Avaliação da Atividade Anti-inflamatória in vivo do Óleo de Euterpe oleracea e OEO β-CD e OEO-HP-β-CD – Modelo de edema de pata e bolsa de ar

4.6.3.1 Preparo das amostras para trabalho

Óleo, complexo de inclusão e ciclodextrina foram diluídos em DMSO 5%, como solvente. Portanto, pesou-se as amostras supracitadas de acordo com a massa em mg/Kg do camundongo e por conseguinte diluída em 500µl de solução solvente. Para o desenvolvimento dos ensaios anti-inflamatórios in vivo, pelo modelo de edema pata e bolsa de ar, apenas o sistema que exibiu melhor complexão foi testado, justificando o número de animais utilizados. Escolheu-se dentre os complexos de inclusão, o complexo OEO em β-CD, por ter

demonstrado melhor energia de interação. A escolha do complexo em ralação ao método de preparo foi o de malaxagem, por ter exibido a melhor MEV se comparado ao slurry, demonstrando melhor amorfização da amostra.

4.6.3.2 Animais

Inicialmente, foi submetido um projeto para avaliação à Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), como proposta intitulada “Avaliação da atividade anti-inflamatória de novos produtos farmacêuticos”, protocolo 031/2019, cujo Certificado nº 180.031/2019, foi aprovado em 09 de agosto de 2019.

Nos experimentos foram utilizados camundongos da linhagem Swiss (Mus musculus) de ambos os sexos (sendo as fêmeas nulíparas e não grávidas). Os animais foram mantidos no biotério do Centro de Ciências da Saúde (CCS) da UFRN, sob condições controladas de iluminação (ciclo 12 horas claro/escuro) e de temperatura (23 ± 2°C), recebendo água e ração comercial ad libitum. Os animais foram privados da alimentação apenas duas horas antes dos ensaios.

4.6.3.3 Avaliação da atividade anti-inflamatória tópica in vivo do óleo de E. oleracea – Modelo edema de pata, induzida por carragenina

O modelo de edema de pata induzido por carragenina em camundongos foi conduzido de acordo como descrito por Winter, Risley e Nuss et al. (1962), com algumas modificações quanto ao período de medição da pata. Para indução do edema de pata, os animais randomicamente separados em 6 grupos, com 5 animais (n=5) por grupo, foram submetidos à medição das suas patas trazeiras direita com um paquímetro digital. Logo em seguida, receberam injeção subplantar (10μL) de lambda-carragenina 1%, como agente inflamógeno, excetuando o grupo denominado de SAL (no qual foi administrado uma solução salina 0,9%). Por conseguinte, os camundongos foram tratados por gavagem de acordo com os seguintes grupos: SAL (solução salina a 0,9%, 500μL, controle negativo), CAR (não tratado, controle positivo) DEX (dexametasona 2,0 mg/kg, controle padrão), OEO (óleo com 50mg/kg, qsp. 500 μL), β-CD (ciclodextrina com 300mg/kg, qsp. 500 μL) e OEO-β-CD (complexo de inclusão com 300mg/kg, qsp. 500 μL). O desenho experimental da avaliação da atividade anti-inflamatória tópica por edema de pata foi descrito na Tabela 2.

Ainda com o paquímetro, as patas foram medidas em 1, 2, 3 e 4 horas após a administração da carragenina. O edema da pata foi expresso em milímetros (mm) e calculado

como a porcentagem de edema. As áreas sob as curvas do curso do tempo (AUC0–4h) foram calculadas usando a regra trapezoidal.

Tabela 2 – Desenho experimental da avaliação da atividade anti-inflamatória tópica em modelo experimental de edema de pata, induzido por carragenina, do complexo de inclusão do OEO em β-CD.

GRUPOS TRATAMENTO/DOSE

Grupo 1 – Controle negativo Solução salina 0,9% (500 μL)

Grupo 2 – Controle positivo -

Grupo 3 – Controle padrão Dexametasona (2,0 mg/kg)

Grupo 4 – Amostra 1 OEO (50mg/kg)

Grupo 5 – Amostra 2 β-CD (300mg/kg)

Grupo 6 – Amostra 3 OEO-β-CD (300mg/kg)

Legenda: OEO: Óleo de Euterpe oleracea; β-CD: beta-ciclodextrina; OEO-β- CD: complexo de inclusão com OEO em β-CD.

Os animais submetidos ao teste de edema de pata foram eutanasiados, após 4 horas da administração de carragenina, com sobredose de Tiopental (150mg/Kg, i.p.) associado a Lidocaína 2% (10 mg/Kg, i.p.), em seguida procedido o deslocamento cervical. A porção subplantar de cada pata edemaciada foi coletada, pesada e encaminhada para dosagem de atividade da mieloperoxidase. Os animais foram acondicionados em sacos plásticos apropriados e depositados em freezer especial (-18 °C) na Faculdade de Farmácia, até serem recolhidos pelo Serviço de Coleta Especial realizado pela empresa licitada pela UFRN para tal finalidade.

4.6.3.4 Mieloperoxidase em edema de pata (MPO - EP)

A atividade de MPO foi realizada segundo o método descrito por Krawisz, Sharon e Stenson (1984). Em ependorffs, o material biológico foi picotado e homogeneizado com micro-homogeinizador (Marconi MA1102) em tampão brometo de hexadeciltrimetilamonio (HTAB) na proporção 1:20 (p:v) e submetidas a sonicação (Schuster L200) por cinco minutos. As amostras foram centrifugadas a 8.285 rpm por 10 min a 4 ºC. Deste homogenato, 50 μL do sobrenadante foi adicionado ao reativo de coloração (150 μL) (dihidrocloreto de o- dianisidina, tampão fosfato de potássio e peróxido de hidrogênio a 1%) e avaliados em absorbância de 450 nm, em leitor de microplacas (Mindray MR-96A). Os resultados foram

interpolados com curva padrão com mieloperoxidase de neutrófilos humanos. Os resultados foram apresentados com U/mL de exsudato, cuja uma unidade de atividade MPO é definida como capaz de degradar 1 mmol de peróxido de hidrogênio/min a 25 ºC.

4.6.3.5 Avaliação da atividade anti-inflamatória tópica in vivo do óleo de E. oleracea – Modelo de bolsa de ar, induzido por carragenina

Para o presente ensaio, utilizou-se o modelo de bolsa de ar conforme Yoon et al. (2005). Os animais randomizados receberam 5 mL de ar estéril no dorso, por via subcutânea, para a formação da bolsa. Após 3 dias, mais 2,5mL de ar estéril foi injetado no mesmo local, para reforçar a bolsa. Seis dias após a primeira aplicação, os animais foram tratados via oral, de acordo com os grupos especificados: SAL (solução salina a 9%, 500μL, controle negativo), DEX (dexametasona 2,0 mg/kg, controle positivo), OEO (óleo com 50mg/kg, qsp. 500 μL), β-CD (ciclodextrina com 300mg/kg, qsp. 500 μL) e OEO-β-CD (complexo de inclusão com 300mg/kg, qsp. 500 μL), descritos na Tabela 3. Trinta minutos depois, 100 μL de solução carragenina (1%) foi injetada dentro da bolsa de ar formada.

Tabela 3 – Desenho experimental da avaliação da atividade anti-inflamatória tópica em modelo experimental de bolsa de ar, induzido por carragenina, do complexo de inclusão do OEO em β-CD.

GRUPOS TRATAMENTO/DOSE

Grupo 1 – Controle negativo Solução salina 0,9% (500 μL) Grupo 2 – Controle positivo Dexametasona (2,0 mg/kg)

Grupo 3 – Amostra 1 OEO (50mg/kg)

Grupo 4 – Amostra 2 β-CD (300mg/kg)

Grupo 5 – Amostra 3 OEO-β-CD (300mg/kg)

Legenda: OEO: Óleo de Euterpe oleracea; β-CD: beta-ciclodextrina; OEO-β- CD: complexo de inclusão com OEO em β-CD.

Após 6 horas, os camundongos foram eutanasiados com sobredose de Tiopental (150mg/Kg, i.p.) associado a Lidocaína 2% (10 mg/Kg, i.p.) e o exsudato, em cada bolsa de ar, foi coletado por aspiração com 2mL de solução salina estéril (0,9mg/dL). O exsudato foi submetido à centrifugação (1500 rpm/10 min/4ºC), o pellet celular foi utilizado para a contagem de leucócitos em câmara de Neubauer, após diluição em solução de Turk, e com o

sobrenadante foram realizadas determinações de citocinas inflamatórias (Interleucina 1-β (IL- 1β) e IL-10) e enzimas Glutationa (GSH) e mieloperoxidase (MPO).

4.6.3.6 Mieloperoxidase em bolsa de ar (MPO - BA)

A atividade da MPO foi realizada segundo o método descrito por Krawisz, Sharon e Stenson (1984). As amostras obtidas do exsudato da bolsa de ar, após centrifugação para retirada do pellet celular, foram resuspendidas e homogeneizada com micro-homogeinizador (Marconi MA1102) em tampão HTAB na proporção 1:20 (v:v) e submetidas a sonicação (Schuster L200) por cinco minutos. Após este processo, as amostras foram centrifugadas a 8.285 rpm por 10 min a 4 ºC. Deste homogenato, 50 μL do sobrenadante foi adicionado ao reativo de coloração (150 μL) (dihidrocloreto de o-dianisidina, tampão fosfato de potássio e peróxido de hidrogênio a 1%) e avaliados em absorbância de 450 nm, em leitor de microplacas (Mindray MR-96A). Os resultados foram interpolados com curva padrão com mieloperoxidase de neutrófilos humanos. Os resultados foram apresentados com U/mL de exsudato, cuja uma unidade de atividade MPO é definida como capaz de degradar 1 mmol de peróxido de hidrogênio/min a 25 ºC.

4.6.3.7 Dosagem de citocinas - Interleucina 1-β (IL-1β) e IL-10

Os níveis de IL-1β e IL-10 no exsudato inflamatório foram mensurados por meio da técnica de imunoabsorção enzimática pelo ensaio imunossorvente ligado a enzima (enzyme- linked immunosorbent assay- ELISA) por meio do Kit da R&D (Minneapolis, MN, EUA). O exsudato foi centrifugado a 4285 rpm a 4 ºC durante 10 min (Novatécnica NT 805), em seguida o sobrenadante foi utilizado para determinação das absorbâncias (Mindray MR-96, SP, Brasil) a 450 nm. Os resultados foram expressos em pg/mL.

4.6.3.8 Glutationa (GSH)

A determinação da GSH pela quantificação de radicais sulfidrila não proteicos (NPSH), foi realizada de acordo com Sedlak e Lindsay (1968). A cada 400 μL do exsudato inflamatório, foi adicionado 320 μL de água destilada e 80 μL de ácido tricloroacético a 50 %, os quais foram centrifugados (Novatecnica NT 805, SP, Brasil) a 3000 rpm, a 4ºC por 10 min. A partir deste processamento, 100 μl do sobrenadante foi transferido para a placa de leitura + 200 μl de tampão Tris - pH 8,9 (Tris + EDTA 0,2 M, qsp. H20). Para quantificação de NPSH

leitura das absorbâncias a 405 nm (Mindray MR-96A, SP, Brasil). Os níveis de GSH foram expressas por mg de NPHS/mL no exsudato inflamatório.

4.6.3.9 Análise estatística

Todos os resultados da concentração inibitória mínima (CIM) são apresentados como média ± desvio padrão da média, enquanto os resultados da atividade modulatória são apresentados como mediana. Os testes foram realizados em triplicata e em três repetições. Os resultados da CIM foram avaliados por análise de variância (ANOVA) bidimensional e os resultados da atividade modulatória foram avaliados por Kruskal-Wallis, seguido do teste de Dunn’s, utilizando GraphPad Prism versão 6.0 (San Diego, CA, EUA). Valores de p < 0,05 foram considerados significativos.

Os resultados obtidos dos ensaios antioxidantes são apresentados como valores médios ± desvios padrão da média. Os testes foram realizados em triplicata e avaliados por análise de variância (ANOVA) de uma via, seguido do teste de Student Newman – Keuls, utilizando

GraphPad Prism versão 6.0 (San Diego, CA, EUA). Valores de p < 0,05 foram considerados

significativos.

Os resultados da atividade anti-inflamatória são apresentados como média ± erro padrão da média (EPM), com n=5 animais por grupo. Análise de variância (ANOVA) de uma via seguido de Tukey, ou ANOVA de duas vias seguido de teste de Bonferroni, utilizando

GraphPad Prism versão 6.00 (San Diego, CA, EUA). Valores de p < 0,05 foram considerados

5 RESULTADOS

5.1 Caracterização química dos ácidos graxos do OEO por Cromatografia Gasosa