e 9 min, para o pH 7 e, 8 e 9 min para o pH 11, devido a inibição ser maior que 50% e, podendo assim, ser estabelecida a CE50 (%) para estas condições analisadas. Vale ressaltar que as CE50 são apresentadas na unidade de porcentagem, referentes à porcentagem da solução utilizada no teste de toxicidade (Ci = 81,9%), já que não há como estabelecer CE50 em unidade de concentração, pois a solução de 500 µg L-1 de LOM não apresenta toxicidade.

Verificou-se as seguintes CE50(%): 71,29; 57,44 e 54,59 para as amostras em 6, 8 e 9 min no pH 7, e para as amostras em 8 e 9 min em pH 11, 45,96 e 35,72, respectivamente. A diminuição da porcentagem da concentração efetiva por inibir 50% das bactérias, ressalva que as amostras que apresentaram maior degradação também apresentaram maior toxicidade. Esse fato pode ser relacionado com o surgimento de intermediários de degradação mais tóxicos do que a LOM. 0 20 40 60 80 100 0 1 2 3 4 6 8 9 Inib içã o ( %)

Tempo de ozonização (minutos)

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Após ozonização, principalmente do anel piperazina, podem ser gerados compostos que

contenham nitrogênio orgânico os quais podem apresentar elevada toxicidade

(CALAMARI et al. 1980). Este mesmo fato foi investigado por Hamdi El Najjar et al. (2013), que também verificaram acréscimo na toxicidade da FQ de terceira geração, a levofloxacina

(Cinicial= 1 g L-1) mesmo após 90 minutos de ozonização (CO3= 540 mg) em pH 7,2, sugerindo a

formação de intermediários mais tóxicos e também mais resistentes à oxidação pelos radicais hidroxilas formados (pH 7 e 11) como também pelo ataque do ozônio molecular (pH 7).

Calza et al. (2008) e Vasquez et al. (2013) também sugeriram que o aumento da inibição da luminescência durante tratamento fotocatalítico (POA) da ofloxacina (FQ), foi devido aos intermediários formados, provavelmente dos derivados da lise do anel piperazina e outros produtos de degradação. Esse fato destacou a preocupação com a geração de produtos secundários com novos efeitos biológicos indesejados (SONNTANG; VON GUNTEN, 2012).

5.6. Identificação de intermediários

A identificação dos intermediários de degradação torna-se importante para a elucidação dos mecanismos de degradação, no esclarecimento da variação da toxicidade da solução ao longo dos ensaios, além disso, entender como ocorre a evolução da atividade antimicrobiana das soluções de LOM submetidas aos processos de degradação.

5.6.1. Fotólise e UV/H2O2

A técnica de espectrometria de massas por infusão direta, incluindo a técnica MS/MS, foi realizada para as amostras submetidas aos processos de fotólise e UV/H2O2 no modo ESI+. Foram observados diferentes sinais nos dois processos, sugerindo a formação de diferentes intermediários de degradação (Figura 33).

É importante ressaltar que mesmo após 60 minutos de ensaio, o sinal da LOM (m/z = 352) ainda é presente, mesmo em baixa intensidade, indicando que não há completa degradação do antimicrobiano, conforme já observado anteriormente por HPLC.

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Figura 33. Espectro de massas obtido para (A) fotólise e para o processo (B) UV/H2O2 (6,77 mmol L-1).

Para efeito de elucidação de algumas etapas de degradação da LOM, dentre todos os compostos identificados nos espectros de massa, foi proposto o estudo dos seguintes intermediários formados com m/z 332, 336, 348, 350, 364, 372, 380 e 386 (Tabela 21).

Os intermediários m/z 332, 336, 350, 364 e 372 foram identificados durante a fotólise, enquanto os intermediários m/z 332, 348, 350, 364, 372 e 380 foram identificados no processo UV/H2O2. Portanto, os intermediários formados dependeram do processo de degradação empregado, sendo aplicados dois processos com diferentes características; um deles físico (fotólise) e o outro um processo oxidativo avançado, com a formação dos radicais hidroxila. Salienta-se também que alguns destes produtos de degradação já foram observados por Ou (2000), que realizou a fotólise da LOM em 360 nm.

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Tabela 21. Estruturas dos intermediários identificados na fotólise e UV/H2O2.

Estrutura proposta (m/z) Fórmula molecular

Processos Fotólise UV/H2O2 332 C17H18FN3O3   336 C16H18FN3O4  348 C17H18FN3O2 350 C17H20FN3O4   364 C15H10FN3O7   372 C15H18FN3O7   380 C16H14FN3O7  386 C16H20FN3O7  

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Estudos de Albini e Monti (2003), Ou (2000) e Fasani et al. (1997), sugerem que as fluoroquinolonas sofram a perda do átomo de halogênio na posição C8, sendo, no caso da lomefloxacina, o flúor, seguida da eliminação do grupo carboxila, na posição C3, quando expostos a radiação UV. Portanto, para a maioria dos intermediários identificados, sugeriu-se a perda do íon fluoreto (C8) como principal reação.

Para os intermediários m/z 386 e 372 foram sugeridos após a perda do íon fluoreto (C8), a inserção do grupo hidroxila e ataques sucessivos no anel piperazina, possibilitando a abertura do anel e inserção de grupos hidroxilas. Para o m/z 380 também foi proposta a perda do íon fluoreto com inserção do grupo hidroxila e, apesar dos ataques sucessivos no anel piperazínico, não ocorreu sua lise. O m/z 336 pode ser formado pela perda do íon fluoreto (C8), seguida da lise do anel piperazínico e para o m/z 350 sugeriu-se a perda do íon fluoreto (C8) seguido por uma hidroxilação.

Como sugestão do m/z 332 sugeriu-se a perda do íon fluoreto, o que causa a instabilidade da molécula, seguida pela inserção de uma ligação C–H2, permitindo o fechamento do anel. Já o intermediário m/z 364 é formado pela perda do íon fluoreto (C8) com inserção do oxigênio seguido pela formação de um sexto membro entre o O e o grupo N-etil ataques sucessivos no anel piperazina,com inserção de grupo hidroxila e átomos de oxigênio. Finalmente, para o m/z 348 sugeriu-se a perda do íon fluoreto (C8), seguido pela formação de um sexto membro entre o O e o grupo N-etil.

No entanto, a perda do grupo carboxila (-COOH), sugerida por Albini e Monti (2003), Ou (2000) e Fasani et al. (1997), não foi observda nos intermediários identificados, sendo encontrado em todas estruturas propostas. A presença do grupo carboxila, conforme já discutido no item 5.4., seugre também a presença da atividade antimicrobiana da LOM. Portanto, a redução da atividade antimicrobiana verificada nos processos fotolítico e UV/H2O2, pode ser justificada além da redução da concentração de LOM, também pela perda do íon fluoreto e da lise do grupo piperazinico, responsáveis também pela ação do antimicrobiano (RODRIGUES- SILVA et al. 2014 e SHEN et al. 1989).

80

5.6.2. Ozonização

As reações oxidativas e oxidativas avançadas com ozônio dependem do pH do meio (como descrito no tópico 3.5.2). O pH da solução influência diretamente a ionização/especiação da LOM, bem como o caminho proposto de degradação dessa molécula, tornando imprescindível a avaliação dos pKa da molécula antes da realização dos estudos de degradação

Em solução pH 3, a LOM apresenta-se protonada no anel piperazínico (pKa1 5,6) ligado ao C-7 do anel quinolona. Além disso, é importante ressaltar que o ataque na molécula a ser degradada, deve ocorrer principalmente pelo ozônio molecular, uma vez que nessa faixa de pH não espera-se a formação dos radicais hidroxila em altas concentrações. Quando em solução com pH 11, a LOM apresentará sua forma desprotonada, no grupo carboxílico ligado na posição C-3 do anel quinolona (pKa2 8,7), e, visto a formação de radicais hidroxila, a oxidação da molécula deve ocorrer principalmente pelo POA.

O ataque do ozônio é esperado, principalmente, nos grupos com compostos aromáticos, atacando o anel e ocasionando na sua abertura (GOTTSCHALK et al. 2002). VON GUNTEN (2003) ressalta em seus estudos que a oxidação por ozônio ocorre em grupos reativos como os compostos que possuem grupo amina, anel aromático ou dupla ligação.

Liu et al. (2012) estudaram a ozonização de algumas FQ (ciprofloxacina, norfloxacina e lomefloxacina) em pH 10, e propuseram que o ataque do ozônio molecular é feito no anel piperazínico e o ataque inicial dos radicais hidroxila no anel quinolona, atacando a dupla ligação do anel na posição C2 e C3, promovendo sua quebra, seguido da descarboxilação ou inserção de átomos de oxigênio ou grupos hidroxila.

As estruturas dos produtos de degradação apresentados nesse trabalho foram propostas baseando-se nos espectros de massa, composição elementar da lomefloxacina e mecanismos de reações disponíveis na literatura especializada (MENG et al. 2015; LIU et al. 2014; DORIVAL-GARCIA et al. 2013; HAMDI EL NAJJAR et al. 2013; HUBICKA et al. 2013; ZHAN et al. 2013; LIU et al. 2012; XIAO et al. 2012; DE WITTE et al. 2009; NAGESWARA RAO et al. 2008; DODD et al. 2006; NAKATA et al. 2005; VON GUNTEN, 2003).

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Com base nos caminhos de degradação propostos na literatura para a LOM (OLIVEIRA et

al. 2015; LIU et al. 2012; OU, 2003) e de outras FQ por ozonização (HAMDI EL NAJJAR et al.

2013; DE WITTE et al. 2009; DODD et al. 2006) pôde-se sugerir alguns produtos de degradação identificados nas soluções de lomefloxacina submetidas à ozonização nos pH 3, 7 e 11, nos tempos de reação: 1, 6 e 9 min. Nas Figuras a seguir são apresentados exemplos dos espectros de massas das soluções de lomefloxacina submetidas a degradação por ozonização em pH 3 (Figura 34), pH próximo do neutro (Figura 35) e pH 11 (Figura 36).

Figura 34. Espectro de massas obtido para a ozonização em pH 3.

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Figura 36. Espectro de massas obtido para a ozonização em pH 11.

É importante ressaltar que o sinal de LOM não está presente apenas na condição avaliada com ajuste de pH da solução para 11 e 9 min de reação, indicando que, o antimicrobiano foi