Determinação da digestibilidade in vitro e estabilidade à temperatura da proteína Cry8Ka

4.5.1 Digestibilidade in vitro

A susceptibilidade à digestão in vitro das proteínas foi avaliada a partir da incubação da Cry8Ka5 e da Cry1Ac em fluido gástrico simulado (FGS) e em fluido intestinal simulado (FIS) na concentração 0,25 mg/mL, de forma não-sequencial. O FGS é uma mistura de NaCl 34 mM, HCl 0,7%, pH 1,0-2,0 e pepsina (Sigma P7012) 3,2 mg/mL, enquanto o FIS é composto por fosfato de potássio 50 mM, pH 7,5 e pancreatina (Sigma P7545) 10 mg/mL, ambos preparados de acordo com as recomendações de Roesler e Rao (2001). A mistura de cada proteína em FGS ou em FIS foi incubada a 37 ºC, sob agitação constante, sendo retiradas alíquotas de 200 µL nos tempos de 0 s, 15 s, 30 s, 60 s, 2 min, 5 min, 10 min, 20 min e 30 min. Os testes foram feitos, pelo menos, em duplicata para cada proteína nos diferentes fluidos. A digestibilidade das proteínas no FGS e no FIS foi monitorada por SDS-PAGE, como descrito no item 4.4.4.

4.5.2 Determinação de estabilidade à temperatura

A estabilidade das proteínas à temperatura foi avaliada a partir da incubação da proteína Cry8Ka5 e da Cry1Ac em 1,5 mL de solução tampão Tris-HCl 20 mM com EDTA 5 mM na concentração de 0,25 mg/mL. As proteínas foram submetidas à temperatura de 100 °C por períodos de 10, 30 e 60 min, sendo realizadas duplicatas para cada proteína e para cada tempo de exposição. O teste foi parado pela imersão dos tubos com as amostras em gelo e adicionando-se tampão de amostra (Tris-HCl 50 mM, sacarose 8%, SDS 2%, 2- mercaptoetanol 5% e azul de bromofenol 0,02%). As amostras controle com 0 min de incubação da proteína (mantidas a 4 ºC) também foram preparadas (HÉROUET et al., 2005).

Após os tratamentos, as amostras foram analisadas quanto a sua integridade por SDS-PAGE, como descrito no item 4.4.4.

4.6 Ensaio de toxicidade aguda (dose única) via oral da proteína Cry8Ka5 em camundongos

O estudo de toxicidade aguda, em dose única, via oral da proteína Cry8Ka5 e da, proteína controle, Cry1Ac foi realizado de acordo com o protocolo teste limite Nº 425 da OECD (2001). Foram utilizados camundongos fêmeas (n = 5/ por grupo) da linhagem Swiss com 5 semanas de idade e com peso variando de 18 a 22 g obtidos do Biocen-UFC. As proteínas foram ressuspendidas em água destilada e administradas oralmente na dose de 5.000 mg/kg de peso corpóreo, por gavagem, para cada camundongo. Um grupo de camundongos administrados somente com o veículo, água destilada, também foi realizado. Todos os camundongos foram observados nas primeiras horas após a administração das proteínas e, depois, duas vezes ao dia durante 14 dias. A possível intervenção das proteínas sobre o comportamento natural dos camundongos foi observada, bem como indícios de toxicidade a partir da verificação dos seguintes sintomas/características: piloereção, anestesia, atividade motora, frêmito vocal, resposta ao toque, equilíbrio, presença de contorções, tremores, ptose e presença de fezes escuras ou disformes. O peso de todos os camundongos foi registrado nos dias 1, 3, 7, 10 e 14. No 14º dia, os animais foram levemente sedados com éter etílico e exsanguinados pela via do seio retro-orbital para determinação de parâmetros hematológicos e bioquímicos do soro. Em seguida, os animais foram sacrificados por deslocamento cervical e dissecados para observação, monitorada por um patologista, da condição anatomo- morfológica de órgãos vitais, sendo, depois, pesados cuidadosamente para obtenção do peso úmido relativo. Por fim, os órgãos foram mergulhados em álcool etílico 70%, por 24 h, e, depois, transferidos para formalina 10% até a realização da rotina histológica.

4.6.1 Determinação de parâmetros hematológicos e bioquímicos

Ao final do experimento de toxicidade aguda, os animais receberam uma leve anestesia por inalação de éter etílico e, posteriormente, o sangue foi coletado via plexo retro- orbital com auxílio de tubo capilar heparinizado. Uma parte do sangue foi coletada em tubos heparinizados para a determinação dos parâmetros hematológicos e outra parte foi coletada para obtenção de soro para dosagem de parâmetros bioquímicos. Para análise dos parâmetros

hematológicos foi utilizada uma alíquota 15 µL de sangue total de cada animal em um analisador hematológico veterinário (Sysmex, modelo pocH-100iV Diff, Kobe, Japão). Os parâmetros verificados foram: número de células brancas no sangue (leucócitos), número de células vermelhas do sangue (hemácias), concentração de hemoglobina, hematócrito, volume corpuscular médio (V.C.M.), hemoglobina corpuscular média (H.C.M.), concentração de hemoglobina corpuscular média (C.H.C.M.), número de plaquetas, % de linfócitos nas células brancas totais, % de neutrófilos, basófilos e monócitos, amplitude de distribuição das hemácias medida como coeficiente de variação (RDW-CV) e amplitude de distribuição das hemácias medida como desvio padrão (RDW-SD). Já para as amostras de soro dos animais foram analisados os parâmetros bioquímicos seguintes: aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), fosfatase alcalina, uréia, proteína total, albumina, colesterol total, creatinina e triglicérides. As análises sorológicas foram feitas utilizando kits (Bioclin, QUIBASA, Belo Horizonte, Brasil) específicos para cada parâmetro, seguindo as instruções do fabricante.

4.6.2 Determinação do peso úmido relativo dos órgãos e análises histopatológicas

Ao final do experimento de toxicidade aguda, os camundongos foram sacrificados por deslocamento cervical. Os animais foram dissecados e cuidadosamente os órgãos/tecidos foram verificados quanto ao seu aspecto (cor, presença de manchas e/ou irregularidades anatômicas etc) por um histopatologista e, em seguida, pesados em balança de presisão (Bioprecisa, modelo FA2104N, São Paulo, Brasil). Posteriormente, os órgãos foram fixados com álcool etílico 70%, por 24h, e depois, com formalina 10%. Os órgãos/tecidos dissecados foram: cérebro, timo, coração, pulmões, fígado, baço, pâncreas, estômago, intestino delgado (duodeno, jejuno e íleo, mas somente o duodeno prosseguiu para histopatologia), intestino grosso, rins, bexiga, útero, tuba uterina e ovários.

Todos os órgãos/tecidos fixados de acordo com o item anterior foram processados em várias etapas de desidratação com álcool etílico em concentrações crescentes de 70 até 100%, diafanizados com xilol, para então serem embebidos e emblocados em parafina. Em seguida, foram feitos cortes em micrótomo com lâmina de diamante e, então, corados com hematoxilina e eosina. As lâminas de cada estrutura analisada no experimento foram examinadas por um histopatologista. Foram capturadas imagens das secções histológicas de todos os órgãos de, pelo menos, 1 animal/grupo experimental, utilizando um microscópio óptico (Leica, modelo DM1000, Wetzlar, Alemanha) acoplado a uma câmera fotográfica

digital (Leica, modelo DFC295, Wetzlar, Alemanha) sob diferentes aumentos indicados nas barras de escala presentes nas fotografias.

4.6.3 Análise estatística dos dados do ensaio de toxicidade

As comparações estatísticas foram concebidas para determinar se as diferenças nas variáveis de resposta referidas acima (peso corporal, hematologia e parâmetros bioquímicos do soro e peso relativo de órgãos), entre grupos, foram atribuíveis à proteína Cry1C comparada aos grupos controle, Cry1Ac e Água, separadamente. A homogeneidade de variância foi analisada por meio da análise de variância simples (One-way ANOVA) com o “software” estatístico GraphPad Prism 6.0 (San Diego, CA, EUA). Diferenças foram consideradas significativas quando p < 0,05.

5 RESULTADOS

5.1 Histórico de uso seguro

Na Tabela 2.1, estão sumarizados os principais aspectos positivos e negativos que compõem o histórico de uso de produtos à base de Bt e das proteínas Cry de acordo com a literatura científica. Assim, é notório que existe um grande número de relatos positivos associados ao uso de formulações inseticidas Bt, não tendo sido encontrada qualquer publicação relevante sobre efeitos adversos em humanos e animais não-alvo decorrentes de ingestão dessas substâncias. Da mesma forma, proteínas Cry de Bt estão presentes há mais de 15 anos em plantas GM e não foram relatados quaisquer efeitos deletérios decorrentes do consumo das mesmas.