Atividade genotóxica em linfócitos humanos

O teste do cometa, também conhecido como “Single-Cell Gel Electrophoresis (SCGE)”, tem sido, rotineiramente, utilizado no estudo do potencial genotóxico de compostos químicos industriais, biocidas, agroquímicos e produtos farmacêuticos. De acordo com o protocolo descrito (LIMA et al., 2007), os linfócitos obtidos de indivíduos saudáveis (5,0 x 104 células/mL) foram cultivados na presença de concentrações crescentes (100, 500 e 1.000 µg/mL) de ambas as proteínas, Cry8Ka5 e Cry1Ac, durante 24 h, a 37 °C, em atmosfera de 5% de CO2. A

doxorrubicina (0,6 µM) como controle positivo. Após o tratamento, as células foram submetidas à eletroforese em gel de agarose (25 V; 300 mA), durante 20 min. Para coloração das lâminas foi utilizada uma solução de brometo de etídio (20 µg/mL). As lâminas foram analisadas com o auxílio de um microscópio de fluorescência (Olympus, Modelo BX41, Shinjuku, Tóquio, Japão). A análise foi realizada de acordo com o padrão de escores previamente determinados pelo tamanho e intensidade da cauda do cometa. Foram contados 100 cometas por lâmina e classificados, por análise visual, dentre cinco categorias (0, 1, 2, 3 e 4) que representam o percentual de DNA na cauda do cometa, indicando o grau de lesão sofrido pela célula. O índice de dano (ID) foi obtido pela seguinte fórmula:

ID = n i i i



, onde n_i é o número de células com nível de dano i (0, 1, 2, 3 ou 4).

Logo, os valores de ID podem variar de 0 (sem dano) a 4 (dano máximo). Para análise estatística dos resultados, diferenças significativas entre médias foram calculadas por análise de variância (ANOVA), seguida de Student Newman-Keuls (p < 0,05), utilizando programa estatístico adequado.

4.3 Avaliação de Atividade Hemolítica das Proteínas Cry8Ka5 e Cry1Ac

4.3.1 Coleta de sangue humano e de animais de laboratório para isolamento e preparo de suspensão de eritrócitos

A coleta de sangue humano, a condição de saúde dos doadores e o número de voluntários foram iguais aos descritos no item 4.2.1, com exceção de que foram utilizados três voluntários, de qualquer sexo, para cada tipo sanguíneo, A, B, AB e O. O sangue coletado foi transferido para tubos heparinizados, lentamente homogeinizado e acondicionado a 4 ºC, até o momento do isolamento dos eritrócitos.

O sangue do coelho foi coletado a partir de um pequeno corte perpendicular na veia marginal da orelha com bisturi. O sangue foi colhido em tubo heparinizado, homogeinizado e acondicionado a 4 ºC, até o momento do isolamento dos eritrócitos. Já para a coleta de sangue dos ratos, os animais foram levemente sedados com éter etílico e o sangue coletado através de

punção no plexo retro-orbital com um microtubo de vidro para hematócrito. O sangue foi aparado em microtubos heparinizados, homogeinizados e mantidos a 4 ºC.

Uma parte do sangue humano do tipo O foi reservada para análise da topografia de membrana celular com sangue total, enquanto a outra parte foi destinada ao isolamento dos eritrócitos. Todas as outras amostras de sangue foram destinadas somente ao isolamento dos eritrócitos. Assim, para o isolamento dos eritrócitos e preparo de uma suspensão a 2%, todas as amostras de sangue foram centrifugadas (Fanem, São Paulo, Brasil) a 200 x g, por 10 min, a 25 ºC. O sobrenadante foi descartado e do precipitado (“papa de hemácias”), foi retirado 2 mL que foi misturado a 100 mL de NaCl 0,9%. A suspensão foi levemente misturada e acondicionada a 4 ºC, por, no máximo, 24 h.

4.3.2 Atividade hemolítca em eritrócitos de humanos e animais de laboratório

A atividade hemolítica das entomotoxinas foi investigada seguindo a metodologia descrita por Merker e Levine (1986) e Bernheimer (1988), com algumas modificações. A presença de hemólise na suspensão de eritrócitos humanos do tipo A, B, AB e O e de eritrócitos de coelho e rato, todas a 2%, foi verificada após incubação por 1 h (30 min a 37 ºC e, depois, 30 min a 25 ºC) com concentrações crescentes das proteínas Cry8Ka5 e Cry1Ac, variando de 7,8 a 1.000 µg/mL, numa proporção de 1:2 (v/v). Albumina sérica bovina foi utilizada como controle não-Cry nas mesmas condições. O grau de hemólise foi calculado pela liberação de hemoglobina medida no comprimento de onda de 540 nm, após centrifugação da mistura a 1.000 x g, por 5 min, a 25 ºC. A lise completa (100 %) foi obtida por diluição de 200 µL da suspensão de células a 2% em 200 µL de água destilada, utilizando-se ainda um controle negativo com a mesma proporção de células em solução salina. A atividade hemolítica foi calculada de acordo com a seguinte fórmula: (Abs 540 da amostra – Abs 540 do NaCl 0,9%) X 100/Abs 540 da água destilada. Os valores de CI50 (Concentração que causa hemólise de 50% das células) e intervalo

de confiança (IC 95%) foram calculados a partir de análise de regressão não-linear. Diferenças significativas entre médias foram calculadas por análise de variância (ANOVA), seguida de Student Newman-Keuls (p < 0,05), utilizando programa estatístico adequado.

4.4 Análise de topografia de membrana celular via MFA

Para avaliar quaisquer efeitos das proteínas Cry8Ka5 e Cry1Ac sobre eritrócitos, que não necessariamente desencadeiam hemólise, foram analisados dados de topografia de membrana celular obtidos por MFA a fim de fornecer informações de segurança complementares ao teste clássico de atividade hemolítica.

As imagens foram obtidas em modo contato de força constante utilizando “cantilevers” de 200 µm em forma de V (constante de mola própria de »0.15 N/m e frequência de ressonância de »24 kHz), com ponteira piramidal integrada (raio de curvatura < 20 nm). O movimento do escâner foi de 100 µm nas direções XY e 7 µm na direção Z. Todas as imagens foram adquiridas como 512x512 pixels em uma taxa de escaneamento de 1HZ. As imagens obtidas foram processadas pelo programa Particle Analysis SPM-9600 (Shimadzu, Tóquio, Japão). O processamento consistiu em um nivelamento plano automático Wt de superfície. Cem células individuais de cada tratamento foram manualmente segmentadas _{utilizando a função do programa “análise de} marcação”, seguida pelas medições das células. Os parâmetros selecionados para as medições foram: (1). Perímetro, o qual obtém o comprimento do contorno de uma partícula, e a largura padrão obtida pela medida da distância de uma linha traçada entre duas retas paralelas a uma partícula (FIGURA 3.1.A); (2) Média de Z, obtém o valor médio dos dados de Z provenientes dos pixels que constituem uma partícula; (3) Área excluindo vazios, obtém uma área através da seguinte equação: área excluindo vazios = área por pixel x número de pixels de uma partícula (FIGURA 3.1.B); (4) Área incluindo vazios, obtém uma área através da seguinte equação: área incluindo vazios = área por pixel x (número de partículas + número de pixels no vazio de uma partícula) (FIGURA 3.1.C); (5) Área de superfície, o cálculo utiliza estruturas imaginárias onde, os pontos da estrutura são criados a partir de valores de Z arranjados espacialmente provenientes de pixels que constituem uma partícula. Quadrângulos formados com os pontos das estruturas são divididos em dois para criar triângulos. A somatória das áreas desses triângulos é então calculada (FIGURA 3.1.D.); e, (6). Volume, obtido através da seguinte equação: volume = área excluindo vazios x média do valor de Z.

4.4.1 Análise de dados

Os parâmetros processados pelo programa Particle Analysis SPM-9600 (Shimadzu, Japan) foram submetidos à análise de estatística One-way ANOVA, sendo as médias comparadas pelo teste de múltiplas comparações Sidak (p < 0,05), utilizando o programa estatístico adequado.

Figura 3.1 - A) Perímetro (perimeter) e largura padrão (pattern width); B) Área excluindo vazios; C) Área incluindo vazios; e, D) Área de superfície. Adaptado de Particle Analysis Softwere – Instruction Manual (Shimadzu, Japan)

A

B

C