Produção das proteínas Cry8Ka5 e Cry1Ac em sistema heterólogo (E coli)

As etapas de expressão e purificação das entomotoxinas Cry8Ka5 e Cry1Ac foram todas realizadas no Laboratório de Interação Molecular Planta-Praga I, situado na Embrapa Cenargen (Brasília, DF). Os protocolos de produção das referidas proteínas estão descritos a seguir.

4.4.1 Expressão e purificação da Cry8Ka5

A proteína Cry8Ka5 (massa molecular aproximada de 70 kDa) foi obtida a partir da expressão do gene cry8Ka5 em E. coli BL21 (DE3), contendo o gene mutante inserido no plasmídeo pET101/D TOPO (Invitrogen), como descrito por Oliveira (2008). As células transformadas foram inoculadas em 10 mL de meio de cultura, contendo ampicilina 100 µg/mL e incubadas durante 18 h, a 37 °C, sob agitação a 175 rpm. Posteriormente, este inóculo foi adicionado a 1000 mL de meio de cultura Luria-Bertani (LB) líquido (NaCl 1%, extrato de levedura 0,5%, triptona 1%, pH 7,0), contendo ampicilina 100 µg/mL e, quando a absorbância 600 atingiu 0,8, a expressão foi induzida pela adição de 0,5 mM de IPTG, durante 6 h, a 37 °C, sob agitação a 175 rpm. Este cultivo foi centrifugado a 10.000 x g, por 10 min (Eppendorf, modelo 5810 R, Hamburgo, Alemanha), sendo o precipitado de células solubilizado em 25 mL de tampão de lise (tampão fosfato de sódio 50 mM, 300 mM NaCl, glicerol 10%, Triton X-100 0,5%, contendo 10 mg/mL de lisozima, pH 7,8) e incubado a 4

°C, durante 16 h. Após a incubação, as células foram lisadas por ultra-som em gelo (3 ciclos 60s a 70%). O produto da lise das células foi centrifugado a 12.500 x g, por 15 min, e o sobrenadante coletado foi analisado em gel de poliacrilamida 12,5% (SDS-PAGE) (LAEMMLI, 1970), como será descrito adiante. Posteriormente, o produto da expressão foi submetido à cromatografia de afinidade, utilizando-se 10 mL da resina Ni-NTA (“Nickel- Nitriloacetic Acid”). Para equilibrar a resina de níquel, foram utilizados 200 mL de solução de equilíbrio (tampão fosfato de sódio 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 10 mM, pH 7,8). O produto da expressão foi injetado na coluna com fluxo de 1 mL/minuto, a 4 °C, segundo orientações do fabricante. Em seguida, foram adicionados à resina de níquel 200 mL de tampão de lavagem (tampão fosfato de sódio 50 mM, NaCl 300 mM, 20 mM de imidazol, pH 7,8) em fluxo de 1 mL/minuto, para a eluição do material não-retido. Após a lavagem da resina, a proteína recombinante foi eluída com a adição de 100 mL de tampão de eluição (tampão fosfato de sódio 50 mM, de NaCl 300 mM, imidazol 250 mM, pH 7,8) em fluxo de 1 mL/minuto. A proteína eluída foi dialisada contra água destilada em membrana de diálise com poros de exclusão de 6-8 kDa (Fisherbrand, Pittsburgh, PA, EUA), durante 16 h, a 4 °C. Finalmente, as amostras foram liofilizadas e mantidas em local seco e arejado até o momento dos ensaios. As proteínas solúveis totais foram quantificadas pelo método de Bradford (BRADFORD, 1976), bem como foram submetidas à análise em gel de poliacrilamida 12,5% (SDS-PAGE), segundo Laemmli (1970), para determinação de sua pureza e monitoramento da produção. Ambas as metodologias serão descritas a seguir.

4.4.2 Expressão e purificação da Cry1Ac

A protoxina Cry1Ac (massa molecular aproximada de 130 kDa) foi obtida por expressão heteróloga em E. coli JM109, transformada com o plasmídeo recombinante pKK, contendo o gene cry1Ac de Bt var. kurstaki HD73 (dado não-publicado). As células foram crescidas em meio LB líquido, contendo ampicilina (1 μg/mL), a 37 °C, sob agitação a 175 rpm. Como indutor de expressão foi utilizado 1 mM de IPTG quando a absorbância 600 atingiu 0,8. Após 72 h de indução, as células foram coletadas por centrifugação (4.500 x g, por 20 min, a 10 ºC) (Eppendorf, modelo 5810 R, Hamburgo, Alemanha) e o “pellet” foi ressuspendido em tampão de lise [sacarose 15%, lisozima 2 mg/mL, EDTA (_{“Ethylenediamine Tetraacetic Acid”) 50 mM, Tris – HCl 50mM, pH 8,0], por 12 h, a 4 °C. A} suspensão foi sonicada em gelo (5 ciclos de 300s, a 70%) e centrifugada por 10.000 x g, por 15 min a 4 ºC. O _{“pellet” foi então lavado por centrifugação (10.000 x g, por 30 min a 4 °C)}

três vezes em 30 mL de solução de NaCl 0,5 M contendo Triton X-100 2%, cinco vezes em 30 mL de NaCl 0,5 M e duas vezes em 30 mL de água destilada. Em seguida, os corpos de inclusão contendo a protoxina Cry1Ac foram solubilizados em tampão de solubilização (DTT 10 mM, carbonato de sódio 50 mM, pH 10,5), por 2 h, a 37 °C, e dialisados contra água em membrana de diálise de 12 kDa. A protoxina foi ativada com tripsina 1:50 (m/m) a 37 °C, por 18 h. A proteólise foi parada com PMSF 1 mM. O material contendo a toxina Cry1Ac ativa foi novamente dialisado contra água em membrana de diálise de 12 kDa, por 24 h. A quantificação de proteínas solúveis foi feita através do método de Bradford (BRADFORD, 1976), bem como a produção, pureza e ativação da Cry1Ac (fragmento ativo com massa molecular aproximada de 70 kDa) foram monitoradas por SDS-PAGE (LAEMMLI, 1970), como descrito a seguir.

4.4.3 Quantificação de proteínas solúveis totais

A dosagem de proteínas totais solúveis foi feita pelo método de Bradford (BRADFORD, 1976). A uma alíquota de 100 µL das amostras proteicas foram adicionados 2,5 mL do reagente de Bradford (50 mL de metanol 95%, 100 mg de comassie brilliant blue G-250, 100mL de ácido fosfórico 85% e 900 mL de H2O destilada). A mistura foi agitada e

após 10 min foram feitas às leituras das absorbâncias a 595 em espectrofotômetro (Genesys 10, Spectronic Unicam, Nova Iorque, EUA). A concentração foi estimada em relação a uma curva padrão obtida com diferentes concentrações de albumina sérica bovina em NaCl 0,9%.

4.4.4 Análise das proteínas em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes (SDS- PAGE)

Para a análise da expressão, quantificação (pureza) e testes de estabilidade estrutural das proteínas, foi utilizada eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS, conforme procedimento descrito por Laemmli (1970). No geral, todas as amostras foram solubilizadas em tampão de amostra (Tris-HCl 0,0625 M, pH 6,8 com SDS 2%, glicerol, azul de bromofenol e 2-mercaptoetanol) de forma a conterem 10 g de proteína. Posteriormente, as amostras foram aquecidas a 100 °C, durante 10 min, e centrifugadas a 10.000 x g, durante 5 min, a 4 °C (Hettich, modelo Rotina 380 R, Kirchlengern, Alemanha). Em seguida, 20 L de cada amostra foram aplicados em poços feitos em um gel vertical de 1 mm de espessura, composto por géis de aplicação e separação que encerravam 5% e 12,5% de acrilamida,

respectivamente. A corrida foi conduzida a uma corrente constante de 20 mA por placa, durante 1,5 h. As bandas proteicas foram coradas com solução de coomassie brilliant blue R- 250 0,05%. A descoloração foi feita com solução de metanol, ácido acético galcial e água (1: 3,5: 8, v/v/v, respectivamente). Como padrões de massa molecular foram utilizados vários oligonucleotídeos sintéticos da BenchMark Protein Ladder (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA).

4.4.5 Determinação da pureza das amostras de proteínas de Cry8Ka5 e Cry1Ac

Para determinar a pureza das proteínas obtidas por expressão heteróloga em E. coli foram realizadas eletroforeses em géis de poliacrilamida, em condições desnaturantes, com amostras de Cry8Ka5 e Cry1Ac sob as condições descritas no item 4.4.4. A partir do perfil eletroforético foi possível determinar o percentual de cada proteína expressa em relação à presença de possíveis contaminantes na amostra total, após a realização das etapas de expressão e purificação. Para tanto, foi utilizado o software Image Master 2D platinum (v.7.0, GE Healthcare, Uppsala, Suécia) que avalia o percentual relativo de pixels que as bandas correspondentes às proteínas-alvo ocupam no gel de poliacrilamida após varredura em equipamento adequado (GE Image Scanner III, GE, Uppsala, Suécia). Essa metodologia vem sendo adotada por nosso grupo com sucesso, mostrando-se adequada para calcular a pureza de amostras de proteínas obtidas por expressão heteróloga (dados não-publicados).

4.4.6 Determinação da sequência de aminoácidos N-terminal das proteínas Cry8Ka5 e Cry1Ac

Para determinar a identidade das proteínas Cry8Ka5 e Cry1Ac produzidas procedeu-se a determinação de suas sequências N-terminais. Inicialmente, as proteínas foram corridas em géis de poliacrilamida (conforme descrito no item 4.4.4) e, em seguida, transferidas dos géis para membranas de PVDF em sistema de eletrocromia (“eletroblotting”). Para tanto, foi utilizado o equipamento TE 22 Mini Transfer Tank (Hoefer®, Holliston, MA, EUA) e o tampão de transferência (192 mM de Glicina, 25 mM de Tris-Base, 20% de Metanol). A transferência ocorreu a 100 mA, com duração de 30 min. Em seguida, as membranas com as amostras de proteínas foram coradas com solução de coomassie brilliant blue R-250 0,05%. Em seguida, as bandas proteicas foram recortadas da membrana e colocadas em microtubo de 1,5 mL, onde foram descoradas com metanol puro. As bandas proteicas incrustradas nas membranas foram utilizadas para sequenciamento, utilizando-se um

sequenciador automático de proteínas (Shimadzu, modelo PPSQ-21/23, Kyoto, Japão). O processo químico empregado pelo sequenciador para determinar a sequência de aminoácidos foi derivada do método de degradação desenvolvido por Edman (1964). As sequências obtidas foram comparadas com o banco de dados UniProtKB/Swiss-Prot disponível gratuitamente na Internet (http://web.expasy.org/), utilizando o programa FASTA3, ou com outras fontes apropriadas.

4.5 Determinação da digestibilidade in vitro e estabilidade à temperatura da proteína