Gel de agarose

O gel de agarose foi o primeiro suporte a ser utilizado neste trabalho, por possuir uma grande área superficial, ser de fácil ativação a partir de grupos hidroxila, e apresentar boas propriedades mecânicas, que o tornam resistente à agitação e a pressões relativamente altas, podendo ser usado sem dificuldade em condições industriais.

A agarose é uma fração de um polímero natural conhecido como ágar. Este polímero natural é obtido a partir de algas vermelhas, entre elas as conhecidas como Gelidium amansii, G. subcostatum, G. japonicum, Pterocladia tenius, Ceramium boydenii, 136 Gloiopeltis complanata. 163. Suas características dependem não só das algas utilizadas para sua obtenção, mas também, da época de coleta, lugar e método de extração. As duas frações que formam o ágar são chamadas agarose e agaropectina pela sua semelhança com as duas frações que formam o amido. A agarose, fração geleificante do ágar, é um polímero cuja cadeia principal é constituída por agarobiose, molécula formada por 1,3-β-D- galactopiranose e 1,4-α-galactopiranose (Figura 2.5) ou seu derivado anidro 1,3- β-D-galactopiranose 3,6-anidro-galactose (Figura 2.6).

Figura 2.5: molécula de agarobiose.

A cadeia de agarose tem uma estrutura de dupla hélice que se agrega para formar uma estrutura tridimensional capaz de reter líquidos no seu interior. A agaropectina possui a mesma composição, mas algumas unidades dos polímeros são substituídas por 4-6-O-(1-carboxietilidena)-D-galactopiranose ou por açúcares residuais sulfatados ou metilados. 136,150

Figura 2.6: Derivado anidro da galactose.

A resistência mecânica do gel de agarose pode diminuir em até 75% quando este é usado como suporte para imobilizações e não se recomenda a sua utilização em temperaturas superiores a 50ºC. 159 Porém sua baixa densidade de cargas elétricas livres e sua pouca reatividade tornam esses géis muito atrativos para aplicações em processos biotecnológicos.

Para melhorar suas características mecânicas e aumentar sua estabilidade, as hélices duplas do polímero podem ser reforçadas por interligações, num processo conhecido como ligação cruzada. Muito freqüentemente, usa-se 2-3- dibromopropanal como agente de ligação entre as fibras. Uma característica do gel de agarose, quando comparado com outros géis naturais, é o grande raio de poro, na faixa de 20-680Å, dependendo do método de preparação e da concentração do polímero. 150

2.1.4.2 Sílica macroporosa

Existe uma grande variedade de suportes para imobilização. A sílica macroporosa apresenta uma série de vantagens, tais como: elevada resistência mecânica à compressão, estabilidade térmica, resistência a ataque de microrganismos e de solventes orgânicos, e fácil regeneração por processo de pirólise. 67 Entretanto, normalmente apresentam baixa resistência à abrasão e cisalhamento. A sílica macroporosa é um dos suportes já estudados pelo grupo de trabalho do DEQ/UFSCar, por isso foi o segundo suporte escolhido para produzir derivados estabilizados de PGA de E. coli.

Sílica porosa é uma das várias formas de sílica amorfa. Outras formas são precipitados não-porosos, hidrogéis de sílica, materiais pirogênicos, minerais opalinos. Essas substâncias variam consideravelmente na aparência, dureza e grau

de hidratação, mas podem ser consideradas como produtos da policondensação do ácido ortosilícico-Si(OH)4. 126

Textura porosa da sílica, área superficial específica, volume e diâmetro do poro dependem do tamanho e empacotamento das partículas elementares. Uma partícula elementar consiste de uma rede tridimensional de tetraedros de SiO4,

cada átomo de silício estando ligado a quatro oxigênios e cada oxigênio estando ligado a dois silícios. A superfície da partícula é coberta com grupos OH que são responsáveis pela natureza hidrofílica da sílica normal, e numerosas moléculas de água são ligadas aos grupos OH durante o processo de condensação polimérica do ácido ortosilícico, gerando o hidrogel. Quando esse hidrogel é seco, com o processo de policondensação ainda ocorrendo, um xerogel (sílica porosa) é formado. 22,139 Análises de raio-X apresentadas por Pereira, 1996 139 revelaram que a sílica utilizada neste trabalho é amorfa.

Os silanóis na superfície da sílica porosa podem reagir com vários componentes químicos ficando superficialmente estáveis e permitindo, assim, a adaptação da superfície para aplicações específicas. Das diversas reações químicas que podem ocorrer na superfície da sílica porosa, 125 a reação com compostos orgassilânicos foi utilizada para a ativação do suporte neste trabalho. Além da morfologia do poro, as condições de imobilização também devem ser consideradas, pois influenciam na quantidade e na distribuição da enzima que se liga ao suporte poroso.

2.2 PENICILINAS

As penicilinas, antibióticos empregados, inicialmente, para o tratamento de doenças infecciosas de origem bacteriana, são produzidas por várias espécies de

Penicillium, principalmente pelo P. chrysogenum, bem como por outras espécies

de fungos. A benzilpenicilina, desde sua descoberta, sempre teve maior atividade

in vivo. Seu largo uso se deve à baixa toxicidade e alta segurança como agente

quimioterápico. Apesar disso, apresenta sérias limitações: rápida excreção através dos rins, espectro limitado, susceptibilidade a todas as β-lactamases conhecidas e, em conseqüência de seu sistema anelar, alta reatividade química, tanto em meio básico como ácido, impedindo sua utilização por via oral. Além disso, pode

desencadear efeito alérgico, como urticária. Devido a essas limitações, compostos de maior estabilidade e lenta velocidade de excreção já eram desejados mesmo no início do uso da droga. 116,132

2.2.1 Histórico

O estudo de Pasteur, em 1877, que descreve a inibição do crescimento do bacilo carbunculoso na urina por outras bactérias que ali se desenvolviam ao mesmo tempo, pode ser destacado como o precursor dos estudos que levaram à descoberta da penicilina e, conseqüentemente, dos demais antibióticos. Seus trabalhos enfatizam principalmente o antagonismo entre bactérias. Em 1886, Bartolomeu Gosio isolou, de um fungo que denominou Penicillium glaucum, pequena quantidade de uma substância bactericida. Enerst Duchesne, em 1897, publicou uma tese de doutoramento “Contribuição ao estudo da concorrência vital entre os microrganismos. Antagonismo entre os bolores e os micróbios”, em que demonstrou o antagonismo entre certos bolores e bactérias patogênicas, in vívo, pela inoculação concomitante, em um animal, de culturas e verificando a atenuação da virulência. A indicação de possíveis aplicações terapêuticas surge freqüentemente como conclusão destes trabalhos. 116,157

Em 1928, Sir Alexander Fleming, 57 professor de bacteriologia no St Mary's

Hospital da Universidade de Londres, estudando mais ou menos ao acaso o bolor,

verificou que o mesmo fez desaparecer, em algumas placas, estafilococcus em volta da formação miceliana. Fleming notou que este fungo, isolado, e identificado mais tarde como sendo o Penicillium notatum, produzia uma substância bactericida seletiva. Por conveniência, ele chamou o filtrado do caldo de cultura “penicillin”. Em 1929, publicou, no British Journal of Experimental

Pathology, trabalho mostrando o poderoso efeito antibacteriano da substância

contida no caldo, em diferentes bactérias e em diferentes graus. Estudou sua estabilidade quanto ao tempo, condições de temperatura e pH, bem como sua toxicidade. Sugeriu seu uso terapêutico como anti-séptico.

Em 1940, Chain et al. publicaram trabalho sobre as propriedades químicas, farmacológicas e quimioterápicas da substância produzida pelo fungo e descrita por Fleming. Era um pó castanho, levemente solúvel em água, obtido do meio de

cultura, que, mesmo não sendo puro, mostrou atividade antibacteriana muito alta e não parecia relacionar-se com qualquer substância quimioterápica em uso na época. Um extenso trabalho dos primeiros resultados clínicos, juntamente com o método de extração, foi publicado por Abraham et al. em 1941.

Foi na Inglaterra, em 1941, que a penicilina foi testada pela primeira vez em ser humano. Em 1942, iniciaram-se os testes clínicos nos Estados Unidos. Devido às péssimas condições impostas pelo estado de guerra, na Inglaterra, verificou-se a impossibilidade de se produzir a penicilina em grande escala naquele país. Em 1941, Howard Walter Florey e N. G. Heatley foram para os Estados Unidos e, nos laboratórios americanos, com a colaboração de Robert D. Coghill aperfeiçoaram as técnicas britânicas e as aplicaram na manufatura industrial da penicilina naquele país. Em 1945, Fleming juntamente com Florey e Chain ganharam o prêmio Nobel de medicina.

A descoberta da penicilina, o primeiro antibiótico que encontrou uso prático no homem, marcou o início de uma era que produziu grande número de tais substâncias. As primeiras penicilinas, biossintéticas, ainda hoje estão em uso clínico. Outras, semi-síntéticas, com amplo espectro e melhores propriedades fármaco-cinéticas, foram paulatinamente sendo utilizadas.

2.2.2 Estrutura Geral

A estrutura básica das penicilinas contém uma série de componentes: um anel tetragonal β-lactâmico fundido a outro tiazolidínico, e uma cadeia lateral variável ligada ao sistema bicíclico na posição 6, através do grupo acilamino, uma carboxila em 3, e duas metilas em 2, conforme fórmula geral:

O anel β-lactâmico é uma condensação de moléculas de alanina e β- dimetilcisteína para formar núcleos penam. O anel β-lactâmico é essencial para atividade antimicrobial e a cadeia lateral determina o espectro de atividade e as propriedades fármaco-cinéticas do composto. Modificações estruturais da cadeia lateral da penicilina podem levar de algum modo a um aumento de estabilidade frente a β-lactamases e assim, expandir a atividade antibacterial das penicilinas.

2.2.3 Nomenclatura

Uma vez determinado que as penicilinas possuem um núcleo comum e diferem apenas na cadeia lateral, elas foram, primeiramente, distinguidas, na Inglaterra, por algarismos romanos e nos Estados Unidos, por letras, seguindo a seqüência de suas descobertas. Para evitar ambiguidade na nomenclatura o sistema de números e letras foi substituído por prefixos, indicando a natureza da cadeia lateral. Deste modo, o grupo amida é incluído no nome básico penicilina.

O sistema de anel bicíclico não substituído (Fiqura 2.7) é denominado penam. Assim as penicilinas são também chamadas ácidos 6-acilamino-2,2- dimetilpenam-3-carboxílico, obedecendo a numeração aceita desde o início dos estudos e indicada na estruturação da Figura 2.7. O penam com duas metilas no carbono 2 e a carboxila em 3 é denominado ácido penicilânico. Portanto, as penicilinas são, ainda, chamadas ácidos 6-acilaminopenicilânicos.

2.2.4 Uso Terapêutico

As penicilinas são mais ativas contra bactérias gram-positivas do que contra as gram-negativas. A mais usada, entre todas, é a benzilpenicilina. A obtenção de derivados levou a compostos mais ativos contra os gram-negativos. As várias penicilinas podem ser divididas em seis grupos: 132 (1) penicilinas naturais (ex.: benzilpenicilina), (2) penicilinas administradas oralmente (ex.: fenoximetilpenicilina, ou penicilina V), (3) penicilinas anti-estafilococais (ex.: meticilina, oxacilina), (4) penicilinas de amplo-espectro (ex.: ampicilina, amoxicilina), (5) penicilinas ativas contra P. aeruginosa (ex.: carbenicilina), e (6) penicilinas resistentes as β-lactamases (ex.: formidacilina, temocilina).

As penicilinas são administradas via oral, intramuscular, endovenosa e tópica. São inativadas em meio ácido com relativa facilidade e, por isso, algumas não têm atividade por via oral, por serem degradadas pela ação do suco gástrico. São notáveis em sua ausência geral de toxicidade. Esta falta de toxicidade é marcante em indivíduos normais, mas o amplo uso destas substâncias torna considerável a incidência de reação adversa, o que exige cuidado em sua prescrição. O efeito adverso mais comum é uma reação alérgica a qual pode levar de leves erupções até choque anafilático que pode ser fatal.

2.2.5 Obtenção

As penicilinas podem ser obtidas por fermentação, por via semi-sintética ou sintética.

2.2.5.1 Fermentação

Por este processo foi obtida acima de uma centena de penicilinas. Destas somente a benzilpenicilina e a fenoximetilpenicilina são de grande utilidade clínica. São produtores, principalmente, o Penicillium notatum e o P.

chrysogenum, além de outras espécies de fungos. Por volta de 1970, com os

melhoramentos no meio e no processo de cultura, a produção industrial de penicilina tinha chegado a 20.000 unidades por mililitro.

Os meios de cultura para o crescimento dos organismos contêm poucos ingredientes básicos: açúcar fermentável, uma adequada fonte de nitrogênio e tampão, ou outros meios para controlar o pH. Com o uso de água de milho no meio de cultura, no início dos estudos sobre a produção da penicilina, observou-se um grande aumento no rendimento e redução no período necessário para incubação. A adição de ácido fenilacético ao meio de cultura aumenta o rendimento na produção de benzilpenicilina. Estes resultados, somados aos estudos de biossíntese, levaram à obtenção de penicilinas com diferentes cadeias laterais, através da adição de precursores adequados ao meio de cultura. Porém, não foi obtido composto comparável à benzilpenicilina quanto à sua ação antibacteriana.

2.2.5.2 Semi-sintéticas

A adição de precursor ao meio de fermentação teve alcance limitado na obtenção de novas penicilinas. Em 1959, entretanto, o ácido 6-aminopenicilânico foi descoberto e sintetizado em quantidade. Isto possibilitou a acilação de seu aminogrupo e iniciou a síntese de uma ampla faixa de outros derivados. 132

2.2.5.3 Sintéticas

A síntese total de penicilinas, de modo geral, tem pouca importância, quando comparada com os processos de fermentação e síntese parcial. Apenas algumas penicilinas foram obtidas por este meio, embora exista grande interesse na obtenção de antibióticos β-lactâmicos em geral. A dificuldade na síntese de penicilinas está relacionada a certas características da molécula principalmente a ligação amida, bastante lábil, do anel β-lactâmico. O processo de síntese envolve várias etapas de baixo rendimento e alto custo, não competindo com os outros processos de obtenção.