Devido à alta concentração de reagentes e produtos no meio reacional (eventualmente em estado sólido), um biocatalisador conveniente foi desenvolvido 64 para permitir uma fácil separação dos cristais da enzima imobilizada, pois durante os ensaios em que houve a precipitação do antibiótico. Observou-se que ampicilina sólida ficava dentro das partículas do derivado, e sua retirada de dentro do gel de agarose era lenta e ainda fragilizava as partículas de agarose. Além disso, o antibiótico que ficava dentro do derivado era mais uma perda de rendimento de síntese.
Tabela 4.15: Atividade enzimática do sobrenadante na imobilização da PGA. Tempo de imobilização (h) Atividade do sobrenadante (UI) 0,0 400,5 1,0 256,5 2,0 182,3 4,0 53,3 6,0 15,0 7,0 11,0 7,5 1,02
Gel de agarose foi tratado adequadamente e nele imobilizou-se a PGA com uma carga de 400 UI/ggel. O método de imobilização seguiu o item 3.3 e a Tabela 4.15 mostra os resultado da imobilização. Foram necessárias aproximadamente oito horas para que a concentração enzimática na solução sobrenadante fosse
desprezível. Após a imobilização, tinha-se um derivado (lembrando: PGA + suporte) com carga enzimática teórica de 400 UI/ggel. Após todo tratamento de lavagem e armazenamento do derivado, mediu-se sua atividade pelo método PDAB (item 3.4). Utilizaram-se três amostras do derivado e elas apresentaram atividade de 241, 244 e 266 UI/ggel portanto, o derivado apresentou uma atividade aparente de 250 UI/ggel. Desejava-se obter um derivado com carga enzimática a mais alta possível para que, após o tratamento realizado com pectina para aumentar sua estabilidade, ainda fosse mantido um biocatalisador com carga enzimática razoavelmente alta. Com este trabalho foi desenvolvida a patente 64.
Com esse novo biocatalisador testado e armazenado, iniciou-se um conjunto de ensaios de síntese de ampicilina. Após cada ensaio a atividade deste biocatalisador foi medida. Foram realizados seis ensaios, que tinham duração entre dez e doze horas. Após um total de mais de 60 horas de operação com o mesmo biocatalisador, este não sofreu qualquer desativação, nem a integridade das partículas foi afetada pela cristalização dos produtos ou pela agitação do reator. Esse biocatalisador foi armazenado por aproximadamente um mês e em seguida, realizaram-se mais dois ensaios: uma síntese de treze horas com alimentação intermitente dos dois reagentes sólidos; testou-se a atividade do derivado antes e depois desta síntese e não se observou perda de sua atividade. Outro ensaio foi uma síntese com duração de vinte e oito horas. Após esta síntese a atividade do derivado foi testada e se verificou que ela estava um pouco maior que a atividade anterior. Ao se analisar as partículas do biocatalisador, observou- se (o biocatalisador tem diâmetro médio de 0,25 cm ± 0,06) que algumas delas estavam rompidas. Assim, explica-se o porquê da maior atividade deste derivado após esse ensaio. Como o suporte recebeu uma alta carga enzimática, muitas enzimas não eram alcançadas durante a reação, e quando essas partículas foram rompidas mais enzimas puderam entrar em contato com o substrato para reagir. A maioria das partículas do biocatalisador estava intacta; assim tentou-se separá-las com pinça, porém esta tarefa mostrou-se infrutífera, pois a atividade medida do derivado ainda era superior à atividade medida antes do ensaio de síntese. Observou-se que algumas das pequeninas partículas rompidas ainda estavam juntas das outras não rompidas; isso se deveu ao fato do biocatalisador ficar em
solução sendo muito difícil separá-lo com pinça ou com peneira. Esse biocatalisador mostrou-se muito estável durante todos os ensaios de síntese realizados. Só apresentou desgaste após drástico ensaio de 28 horas ininterruptas em que houve a precipitação dos produtos e a adição de reagentes sólidos.
Análises da estrutura desses biocatalisadores foram realizadas utilizando a técnica de microscopia eletrônica de varredura (MEV). A Figura 4.33 mostra um exemplo do biocatalisador antes e após ensaios de síntese. Pode-se observar que o biocatalisador manteve sua estrutura bem definida. Teve-se uma certa dificuldade para determinar a melhor técnica para desidratação da amostra. A técnica usada na análise mostrada nesta Figura está detalhada no Apêndice D.
Figura 4.33 (A): Corte do biocatalisador logo após ser preparado, antes de ser utilizado em sínteses.
Figura 4.33 (B): Corte do biocatalisador após ser utilizado em sínteses. A estrutura do biocatalisador é altamente porosa e ele é armazenado em meio aquoso. Para se fazer análise de MEV é necessário a retirada de toda essa água, porém sem quebrar a estrutura do biocatalisador. A técnica utilizada mostrou-se satisfatória, porém requer várias etapas e faz uso de muitos reagentes químicos. Uma nova técnica foi testada (também no Apêndice D) e se mostrou muito mais simples já que não utilizou reagente químico para desidratação da amostra. Primeiro resfriou-se a amostra a 5 ºC, em seguida em congelador e por último a –30 ºC em ultrafreezer. A amostra foi para um liofilizador que sob essas condições retirou-se água da amostra sem destruir sua estrutura.
Testes com outra enzima, doada pela empresa Prodotti Laboratório Farmacêutico Ltda da cidade de São Paulo, foram realizados e os resultados com as atividades antes e após utilização são mostrados na tabela 4.16. A enzima já estava imobilizada em material inerte, sua atividade foi medida pelo método PDAB e apresentou atividade de 335UI/g. Do mesmo modo, desejava-se obter um derivado com carga enzimática a mais alta possível e que ao mesmo tempo sua resistência e estabilidade fossem aumentadas. Com esse derivado testado e armazenado iniciou-se um conjunto de ensaios de resistência e estabilidade. Testaram-se diferentes concentrações e proporções de pectina/enzima imobilizada. Também foi analisado o diâmetro do biocatalisador formado. Como era de se esperar, ao se diminuir o tamanho das partículas, aumentou-se a área superficial e a atividade do biocatalisador. O catalisador de partícula grande tem diâmetro médio de 2,48 mm ± 0,06 e o de partícula pequena tem 1,06 mm ± 0,07.
Biocatalisadores com diâmetro de partícula diferente também foram testados e os dois resultados mais representativos estão mostrados na Tabela 4.16. Com esse derivado testado e armazenado, iniciou-se um conjunto de ensaios de síntese de ampicilina. Após cada ensaio a atividade do derivado foi medida e este não sofreu desativação, nem a integridade das partículas foi afetada pela cristalização dos produtos ou pela agitação do reator.
Tabela 4.16: Atividade da enzima doada da indústria pré e pós-tratamento, φ é o diâmetro do derivado (enzima + suporte).
Enzima imobilizada Enzima pós-pectina de
φ = 2,48 Enzima pós-pectina de φ = 1,06
314,58 UI/g 81,45 UI/g 126,90 UI/g
337,66 UI/g 67,42 UI/g 115,32 UI/g
353,66 UI/g 71,59 UI/g 120,61 UI/g
335 UI/g ± 20 74 UI/g ± 7 121 UI/g ± 6