Metodologia para Quantificação do Número de Grupos

A necessidade de controlar o grau de ativação do suporte requer a determinação do número de grupos aldeídos presentes na superfície do suporte. Os grupos hidroxil do suporte oxidados com periodato de sódio resultam nos grupos aldeídos desejados. A quantificação dos grupos aldeídos foi realizada pela medida de NaIO4 não consumido (sobrenadante). Utilizou-se do fato do iodeto de

potássio em excesso (I-) reagir com o periodato (IO-4) não consumido da reação de

oxidação, gerando iodo na forma I3-, segundo a seguinte reação: IO-4 + 7I- + 8H3O+ → 8I3- + 12H2O

A metodologia desenvolvida para a quantificação do iodo formado e, em conseqüência, do periodato não consumido, é baseada em colorimetria. O iodo formado foi quantificado medindo-se a absorção de luz visível em espectrofotômetro. É necessário o uso de iodeto em excesso, para garantir a formação I3-. A mesma quantidade de periodato foi adicionada ao suporte (sílica ou agarose) ativado e ao branco. Em tempos determinados, retiraram-se alíquotas que reagiam com uma solução de iodeto de potássio/carbonato de sódio. Neste método, 100 µL da solução de NaIO4 sobrenadante na reação de oxidação

reagiram com 3 mL de uma mistura 1:1 de KI 10 % p/v e bicarbonato de sódio saturado, sendo realizada análise em espectrofotômetro.

Utilizou-se sempre como padrão um branco em paralelo, que correspondia a igual quantidade de NaIO4 adicionada a uma massa de água equivalente à massa

de suporte. Portanto, o branco continha a quantidade total de periodato presente inicialmente na amostra. Inicialmente, tomaram-se 100 µL de branco, reagiram-se com a solução de iodeto de potássio: bicarbonato de sódio saturado, a cor resultante foi ajustada para absorbância próxima a 0,7 (~ 470 nm), alterando-se, se necessário, o comprimento de onda do aparelho. Dessa forma o periodato da amostra contendo suporte ativado foi sempre quantificado como uma porcentagem do periodato total presente, uma vez que é linear a relação entre absorbância da amostra e do padrão com a concentração do iodo e, conseqüentemente, do periodato presente. Essa metodologia permitiu, de forma rápida e reprodutível,

determinar a quantidade de periodato consumida para diferentes graus de ativação dos suportes 138.

3.3 IMOBILIZAÇÃO DA PGA

A maioria das proteínas apresenta alguns resíduos de lisina, os quais geralmente não estão envolvidos no sítio ativo da enzima. Grupos amino são polares e estes ficam geralmente expostos para o meio na superfície da proteína; quando desprotonados são muito reativos e, sem prévia ativação, atuam como agente nucleófilo contra os átomos com carga parcialmente positiva localizados na superfície do suporte (ver Figura 3.6).

Figura 3.6: Imobilização de PGA a suporte ativado.

É necessário um rigoroso controle da intensidade do processo de multi- interação enzima-suporte, de modo a se obter uma alta estabilização sem, contudo, promover a distorção da estrutura terciária da enzima e, conseqüentemente, do seu centro ativo. A estrutura cataliticamente ativa da enzima é mantida por diferentes forças, como pontes de hidrogênio, forças iônicas, interações de van der Waals. O alinhamento entre os grupos amino da enzima e os grupos aldeído do suporte é produzido por movimentos vibracionais da estrutura imobilizada. Os grupos amino situados na superfície da proteína não estão exatamente alinhados com os grupos aldeído do suporte, ou seja, a enzima e o suporte ativado não são estruturas complementares. Assim, quando a enzima, já imobilizada, continua a interagir com o suporte ativado, novos alinhamentos entre os grupos da enzima e os grupos

aldeídos do suporte são formados. Quando esses alinhamentos têm a direção correta, a subseqüente ligação química será muito rápida e irreversível.

Para iniciar a imobilização da PGA em sílica foi necessário lavar a sílica oxidada com tampão bicarbonato 500 mM, pH 10,5 e em seguida com tampão bicarbonato 100 mM, pH 10. Este procedimento não foi necessário para o suporte gel de agarose. Ele foi colocado diretamente para reagir com a enzima pelo procedimento que se segue.

Em separado, preparou-se uma solução de ácido fenilacético, 100mM, em tampão bicarbonato pH 10. O sítio ativo da enzima com ácido fenilacético adsorvido ficou protegido de alterações em sua estrutura tridimensional, preservando sua atividade catalítica durante o processo de imobilização. Deve-se primeiro preparar o ácido fenilacético e depois elevar o pH para 10. Em seguida, adicionou-se o bicarbonato, sempre monitorando o pH para ele não baixar, pois poderia haver formação de ácido carbônico e liberação de CO2. A essa solução

adicionou-se a de enzima na quantidade desejada. Nessa solução resultante adicionou-se o suporte – sílica úmida na razão de 20 mL de solução total por grama de sílica seca ou 1 mL de gel de agarose para 10 mL de solução total (tampão bicarbonato com fenilacético + solução de enzima).

Deixou-se reagir por 3 horas em temperatura aproximadamente de 20 ºC. Os grupos aldeídos do suporte reagiram com os grupos amino formando bases de Schiff. Essa reação é rápida, porém reversível. Dessa forma muitos enlaces enzima-suporte podem ser formados rapidamente, porém a reversibilidade faz com que ligações que provoquem grandes distorções na enzima sejam termodinamicamente desfavoráveis e se desfaçam. Depois das 3 horas de reação, tempo suficiente para que todos os enlaces fossem formados, a reação foi terminada com adição do agente redutor suave borohidreto de sódio, na razão de 1 mg por mL de solução de imobilização. Para 1 mL de solução total usou-se 1mg de borohidreto de sódio, durante 30 minutos. Ao final da imobilização, lavou-se o derivado com tampão fosfato 5 mM, pH 7 anteriormente preparado, e em seguida com bastante água destilada para tirar o excesso de borohidreto. O derivado foi armazenado em solução 3 % p/v de azida sódica.

A mistura reacional foi mantida sob agitação lenta. Assim que se colocou a enzima na solução, marcou-se o tempo e retirou-se a primeira amostra do sobrenadante. Depois de trinta minutos retirou-se outra amostra para verificar se toda enzima já estava imobilizada. A imobilização foi acompanhada pela queda de atividade enzimática do sobrenadante, até esta ser zerada. Geralmente, deixa-se agitando por um tempo total de 3 horas para aumentar o número de enlaces. As amostras foram analisadas pelo método PDAB, que mede a atividade da enzima. Em paralelo ao processo de imobilização, fez-se um branco, que foi preparado substituindo o suporte ativado por suporte não ativado no processo descrito anteriormente 81.

3.4 MÉTODO PDAB PARA DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DA PGA