UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIENCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIENCIAS FARMACÊUTICAS
THALITA SÉVIA SOARES DE ALMEIDA MAGALHÃES
COMPLEXOS DE INCLUSÃO DO ÓLEO DE Euterpe oleracea Mart. EM (β-) OU (HP-β-) CICLODEXTRINAS E AÇÃO ANTIOXIDANTE, ANTI-INFLAMATÓRIA E
MODULATÓRIA ANTIBACTERIANA
NATAL / RN 2020
THALITA SÉVIA SOARES DE ALMEIDA MAGALHÃES
COMPLEXOS DE INCLUSÃO DO ÓLEO DE Euterpe oleracea Mart. EM (β-) OU (HP-β-) CICLODEXTRINAS E AÇÃO ANTIOXIDANTE, ANTI-INFLAMATÓRIA E
MODULATÓRIA ANTIBACTERIANA
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, para obtenção do título de Doutor (a) em Ciências Farmacêuticas. Área de concentração: Bioanálises e Medicamentos.
AUTOR DISCENTE: THALITA SÉVIA SOARES DE ALMEIDA MAGALHÃES ORIENTADOR: PROF. DR. ÁDLEY ANTONINI NEVES DE LIMA
NATAL / RN 2020
2
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS
Magalhães, Thalita Sévia Soares de Almeida.
Complexos de inclusão do óleo de Euterpe oleracea Mart. em (B-) ou (HP-B-) ciclodextrinas e ação antioxidante,
anti-inflamatória e modulatória antibacteriana / Thalita Sévia Soares de Almeida Magalhães. - 2020.
144f.: il.
Tese (Doutorado em Ciências Farmacêuticas) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Natal, RN, 2020.
Orientador: Ádley Antonini Neves de Lima.
1. Euterpe oleraceae Mart. - Tese. 2. Óleo - Tese. 3. Açaí - Tese. 4. Ciclodextrinas - Tese. 5. Complexo de inclusão - Tese. I. Lima, Ádley Antonini Neves de. II. Título.
RN/UF/BS-CCS CDU 582.521.11
RN/UF/BS-CCS CDU 582.521.11 Elaborado por ANA CRISTINA DA SILVA LOPES - CRB-15/263
Thalita Sévia Soares de Almeida Magalhães
COMPLEXOS DE INCLUSÃO DO ÓLEO DE Euterpe oleracea Mart. EM (β-) E (HP-β-) CICLODEXTRINAS E AÇÃO ANTIOXIDANTE, ANTI-INFLAMATÓRIA E MODULATÓRIA ANTIBACTERIANA
Banca Examinadora:
Natal, 19 de junho de 2020
NATAL / RN 2020
Dedico este trabalho ao meu Deus, pois é ele que me sustém e sem ele nada teria e seria. “Porque dele e por ele, e para ele, são todas as coisas.” Romanos 11:36ª.
Aos meus pais, José Cezário e Francisca Feitosa. Se algo que consegui ou realizei hoje, foi graças aos seus esforços desde o início.
Ao meu estimado professor e orientador, Dr. Ádley Antonini Neves de Lima. Profissional brilhante a quem expresso minha sincera admiração. Quão grande esforço em prontamente contribuir para o crescimento dos seus. Como exemplo, ensinando e fazendo ciência, aquecendo os corações dos pequeninos
orientandos, ao estimular fortemente o conhecimento. Ainda, a mim impulsionou o desejo de querer, e fazer e ser uma pessoa
maior em conhecimento e em coração. Agradecimentos eternos a esta pessoa grandiosa que se dedicou,
renunciando momentos de sua vida para orientação e realização deste trabalho de pesquisa. A minha gratidão e de minha família!
AGRADECIMENTOS
Ao meu Deus, por ter sonhado primeiro esse projeto para minha vida. Implantou esse desejo no meu coração e me deu condições necessárias para lutar e alcançar cada meta em seu devido tempo.
Ao meu orientador, Prof. D.Sc. Ádley Antonini Neves de Lima, que em mim acreditou e confiou, propiciando orientação, incentivo, encorajamento, motivação, colaboração e compreensão, contribuindo fortemente para o meu desenvolvimento profissional e pessoal.
Aos meus pais, José Cezario de Almeida e Francisca Feitosa Soares de Almeida, minhas inspirações de batalha, dedicação, perseverança e fé. Sempre investiram e confiram na minha vontade e capacidade de desenvolver minhas escolhas.
Aos meus irmãos, Thiago Cezar, Thales Hieron, Thalia Denise e Thayane Deyse, que estiveram ao meu lado, todo o tempo, ajudando-me a trabalhar e viver, das atividades científicas à pessoais e laborais, sempre me auxiliando.
Ao meu amado esposo, Fernando Magno Bitú Magalhães, que sempre esteve comigo em todos os momentos, me encorajando e me motivando a continuar a jornada. Dando-me o suporte emocional e até financeiro. E a minha pequena princesa Maria Fernanda, que por tantas vezes entendeu a minha auxência, mas que foi determinante para que eu não desistisse no meio da caminhada.
Aos professores e colaboradores, Prof. Dr. José Cezário de Almeida e Msc. Marília Andreza da Silva Ferreira (UFCG, Cajazeiras, Paraíba, BR), Prof. Dr. José Otávio Carréra Silva Junior e Dra. Rayanne Rocha Pereira (UFPA, Belém do Pará, Pará, BR), Prof. Dr. Euzébio Guimarães Barbosa e Sofia Santos (UFRN, Natal, Rio Grande do Norte, BR), Prof. Dr. Pedro José Rolim Neto (UFPE, Recife, Pernambubo, BR) e Pollyana Cristina de Oliveira Macedo e Stephany Yumi Kawashima Pacheco (UFRN, Natal, Rio Grande do Norte, BR), pela forte parceria e contribuição para o nosso artigio publicado na Intenational Journal Molecular Sciences (IJMS). Estimo grande prazer por contar-los como amigos.
Ao Prof. D.Sc. Attilio Converti (UniGEN, Genova, IT), pela presteza e coleguismo, pois leu, interpretou e revisou as produções cientificas resultantes deste estudo. Contribuiu fortemente com o meu aprendizado e, portanto, não posso deixar de reconhecê-lo como excelente professor e profissional.
Ao Prof. Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha (UFRN, Natal, Rio Grande do Norte, BR), e colaboradora Dra. Marília Medeiros Fernandes de Negreiros (UFRN, Natal, Rio Grande do Norte, BR) pela parceria e esforços, que também prontamente cooperaram em parte desta pesquisa em laboratórios sob a sua coordenação.
Ao Laboratório Escola de Farmácia Industrial, na coordenação do Prof. Dr. Túlio Flávio Accioly de Lima e Moura, e colaborador Edinaldo Gomes do Nascimento, localizado no Departamento de Farmácia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, pelo apoio e espaço para o desenvolvimento dos complexos e outras atividades.
As minhas amigas, mais que irmãs, Emanuele Tavares, Elayne Barros, Bárbara Queiroz, Pollyana Macedo, Fernanda Ílary, Simone Braga, Luana Carvalho, Valéria Costa, Verônica, que me auxiliaram direta ou indiretamente, quer seja por auxílio científico ou assistência, apoio e estadias em Natal, durante todo o tempo que precisei. Sou grata a Deus pela amizade de cada uma, e pela atenção e cuidados a mim dedicados. Quer seja em momentos alegres e também no enfado da caminhada, pelos carinhos, pelos beijos, pelos abraços e conselhos. Sempre se disponibilizaram a me ajudar, sem medir esforços. Colaborando ainda com a pesquisa, resultados e artigos para publicação.
Aos meus colegas Farmacêuticos, Thayse de Fátima, Maryjane Moreira, Patrícia Carvalho, Elisangela Campos, Erivan Abreu, e auxiliares de trabalho Esterlanea Silva, Edilma Lima, Joyce Mary, Anne Mary e Sebastião Almeida, em especial a minha coordenadora Dra. Maria do Desterro. Sem medir esforços me ajudaram prontamente. Torceram e acreditaram em mim.
Ao grupo de Pesquisa INOFARM, na pessoa do meu orientador Prof. D.Sc. Ádley Antonini Neves de Lima, no qual também faço parte, pela parceria, incentivo e colaboração para bom desempenho da pesquisa. Os meus sinceros agradecimentos, a todos que contribuíram para a realização deste trabalho.
“Que os vossos esforços desafiem as impossibilidades, lembrai-vos de que as grandes coisas do homem foram conquistadas do que parecia impossível.” Charles Chaplin.
Magalhães, T.S.S.d.A. COMPLEXOS DE INCLUSÃO DO ÓLEO DE Euterpe oleracea Mart. EM (β-) E (HP-β-) CICLODEXTRINAS E AÇÃO ANTIOXIDANTE, ANTI-INFLAMATÓRIA E MODULATÓRIA ANTIBACTERIANA. [tese]. Programa de pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, 2020. p. 144.
RESUMO
Óleo de Euterpe oleracea Mart. (OEO), conhecido como óleo de açaí, é comumente utilizado pela indústria de alimentos e cosméticos. Inferem-se ao OEO importantes atividades biológicas, entretanto o seu uso pela indústria farmacêutica é limitada em razão das suas propriedades físico-químicas. Complexos de inclusão têm sido utilizados para incrementar solubilidade, estabilidade e atividades biológicas de óleos vegetais. Portanto, objetivou-se no presente trabalho a obtenção e caracterização físico-química de complexos de inclusão com OEO em β-ciclodextrina (OEO-β-CD) e hidroxipropil-β-ciclodextrina (OEO-HP-β-CD) e testá-los quanto sua atividade antimicrobiana, antioxidante e anti-inflamatória. Procedeu-se a caracterização química do OEO por cromatografia gasosa acoplada ao detector de ionização por chama (CG-FID) e determinou-se a energia de interação entre o ácido oleico e ciclodextrinas. Os complexos produzidos pelos métodos de malaxagem (MX) e slurry (SL) foram caracterizados por FTIR, MEV, DR-X, TG/DTG e DSC. Avaliou-se a atividade antibacteriana expressa em Concentração Inibitória Mínima (CIM) e modulatória à fármacos, contra Staphylococcus aureus (ATCC 25932), Enterococcus faecales (ATCC 29212),
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) e Escherichia coli (ATCC 25922), atividade
antioxidante (in vitro) e anti-inflamatória (modelos de edema de pata e bolsa de ar) em camundongo Swiss. A CG-FID apresentou o ácido oleico (47,58%), como o principal constituinte do óleo. Complexos de inclusão com β-CD e HP-β-CD demonstraram eficiência de encapsulação, com uma melhor energia de interação entre ácido oleico e β-CD (-41,28 ± 0,57 kJ/mol). Os resultados da caracterização físico-química demonstraram complexação entre OEO e ambas ciclodextrinas e métodos de preparos propostos, sem grandes variações. Contudo, complexos OEO-β-CD(MX) exibiram menor perda de massa e variação energética em faixas de 30-130ºC, relacionada à perda de água durante o seu preparo, sugerindo melhor eficiência de complexação. As CIM revelaram que complexos melhoraram a atividade do OEO, especialmente OEO-β-CD(SL), contra todas as cepas bactérias utilizadas. A resposta modulatória de OEO, OEO-β-CD(MX), OEO-β-CD(SL) e OEO-HP-β-CD(SL) mostraram um efeito sinérgico à ampicilina contra E. coli, embora mantiveram a atividade biológica de outros antibióticos. A atividade de sequestro de radical OH- demonstrou sinergismo entre a CD e OEO com uso do OEO-HP-β-CD(MX), exibindo aumento em 437% da atividade do óleo, enquanto ambos complexos preparados por SL demonstrou potencializar a atividade de poder redutor em 208%. O tratamento em edema de pata com OEO-β-CD(MX) reduziu em 200% do edema e 112% da atividade de MPO. Em modelo de bolsa de ar este tratamento exibiu redução nos índices de leucócitos, MPO e IL-1β, enquanto glutationa e IL-10 foram aumentadas, demonstrando potencializar o efeito anti-inflamatório do OEO. As respostas farmacológicas exibidas pelos complexos são amplamente relevantes, uma vez que subsidia estudos para o desenvolvimento de novas formulações farmacêuticas, bem como novos testes de dose-resposta e segurança.
ABSTRACT
Euterpe oleracea Mart. (OEO), known as açaí oil, is commonly used by the food and
cosmetics industry. The OEO presents important biological activities, however its use by the pharmaceutical industry is limited due to its physicochemical properties. Inclusion complexes have been used to increase solubility, stability and biological activities of vegetable oils. Therefore, the objective of this study was to obtain inclusion complexes with OEO in β-cyclodextrin (OEO-β-CD) and hydroxypropyl-β-β-cyclodextrin (OEO-HP-β-CD), perform the physicochemical characterization of each product and test their antimicrobial, antioxidant and anti-inflammatory activity. The chemical characterization of the OEO was carried out by gas chromatography coupled to a flame ionization detector (CG-FID) and the interaction energy between oleic acid and cyclodextrins was determined. The complexes obtained through kneading (KND) and slurry (SL) were characterized by FTIR, MEV, DR-X, TG/DTG and DSC. The antibacterial activity expressed in Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and the modulatory activity against drugs were evaluated against Staphylococcus aureus (ATCC 25932), Enterococcus faecales (ATCC 29212), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) and
Escherichia coli (ATCC 25922), was evaluated (in vitro) and anti-inflammatory (models of
paw edema and air sac) in Swiss mice. CG-FID presented oleic acid (47.58%) as the main constituent of the oil. Inclusion complexes with β-CD and HP-β-CD demonstrated encapsulation efficiency, with a better interaction energy between oleic acid and β-CD (-41.28 ± 0.57 kJ/mol). The results of the physical-chemical characterization showed complexation between OEO and both cyclodextrins and proposed preparation methods, without great variations. However, OEO-β-CD (KND) exhibited smaller mass loss and energy variation in ranges of 30-130ºC, related to the loss of water during their preparation, suggesting better complexation efficiency. MICs revealed that complexes improved OEO activity, especially OEO-β-CD (SL), against all the bacterial strains used. The modulatory response of OEO, OEO-β-CD (MX), OEO-β-CD (SL) and OEO-HP-β-CD (SL) showed a synergistic effect to ampicillin against E. coli, although they maintained biological activity of the other antibiotics. The OH- radical scavenging activity demonstrated synergism between CD and OEO with the use of OEO-HP-β-CD (MX), showing an increase of 437% in oil activity, while both complexes prepared by SL demonstrated enhancement of the reducing power activity by 208%. The treatment with OEO-β-CD (MX) reduced the paw edema by 200% and 112% of MPO activity. In an air bag model, this treatment showed a reduction in leukocyte, MPO and IL-1β indices, while glutathione and IL-10 were increased, demonstrating an enhancement of the anti-inflammatory effect of OEO. The pharmacological responses displayed by the complexes are highly relevant, since it supports studies for the development of new pharmaceutical formulations, as well as new dose-response and safety tests.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estrutura molecular dos principais ácidos graxos e metabólitos secundários identificados em óleo de Euterpe oleracea Mart. Fonte: própria. Moléculas geradas no Marvin Sketch a partir de SMILES obtidos no banco de dados molecular PubChem...28 Figura 2. (A) Moléculas de α-, β- e γ-CD (ciclodextrinas); (B) Representação do complexo de inclusão do ligante em ciclodextrinas... 33 Figura 3. Cromatograma do OEO obtido por cromatografia gasosa acoplada ao detector
de ionização por chama...72 Figura 4. Representação esquemática dos complexos de inclusão obtidos. (A)
βCD:ácido oleico e (B) HPββCD:ácido oleico de energias de interação ΔG = -41.28 ± 0.57 kJ/mol e ΔG = 25.15 ± 0.044 kJ/mol, respectivamente. As imagens foram obtidas com o software UCSF-Chimera (PETTERSEN et al., 2004)...74 Figura 5. Espectros de OEO (A), β-CD (B), OEO-β-CD MX (C), OEO-β-CD SL (D),
HP-β-CD (E), OEO-HP-β-CD MX (F) e OEO-HP-β-CD SL (G)...76 Figura 6. MEV de β-CD (A) e HP-β-CD (B), em aumento de 800x...78 Figura 7. MEV de β-CD (A), HP-β-CD (B), OEO-β-CD MX (C), OEO-HP-β-CD MX (D), OEO-β-CD SL (E), e OEO-HP-β-CD SL (F), em aumento de 100x...79 Figura 8. Difratogramas da β-CD (A); OEO-β-CD MX (B); OEO-β-CD SL (C);
HP-β-CD (D); OEO-HP-β-HP-β-CD MX (E); OEO-HP-β-HP-β-CD SL (F)...80 Figura 9. Curvas de TG/DTG para OEO, β-CD e complexos de (OEO-β-CD) obtidos por MX e SL (A); e Curvas de TG/DTG para OEO, HP-β-CD, e complexos de (OEO-HP-β-CD) obtidos por MX e SL (B)...81 Figura 10. Curvas de DSC para OEO, β-CD e complexos de (OEO-β-CD) obtidos por MX e SL (A); e Curvas de DSC para OEO, HP-β-CD, e complexos de (OEO-HP-β-CD) obtidos por MX e SL (B)...83 Figura 11. Efeito modulador do óleo de E. oleracea (OEO) e complexos β-ciclodextrina (OEO-βCD) e Hidroxipropil-β-ciclodextrina (OEO-HP-β-CD) em combinação com: (A) Ampicilina (AMP) e (B) Piperacilina + Tazobactam (PIP+TAZ) contra
E. coli; (C) Ciprofloxacino (CIP) e (D) PIP+TAZ contra P. aeruginosa; (E)
Vancomicina (VAN) e (F) CIP contra S. aureus, comparado com o efeito desses antibióticos isoladamente. Os complexos de inclusão foram preparados por
malaxado (MX) ou slurry (SL). As diferenças comparadas com o controle foram consideradas estatisticamente significativas, quando P <0,05...88 Figura 12. Capacidade sequestradora de radical hidroxila de OEO, β-CD, HP-β-CD e
complexos OEO-β-CD e OEO-HP-β-CD, preparados por malaxado (M) ou
slurry (S), em concentrações de 0,25, 0,5, 1,0 e 1,5 mg/mL. Letras diferentes
representam diferença significativa entre diferentes concentrações da mesma amostra; números diferentes representam diferença significativa entre amostras diferentes na mesma concentração (P < 0.05)...92 Figura 13. Capacidade antioxidante total do OEO, β-CD, HP-β-CD e complexos
OEO-β-CD e OEO-HP-β-OEO-β-CD, preparados por malaxado (M) ou slurry (S). Letras diferentes representam diferença significativa entre as amostra...97 Figura 14. Poder redutor de OEO, β-CD, HP-β-CD e complexos OEO-β-CD e OEO-HP-β-CD, preparados por malaxado (M) ou slurry (S). Letras diferentes representam diferença significativa entre diferentes concentrações da mesma amostra; números diferentes representam diferença significativa entre amostras diferentes na mesma concentração (p < 0.05)...99 Figura 15. (A) Curva de evolução temporal do edema; (B) Área sob a curva para a
porcentagem de edema de pata em função do tempo (ASC 0-4 h); e (C)
Atividade de mieloperoxidase (MPO). Valores de p foram considerados com
#
p<0,05, ##p<0,01 e ###p<0,001, comparados ao grupo controle (carragenina),
após ANOVA de uma via seguido de teste de Tukey...102 Figura 16. (A) Contagem total de leucócitos realizada em câmara de Neubauer; (B)
Atividade de mieloperoxidase (MPO); e (C) Glutationa (GSH). Tratamento com OEO e complexo OEO-β-CD em inflamação em bolsa de ar induzida por carragenina. Cada coluna representa a média dos valores obtidos em cinco animais, e as linhas verticais indicam os desvios padrão da média. Valores de p foram considerados com #p<0,05, ##p<0,01 e ###p<0,001, comparados ao grupo
controle (carragenina), após ANOVA de uma via seguido de teste de Tukey105 Figura 17. (A) Atividade de interleucina 1-β (IL-1β); e (B) IL-10. Tratamento com OEO e complexo OEO-β-CD em inflamação em bolsa de ar induzida por carragenina. Valores de p foram considerados com #p<0,05, ##p<0,01 e ###p<0,001,
comparados ao grupo controle (carragenina), após ANOVA de uma via seguido de teste de Tukey. ...107
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Concentração inicial das amostras em estudo e antibióticos adotados para cada cepa bacteriana testada em ensaio de modulação de fármacos...63 Tabela 2. Desenho experimental da avaliação da atividade anti-inflamatória tópica em
modelo experimental de edema de pata, induzido por carragenina, do complexo de inclusão do OEO em β-CD...68 Tabela 3. Desenho experimental da avaliação da atividade anti-inflamatória tópica em modelo experimental de bolsa de ar, induzido por carragenina, do complexo de inclusão do OEO em β-CD...69 Tabela 4. Composição de ácidos graxos do OEO por cromatografia gasosa acoplada ao detector de ionização por chama (CG-FID)...72 Tabela 5. Bandas de absorção na região do infravermelho, correspondente ao OEO, ciclodextrinas e seus complexos de inclusão...77 Tabela 6. Resultados da análise de termogravimetria em termos de perda de massa (%) nas faixas de temperatura 40-200 °C, 200-400 °C e 400-600 °C...82 Tabela 7. Valores médios da Concentração Inibitória Mínima (μg.mL-1)...86 Tabela 8. Capacidade sequestradora de radical superóxido de OEO, β-CD e complexos
OEO-β-CD preparados por malaxado (MX) ou slurry (SL), em concentrações de 100, 250 e 500 µg/mL...91 Tabela 9. Capacidade quelante de íons Fe2+ de OEO, β-CD e complexos OEO-β-CD preparados por malaxado (MX) ou slurry (SL), em concentrações de 100, 500, 1000 e 2000 µg/mL...94 Tabela 10. Capacidade sequestradora de quelar íons Cu2+ de OEO, β-CD e complexos OEO-β-CD preparados por malaxado (MX) ou slurry (SL), em concentrações de 100, 500, 1000 e 2000 µg/mL...96
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
ABTS 3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid
AMP Ampicilina
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ATCC American Type Culture Collection
ATR Attenuated Total Reflectance
BGN Bacilos Gram-negativos
BHI Brain Heart Infusion
CAQ Casa da Química Indústria e Comércio
CAR Carragenina
CAT Capacidade antioxidante total
CDs Ciclodextrinas
CG-FID Cromatografia gasosa acoplada ao detector de ionização por chama
CIM Concentração Inibitória Mínima
CIP Ciprofloxacino
CLSI Clinical and Laboratory Standard Institute
CO2 Dióxido de Carbono
DEX Dexametasona
DHBA Intermediário ácidodi-idroxibenzoico
DMSO Dimetilsulfóxido
DNAse Desoxirribonuclease
DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl
DR-X Difratograma de Raio-X
DSC Calorimetria exploratória diferencial
EDTA Ácido etilenoaminoacético
EHEC Escherichia coli enterohemorrágica
ENTEROTOXINAS LT Toxinas termolábil ENTEROTOXINAS ST Toxinas termoestável
EPEC Escherichia coli enteropatogênica
FAMEs Fatty acid methyl ester
FID Flame Ionization Detectation
FTIR Espectroscópica infravermelho transformada de Fourier
GEN Gentamicina
GR Glutationa redutase
GROMACS Groningen machine for Chemical Simulations
GROMOS Campo de força para simulação de dinâmica molecular
GSH Glutationa
GSH-Px Glutationa peroxidase
GSSG Glutationa dissulfeto
HGT Horizontal gene transfer
HP-β-CD Hidroxipropil-β-ciclodextrina
HTAB Brometo de hexadeciltrimetilamônio
ICAM-1 Expressão da molécula de adesão intercelular-1
IFN-α Interferon-alfa
IL Interleucina
KOH/g Hidróxido de Potássio/grama
LIE Linear Interaction Energy
LPS Lipopolissacarído
MEV Microscopia Eletrônica de Varredura
MHA Ágar Muller-Hinton
MHC Complexo maior de histocompatibilidade MPO - BA Mieloperoxidase em bolsa de ar
MPO - EP Mieloperoxidase em edema de pata
MRSA Staphylococcus aureus meticilina resistente
MX Malaxado
NaCl Cloreto de Sódio
NBT Nitroblue Tetrazolium
OEO Óleo de Euterpe oleracea
OEO-HP-β-CD Óleo de E.oleracea-hidroxipropil-beta-ciclodextrina
OEO-β-CD Óleo de E. oleracea-beta-ciclodextrina
PAMPs Padrões Moleculares Associados aos Patógenos
PCR Polymerase Chain Reaction
PIP+TAZ Piperacilina + Tazobactam PLASMÍDEOS-COL Plasmídeos Colinas
PYR L-Pyrrolidonyl-Beta-Naphytylamide
RDC Resolução da Diretoria Colegiada
RH Rancidez Hidrolítica
RM-β-CD metil-β-ciclodextrina randomizada
ROS Espécies Reativas de Oxigênio
rRNA-DNA RNA ribossomal – Ácido Desoxirribonucleico SB-β-CD sulfo-butil-éter-β-ciclodextrina
SL slurry
STEC Shiga (stx1/stx2) Shiga toxin-producing
sTNFR Receptores TNF solúvel
TCA Ácido tricloroacético
TG Análise Termogravimétrica
TGF-β Fator de crescimento transformador-β
TNF Fator de Necrose Tumoral
TOB Tobramicina
UTI Unidade de Terapia Intensiva
UV Ultra Violeta
VAN Vancomicina
WHO World Health Organization
α-CD Alfa-ciclodextrina
β-CD Beta-ciclodextrina
LISTA DE SÍMBOLOS, UNIDADES E GRANDEZAS
α Alfa
β Beta
γ Gama
∆H Variação de entalpia
∆S Variação de espaço, posição.
ΔG Energia livre de Gibbs
Δm Variação de massa
Δt Variação de tempo
°C Grau Celcius
°C/min. Grau Celcius por minuto
% Percentual
nm Nanômetro
mm Milímetro
Å Angston
µS/cm microsiemens por centímetro
Kg Quilograma
g Grama
g.mol− Grama mol
mg/kg Miligramas por quilogramas μg.mL-1
Micrograma por mililitro pg/mL Picograma por mililitro
mmol milimol
mg/mL Miligrama por mililitro
mL mililitro
μL microlitro
mL/min. mililitro por minuto µL/pata Microlitro por pata
U/mL Unidade por mililitro
μS Microsiemens
pH Potencial Hidrogeniônico
h Hora
min. Minuto
s Segundo
kJ/mol Quilojoule por mol
J/g Joule por grama
p:v Peso-volume
± Mais ou menos
n Número
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 20 2 OBJETIVOS 23 2.1 GERAL 23 2.2 ESPECÍFICOS 23 3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 25
3.1 Euterpe oleracea Mart. 25
3.1.1 Caracterização física do Óleo de Euterpe oleracea Mart. 26 3.1.2 Composição química do Óleo de Euterpe oleracea Mart. 28 3.1.3 Atividades farmacológicas do Óleo de Euterpe oleracea Mart. 29 3.1.4 Limitações e avanços do uso de OEO pela indústria farmacêutica 30
3.2 Ciclodextrinas 32
3.2.1 Ciclodextrinas quimicamente modificadas 34
3.3 Caracterização de Complexos de Inclusão 36
3.3.1 Modelagem Molecular (MM) 36
3.3.2 Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Forrier (FTIR) 37
3.3.3 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) 37
3.3.4 Difração raios-x (DR-X) 38
3.3.5 Análise Termogravimétrica (TG) 38
3.3.6 Calorimetria Diferencial Exploratória (DSC) 38
3.4 Ação bacteriana, oxidativa e inflamatória e mecanismos de defesa do
organismo vivo 39
3.4.1 Resistência aos antimicrobianos e as terapêuticas aos multirresistentes
bacterianos 39
3.4.1.1 Caracterização de Bactérias Gram-positivas e Gram-negativas: Enterococcus faecales, Staphylococcus aureus, Pseudômonas aeruginosa e Escherichia coli 41
3.4.2 Estresse Oxidativo e Atividade Antioxidante 49
3.4.3 Ação inflamatória e Mecanismos de Defesa do Organismo Vivo 52
3.4.3.1 Neutrófilos 53 3.4.3.2 Mieloperoxidase (MPO) 54 3.4.3.3 Glutationa (GSH) 54 3.4.3.4 Citocinas 55 4 MATERIAL E MÉTODOS 57 4.1 Material 57
4.2 Caracterização química dos ácidos graxos do OEO por Cromatografia Gasosa acoplada ao detector de ionização de chama (CG-FID) 58 4.3 Determinação da energia de interação entre o ácido oleico e β-CD ou
HP-β-CD 58
4.4 Obtenção dos complexos de inclusão entre OEO e β-CD ou HP-β-CD 59
4.4.1 Malaxagem 59
4.4.2 Slurry 60
4.5 Caracterização Físico-química dos Complexos de Inclusão OEO-β-CD e
OEO-HP-β-CD 60
4.5.1 Caracterização espectroscópica por Infravermelho com transformada de
Fourier (FTIR) 60
4.5.2 Caracterização morfológica por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) 60 4.5.3 Caracterização cristalina por Difração de Raio-X (DR-X) 60 4.5.4 Caracterização Termoanalítica por Análise Termogravimétrica (TG) 61
4.5.5 Caracterização Termoanalítica por Calorimetria Exploratória Diferencial
(DSC) 61
4.6 Avaliação das atividades farmacológicas do Óleo de Euterpe oleracea e
complexos de inclusão OEO-β-CD e OEO-HP-β-CD 61
4.6.1 Avaliação da Atividade Antimicrobiana do Óleo de Euterpe oleracea e
OEO-β-CD e OEO-HP-OEO-β-CD 61
4.6.1.1 Bactérias Utilizadas Para Ensaios Antibacterianos 61
4.6.1.2 Preparo das amostras para trabalho 61
4.6.1.3 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) 62
4.6.1.4 Avaliação da Atividade Modulatória de Fármacos com Óleo de Euterpe
oleracea e OEO-β-CD e OEO-HP-β-CD 62
4.6.2 Avaliação da Atividade Antioxidante do Óleo de Euterpe oleracea e
OEO-β-CD e OEO-HP-β-OEO-β-CD 63
4.6.2.1 Preparo das amostras para trabalho 63
4.6.2.2 Avaliação da capacidade do sequestro de íons superóxido (O2-) 64
4.6.2.3 Avaliação da capacidade do sequestro de radical hidroxila (OH-) 64
4.6.2.4 Avaliação da capacidade quelante de ferro (Fe2+) 65
4.6.2.5 Avaliação da capacidade quelante de cobre (Cu2+) 65
4.6.2.6 Avaliação da Capacidade Antioxidante Total (CAT) 65
4.6.2.7 Avaliação do poder redutor (PR) 66
4.6.3 Avaliação da Atividade Anti-inflamatória in vivo do Óleo de Euterpe oleracea e OEO-β-CD e OEO-HP-β-CD – Modelo de edema de pata e bolsa de ar 66
4.6.3.1 Preparo das amostras para trabalho 66
4.6.3.2 Animais 67
4.6.3.3 Avaliação da atividade anti-inflamatória tópica in vivo do óleo de E. oleracea – Modelo edema de pata, induzida por carragenina 67
4.6.3.4 Mieloperoxidase em edema de pata (MPO - EP) 68
4.6.3.5 Avaliação da atividade anti-inflamatória tópica in vivo do óleo de E. oleracea – Modelo de bolsa de ar, induzido por carragenina 69
4.6.3.6 Mieloperoxidase em bolsa de ar (MPO - BA) 70
4.6.3.7 Dosagem de citocinas - Interleucina 1-β (IL-1β) e IL-10 70
4.6.3.8 Glutationa (GSH) 70
4.6.3.9 Análise estatística 71
5 RESULTADOS 72
5.1 Caracterização química dos ácidos graxos do OEO por Cromatografia Gasosa Acoplada ao Detector de Ionização por Chama (CG-FID) 72 5.2 Determinação da energia de interação entre o ácido oleico e β-CD e
HP-β-CD 74
5.3 Caracterização Físico-química dos Complexos de Inclusão OEO-β-CD e
OEO-HP-β-CD 75
5.3.1 Infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) 75
5.3.2 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) 78
5.3.3 Difratograma de Raio-X (DR-X) 79
5.3.4 Análise Termogravimétrica (TG) 80
5.3.5 Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC) 82
5.4 Desempenho das atividades farmacológicas do Óleo de Euterpe oleracea e
complexos de inclusão OEO-β-CD e OEO-HP-β-CD 85
5.4.1 Atividade antibacteriana pela Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) do óleo de E. oleracea, β-CD, HP-β-CD e complexos
5.4.2 Atividade moduladora de fármacos do óleo de E. oleracea e complexos
OEO-β-CD e OEO-HP-OEO-β-CD 87
5.4.3 Atividade antioxidante do óleo de E. oleracea, β-CD, HP-β-CD e complexos
OEO-β-CD e OEO-HP-β-CD 90
5.4.3.1 Sequestro de íons superóxido (O2-) 90
5.4.3.2 Sequestro de radical hidroxila (OH-) 92
5.4.3.3 Atividade quelante de ferro (Fe2+) 94
5.4.3.4 Atividade quelante de cobre (Cu2+) 95
5.4.3.5 Atividade antioxidante total (CAT) 97
5.4.3.6 Poder redutor (PR) 98
5.4.4 Atividade anti-inflamatória do Óleo de Euterpe oleracea Mart. e complexo
OEO-β-CD 100
5.4.4.1 Efeito do OEO e complexo OEO-β-CD em modelo de edema de pata induzido
por carragenina em camundongos 101
5.4.4.2 Efeito do OEO e OEO-β-CD em modelo de bolsa de ar induzida por
carragenina em camundongos 104
6 CONCLUSÃO 109
REFERENCIAS 112
APENDICES 136
APENDICE I – PATENTE RELACIONADA À TESE E DEPOSITADA NO INSTITUTO NACIONAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL (INPI). NÚMERO DO REGISTRO - BR1020180767933. Intitulada: “Sistemas Binários do Óleo Essencial
de Açaí e Cicloamiloses”. 137
APENDICE II – ARTIGO PUBLICADO NA INTENATIONAL JOURNAL MOLECULAR SCIENCES. Intitulado: Development and evaluation of antimicrobial and modulatory activity of inclusion complex of Euterpe oleracea Mart oil and β-cyclodextrin or HP- β-β-cyclodextrin. Publicado em: 31 de Janeiro de 2020, DOI:
http://dx.doi.org/10.3390/ijms21030942. 139
APENDICE III – ARTIGO PUBLICADO NA BIOMOLÉCULES. Intitulado: The use of Euterpe oleracea Mart. as a new perspective for disease treatment and prevention. Publicado em: 26 de Maio de 2020, DOI:
http://dx.doi.org/10.3390/biom10060813. 141
APENDICE IV – CAPÍTULO DE LIVRO PUBLICADO. Intitulado: Avaliação da atividade antimicrobiana e modulatória de complexos de inclusão de óleo de Euterpe
oleracea Mart. e β-ciclodextrina e HP-β-ciclodextrina. Em: Diversidade microbiana da
Amazônia. Oliveira, L.A. [et al.]. v. 3. Manaus: Editora INPA, 2019. ISBN
1 INTRODUÇÃO
A utilização de compostos naturais tem sido evidenciada pela presença de constituintes químicos capazes de prevenir e tratar doenças, inclusive permitindo o desenvolvimento de alternativas farmacológicas. As espécies oleaginosas tem sido alvo de estudos pelas suas variadas propriedades biológicas. O óleo da Copaifera multijuga, por exemplo, tem apresentado potencial ação anti-inflamatória, antibacteriana e antifúngica (VEIGA- JUNIOR et al., 2007; TOBOUTI et al., 2017), enquanto o azeite de oliva destaca-se pela sua atividade antioxidante (RUFINO et al., 2011). Dentre tais espécies, podemos identificar as plantas do gênero Euterpe oleracea Mart., conhecida popularmente como açaizeiro, tem sido evidenciada pela sua importância à indústria alimentícia, cosmética e farmacêutica.
Euterpe oleracea Mart. é uma palmeira, pertencente à família Arecaceae, que crescem
abundantemente no Brasil, em especial na região do Pará, Amazonas, Tocantins, Maranhão e Amapá (MACEDO, 1995; YAMAGUCHI et al., 2015). Os frutos dessa vegetação são ricos em açúcares, ácidos graxos, vitaminas, sais minerais, flavonoides e polifenóis, sendo assim, bem utilizados pela indústria de alimentos na produção de bebidas, doces e sorvetes (OLIVEIRA et al., 1998; SOUZA et al., 2017; DIAS-SOUZA et al., 2018).
Deste fruto pode-se extrair o óleo do açaí (OEO), composto em sua maioria por material saponificável, sendo ácidos graxos, de cadeias longas e insaturadas, como constituinte majoritário o ácido oleico (BRIAN, 1998; GALOTTA; BOAVENTURA, 2005). Em uma menor concentração estão os compostos insaponificáveis, os fitoesteróides, como beta-sitosferol, stigmasterol e campesterol, utilizados como adjuvante em cosméticos preventivo do envelhecimento cutâneo, e os ácidos fenólicos, possuidores de propriedades antioxidantes, implicando ao óleo vasta aplicação cosmética e farmacológica (PACHECO-PALENCIA et al., 2008; KANG et al., 2012; GARZÓN et al., 2017; CEDRIM; BARROS; NASCIMENTO, 2018).
Estudos afirmam que OEO possue ação antidiarreica (PLOTKIN E BALICK, 1984), anti-inflamatória e antinociceptiva (FAVACHO et al., 2011), efeito inibitório frente à
Staphylococcus aureus (MELHORANÇA FILHO; PEREIRA, 2012), ação antiproliferativa
(PACHECO-PALENCIA et al., 2008), antioxidante (RUFINO et al., 2011), e efeito antiateratogênico (SOUZA et al., 2017). Ainda é descrito na literatura por ausência de genotoxicidade (MARQUES et al., 2016).
Apesar do grande interesse e vasto arsenal farmacológico pertinente aos óleos, em especial ao OEO, a sua utilização pode ser limitada por parte da indústria farmacêutica em virtude da baixa solubilidade. Com a finalidade de solucionar este problema, fármacos podem ser complexados com diferentes compostos que geralmente são usados para melhorar suas propriedades físico-químicas. Entre estas, as ciclodextrinas (CD) são as mais utilizadas (AGUIAR et al., 2014; GALVÃO et al., 2015; NASCIMENTO et al., 2015; VIKAS et al., 2018), seguidas por polímeros como o polietilenoglicol, óxido de polietileno, álcool polivinílico e polivinilpirrolidona (MIRANDA et al., 2009).
As ciclodextrinas têm sido utilizadas como excipiente farmacêutico, principalmente para solubilizar fármacos com baixa solubilidade. Além de apresentarem características físico-químicas estáveis, capazes de proteger moléculas hóspedes da degradação pelo trato gastrointestinal, proporcionam fotoestabilidade e estabilidade térmica, protege da oxidação, reduz efeitos fisiológicos e características organolépticas indesejadas, volatilidade de fármacos e toxicidade (SOARES SOBRINHO et al., 2012; QUINTANS et al. 2017; RAMOS et al., 2018; FERREIRA et al., 2018; CARNEIRO et al. 2019).
São compreendidas por oligossacarídeos cíclicos, compostos por unidades D-glicopiranosídicas. As ciclodextrinas mais conhecidas são alfa-ciclodextrina (α-CD), beta-ciclodextrina (β-CD) e gama-beta-ciclodextrina (γ-CD), sendo também as mais utilizadas. Estas são provenientes de origem natural, possuidoras de caráter cristalino, não higroscópico e industrializável (KURKOV; LOFTSSON, 2013; CARNEIRO et al., 2019).
Entretanto, a utilização destas ciclodextrinas ainda podem ser substituída por ciclodextrinas quimicamente modificadas, como hidroxi-propil-β-ciclodextrina (HP-β-CD), sulfo-butil-éter-β-ciclodextrina (SB-β-CD), ou metil-β-ciclodextrina randomizada (RM-β-CD). Estas são derivados semissintéticos de CD que oferecem uma variação na sua capacidade de inclusão, melhor solubilidade aquosa e estabilidade, e ainda menor toxicidade. Estes fatores são atribuídos às alterações das suas propriedades físico-químicas originais pelos substituintes ligantes (RODRIGUES DE LIMA, 2012, PINHEIRO et al., 2017).
Com o intuito de desenvolver complexos de inclusão com óleos, a fim viabilizar suas características físico-químicas, concebem-se formulações capazes de melhorar sua função e aplicação farmacológica. Desta forma o produto torna-se quimicamente estável e seus constituintes são protegidos, ao passo que é reduzida a sua exposição a fatores ambientais e microbiológicos. Além destes benefícios, a formação de complexos de inclusão com OEO pode melhorar a sua solubilidade, promover a estabilidade oxidativa contra efeitos da foto
sensibilidade ou temperatura, impedir a rancidez hidrolítica e até incrementar as suas atividades farmacológicas.
Contudo, percebe-se a importância da utilização de tecnologias farmacêuticas, no tocante ao desenvolvimento de complexos de inclusão com óleos. O impedimento da degradação ou volatilização de componentes do óleo, estabilidade físico-química e potencialização da sua atividade biológica podem conceber uma nova formulação farmacêutica à sua função e aplicação farmacológica.
Este trabalho tem como objetivo desenvolver complexos de inclusão do óleo de E.
oleracea Mart. em β-CD e HP-β-CD preparada por malaxado e slurry a fim de melhorar
propriedades físico-químicas do óleo, como sua solubilidade, estabilidade e atividade farmacológicas. A formação dos complexos de inclusão foi inicialmente avaliada pela determinação da energia de interação entre ácido oleico (o principal componente do óleo) e ciclodextrinas, em seguida estudos comparativos à modelagem molecular foram desenvolvidos por espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier (FTIR), microscopia exploratória de varredura (MEV), difração de raios-X em pó (DR-X), análise termogravimétrica (TG/DTG) e calorimetria de varredura diferencial (DSC).
Ainda, a fim de avaliar o potencial biológico de complexos de inclusão do OEO em β-CD (OEO-β-β-CD) e OEO em HP-β-β-CD (OEO-HP-β-β-CD), sucedeu-se a teste de atividade antioxidante (in vitro), antibacteriana (in vitro) e anti-inflamatória (in vivo) do óleo e seus complexos de inclusão. Procedeu-se também a ensaios de atividade modulatória a fármacos antibacterianos, uma vez que este teste permite avaliar possível efeito sinérgico ou antagônico à fármacos antimicrobianos conhecidos e comumente utilizados na prática clínica laboratorial, como também no tratamento de doenças nosocomiais e hospitalares.
2 OBJETIVOS
2.1 GERAL
Desenvolver complexos de inclusão do óleo de Euterpe oleracea Mart. em (β-) ou (HP-β-) ciclodextrinas para avaliação da ação antioxidante, anti-inflamatória e modulatória antibacteriana.
2.2 ESPECÍFICOS
Caracterizar quimicamente os ácidos graxos do óleo de Euterpe oleracea Mart. (OEO) por cromatografia gasosa acoplada ao detector de ionização por chama (CG-FID); Determinar a energia de interação entre óleo de E. oleracea Mart. e β-CD ou HP-β-CD
pela Dinâmica molecular;
Obter complexos de inclusão com óleo de E. oleracea Mart. e β-CD ou HP-β-CD, a saber: (OEO-β-CD) e (OEO-HP-β-CD), pelos métodos de Malaxagem e Slurry; Caracterizar o óleo de E. oleracea, ciclodextrinas e complexos de inclusão OEO-β-CD
e OEO-HP-β-CD espectroscopicamente por infravermelho médio com transformada de Fourier (FTIR);
Caracterizar a morfologia e perfil de cristalização dos complexos de inclusão OEO-β-CD e OEO-HP-β-OEO-β-CD por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) e Difração de Raios – X (DR-X);
Analisar termicamente o óleo de E. oleracea, ciclodextrinas e complexos de inclusão OEO-β-CD e OEO-HP-β-CD por Análise Termogravimétrica (TG/DTG) e Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC);
Determinar da Concentração Inibitória Mínima (CIM) “in vitro” do óleo de E.
oleracea e complexos de inclusão OEO-β-CD e OEO-HP-β-CD por microdiluição em
caldo contra cepas bacterianas: Enterococcus faecales, Staphylococcus aureus,
Pseudômonas aeruginosa e Escherichia coli.
Desenvolver ensaio de modulação a fármacos “in vitro” com óleo de E. oleracea e complexos de inclusão OEO-β-CD e OEO-HP-β-CD;
Avaliar a atividade antioxidante “in vitro” do óleo de E. oleracea e complexos de inclusão OEO-β-CD e OEO-HP-β-CD;
Testar a atividade anti-inflamatória “in vivo” do óleo de E. oleracea e complexos de inclusão OEO-β-CD preparados por malaxado, pelos modelos de edema de pata e modelo de bolsa de ar.
3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
3.1 Euterpe oleracea Mart.
Euterpe oleracea Mart. (EO), pertencente à família Arecaceae, são popularmente
conhecida como açaizeiros e cresce abundantemente no Brasil, nos Estados do Amapá, Maranhão, Pará, Tocantins e no Mato Grosso (MACEDO, 1995; YAMAGUCHI et al., 2015). Entretanto as maiores áreas ocupadas com essa vegetação, encontram-se na Amazônia Oriental brasileira, podendo ainda ser encontrado na Guiana, Guiana Francesa, Suriname, Venezuela, Colômbia, Panamá, Equador e Trinidade (ROOSMALEN, 1985; CAVALCANTE, 1991; SILVA et al., 2018).
Os frutos dessa vegetação, conhecido como açaí do Pará, açaí do baixo amazonas, açaí de touceira, juçara e juçara de touceira, são drupas globosa ou levemente depressa. O epicarpo, na maturação, é roxo ou verde e o mesocarpo é polposo, envolvendo um endocarpo volumoso e duro que acompanha, aproximadamente, a forma do fruto e contém em seu interior uma semente (HENDERSON; GALEANO, 1996; ROGEZ et al., 2011).
A grande utilização da porção comestível do fruto é destinada à produção de bebidas, doces e sorvetes, sendo rica em vitaminas, sais minerais, fibras alimentares, açúcares, proteínas e lipídios (OLIVEIRA et al., 1998), e uma gama de componentes polifenólicos com propriedades antioxidantes, alguns dos presentes em maior quantidade são orientina, iso-orientina e ácido vanílico, bem como antocianinas glucósideo e cianidina-3-rutinosídeo. A presença destas substâncias constitui ao fruto atividade antioxidante, anti-inflamatória, antiproliferativa e atividades cardioprotetoras (YAMAGUCHI et al., 2015, CEDRIM; BARROS; NASCIMENTO, 2018), assim sendo considerado alimento funcional, podendo promover dessemelhantes ações no organismo vivo, sobretudo no homem, sendo mantenedor de sua saúde e no desempenho de funções fisiológicas.
No campo da pesquisa e desenvolvimento de cosméticos, os recursos vegetais são de grande relevância, tendo em vista que suas substâncias ativas são utilizadas para o desenvolvimento de produtos, como princípio ativo ou adjuvante para possíveis formulações (YAMAGUCHI et al., 2015).
A indústria cosmética exibe vários produtos que contenham EO em suas formulações (SILVA; DA SILVA, 2016). Em sua maioria, utilizam-se da polpa de E. oleracea como aditivo à cosméticos devido a sua atividade antioxidante, e isso é atribuído à presença das antocianinas, cianidina-3-glicosídeo e cianidina-3-rutinosídeo, moléculas solúveis em água que conferem a coloração roxa do açaí, assim como alguns flavonoides, como a quercetina,
orientina e luteolina (LICHTENTHALER et al., 2005; DA SILVA et al., 2016). Esses compostos ainda proporcionam um aumento no prazo de validade dos cosméticos (ZOZIO; PALLET; DORNIER, 2011).
Relata-se o uso de EO com possível aplicação farmacêutica, uma vez que, pós- liofilizados e extratos hidroalcoólico têm sido estudados com amplo arsenal farmacológico. Estudos apontam atividade antineoplásica (CHOI et al., 2017; FRAGOSO et al., 2018), antioxidante (SCHAUSS et al., 2006; CARVALHO et al., 2015; CHIN et al., 2008), antidiabética (DE BEM et al., 2018), anti-hipertensiva (CORDEIRO et al., 2015; ROCHA et al., 2007), anti-inflamatória (DE MOURA et al., 2012) e antilipêmica (DE OLIVEIRA et al., 2015).
O óleo obtido de Euterpe oleracea (OEO) tem se tornado alvos de grandes estudos (FAVACHO et al., 2011; MELHORANÇA FILHO; PEREIRA, 2012; MONGE-FUENTES et al., 2016). O seu uso na área cosmética é atribuído à sua composição rica em ácidos graxos, ácidos fenólicos e antocianinas (PACHECO-PALENCIA et al., 2008; KANG et al., 2010). Estudos exibem que o seu caráter apolar favorece a sua aplicação a produtos formulados por emulsões (FERRARI; ROCHA-FILHO, 2010; DAHER et al., 2014; OLIVEIRA, 2018), viabilizando produtos cosméticos com ação anti aging e anti-inflamatória (FAVACHO et al., 2011; SCHAUSS; JENSEN; WU, 2010; FIGUEIREDO; BIERNET, 2014). Por outro lado, a aplicação farmacêutica de OEO ainda é muito especulada, tornando-se objetivo deste estudo. 3.1.1 Caracterização física do Óleo de Euterpe oleracea Mart.
Parâmetros físicos, como a rancidez hidrolitica, o índice de iodo e o índice de saponificação são amplamente aplicados no controle de qualidade dos óleos vegetais, e devem ser considerados na prospecção de óleos, visando assegurar as características de qualidade do produto, para os diversos fins. Assim, consideram-se, também, os parâmetros legais para a avaliação da qualidade, estabilidade e composição de óleos e gorduras (VIEIRA et al., 2018).
De acordo com a Anvisa (2019), descrito na Farmacopeia brasileira 2019, o índice de acidez expressa em miligramas a quantidade necessária de hidróxido de potássio necessário para neutralizar os ácidos graxos livres presente em 1g de amostra. Índices elevados de acidez sugerem uma hidrólise acentuada dos ésteres que constituem os ácidos graxos, desta forma, a RDC 270 da ANVISA (2005), preconiza que óleos de origem vegetal devem possuir um índice de acidez inferior à 4 mg de KOH/g.
A decomposição de gorduras se dá por meio da ação da lipase, porém existem alguns fatores que podem favorecer no aumento do grau de rancidez hidrolitica, como por exemplo:
atividade bacteriana, ação catalítica através do calor ou luz solar, estocagem inadequada em ambientes úmidos ou presença de impurezas levando a alteração no sabor e odor do óleo (SANTOS et al., 2017).
Recomenda-se que, até o armazenamento correto do óleo evita sua deterioração pelos fatores supracitados e contribui na manutenção da longevidade do produto para o uso e aplicações (SOARES et al., 2012). Contudo, óleos vegetais extraídos de polpa, tal como o óleo de açaí, tendem a apresentar valores próximos elevados de ácidos graxos livres, uma vez que a polpa apresenta enzimas lipolíticas que aceleram a degradação dos triacilgliceróis (COIMBRA; JORGE, 2011).
O índice de iodo é um parâmetro físico que indica o grau de instauração dos ácidos graxos, esterificados e livres presentes na amostra. Através da variação deste parâmetro, pode-se determinar o teor de ácidos graxos insaturados, mensurar a susceptibilidade à rancidez oxidativa, controlar o processo de hidrogenação de gorduras vegetais e verificar a adulteração da amostra. Valores aceitáveis de índices de iodo são em torno de 60-90 gl2/100g (ANVISA, 2019). Os óleos que possuem um elevado número de instaurações, consequentemente possuem um maior índice de iodo e, portanto, estão mais susceptíveis a possibilidade de rancidez por oxidação (ALMEIDA, 2015).
Quanto ao índice de saponificação, ou hidrólise alcalina, é uma reação entre óleos e bases, sob uma pressão e aquecimento moderado, que dar origem ao glicerol (OLIVEIRA; DA LUZ; FERREIRA, 2006) de acordo com a reação, exemplo:
C3H5(C17H35COO)3 + 3KOH → C3H5(OH)3 + 3C17H35COOK
Estearina + Hidróxido de potássio → Glicerol + Estearato de potássio
Os ésteres que formam os ácidos graxos de baixo peso molecular requerem mais álcalis para realização da reação de saponificação, desta forma, o índice é inversamente proporcional ao peso molecular dos ácidos graxos presentes no óleo (ALMEIDA, 2015). Estima-se que o índice de saponificação dos óleos vegetais estejam em torno de 180 - 200 mg de KOH/g.
Pereira (2015), em testes com o óleo de açaí, relatou um índice de acidez de 3,66 mg de KOH por grama de amostra, índice de iodo de 71 gI2 por 100 gramas de amostra e índice de saponificação de 199 mg de KOH por grama de amostra. Estes testes foram procedidos logo após a obtenção do óleo e este mesmo óleo foi utilizado no presente estudo.
3.1.2 Composição química do Óleo de Euterpe oleracea Mart.
Segundo Souza et al. (2017), o óleo de açaí é composto de ácidos graxos, cujo constituinte majoritário é o ácido oleico (54,32%), seguido de palmítico (30%), linoleico (5,9%) e palmitoleico, vacênico, esteárico em menores concentrações. As moléculas que exibem maior concentração estão expostas na Figura 1. Dentre os fitoesteróides presentes no óleo, destacam-se o beta-sitosferol, o stigmasterol e o campesterol, sendo muito utilizados pela indústria cosmética, como preventivos do envelhecimento cutâneo, por auxiliar o metabolismo celular e reduzir processos inflamatórios.
Figura 1. Estrutura molecular dos principais ácidos graxos e metabólitos secundários identificados em óleo de Euterpe oleracea Mart. Fonte: própria. Moléculas geradas no Marvin
Sketch a partir de SMILES obtidos no banco de dados molecular PubChem.
Pacheco-Palencia, Mertens-Talcott e Talcott (2008), identificaram pela primeira vez a presença de ácidos fenólicos, tais como o ácido vanílico (1,616 ± 94 mg/L), ácido siríngico
(1,073 ± 62 mg/L), ácido p-hidroxibenzóico (892 ± 52 mg/L), ácido protocatecuico (630 ± 36 mg/L) e ácido ferúlico (101 ± 5,9 mg/L), catequina (66,7 ± 4,8 mg/L) e numerosos oligomeros de procianidina (3.102 ± 130 mg/L) (Figura 1).
Estudo recente realizado por Marques et al. (2016) exibiram a caracterização fitoquímica do OEO com a presença de compostos vanílicos, palmítico, γ-linolênico, linoleico, oleico, cinâmico, cafeico, protocatecuico, ferúlico, siríngico e flavonóides quercetina e kaempferol rutinosídeo como principais constituintes. A essa composição química do OEO é atribuída ampla atividade biológica, capaz de auxiliar a fisiopatologia do organismo vivo.
3.1.3 Atividades farmacológicas do Óleo de Euterpe oleracea Mart.
Quanto ao óleo de açaí, comprovou-se efeito antidiarreico (PLOTKIN; BALICK, 1984; GALOTTA; BOAVENTURA, 2005), atividade antidislipidemica (SOUZA et al., 2017), atividade antimicrobiana contra cepas de Staphylococcus aureus (MELHORANÇA FILHO; PEREIRA, 2012) e atividades antiproliferativas, com influência significativa na proliferação celular, inibindo a proliferação de HT-29 de cólon humano, sendo estas células de adenocarcinoma (PACHECO-PALENCIA et al., 2008). Por outro lado, não houve ação genotóxica quando administrado à ratos Wistar por gavagem (MARQUES et al., 2016).
Favacho et al. (2011) sugerem que substâncias presentes nos OEO possuem propriedades terapêuticas no processo inflamatório através da inibição dos mediadores derivados do ácido araquidônico, atuando possivelmente em processos inflamatórios agudos e crónicos. Rufino et al. (2011), em estudos de avaliação da capacidade antioxidante do OEO, sugere que esta atividade é ainda maior se comparado ao azeite extra virgem, a partir de testes realizados com a sua fração apolar, rica em antioxidantes lipofílicos. Enquanto Mendonça Filho e Pereira (2012) realizou ensaios de disco-difusão em ágar Muller-Hinton para descobrir a capacidade de inibição do crescimento das cepas de Pseudomonas aeruginosa e
Staphylococcus aureus. Os discos foram impregnados com 10 µg do óleo da semente do açaí
e não houve halo de inibição após 24 e 48 horas em teste contra P. aeruginosa, enquanto os meios contendo S. aureus exibiu um halo de inibição, apesar de ser menor do que os halos apresentados pela aplicação dos discos de vancomicina e penicilina. Portanto, este efeito demonstra um importante efeito do óleo contra esta cepa bacteriana.
Recentemente, estudo realizado por Souza et al. (2017), sugere que o óleo possui efeito antiaterogênico, uma vez que reduziu os índices de colesterol total e a lipoproteína de baixa densidade (Low density lipoproteins - LDL) e inibição da formação de placas de
ateroma no endotélio vascular, atuando semelhantemente à sinvastatina, em modelo de dislipidemia em ratos.
Monge-Fuentes et al. (2016) demonstraram uma atividade anticâncer eficaz de uma nanoemulsão formulada com OEO contra linhagens celulares de melanoma, exibindo 85% das células da linhagem B16F10 à morte por apopptose/necrose in vitro e uma redução de 82% do volume do tumor de ratos da linhagem C57BL/6. Estes resultados sugerem terapia fotodinâmica para o tratamento de melanomas.
Ainda, em estudos de genotoxicidade aguda (24 h) e subaguda (14 dias) realizados por Marques et al. (2016), OEO foi administrado nas doses 30, 100 e 300 mg/kg em ratos Wistar. Após a última administração pelo método de gavagem, os leucócitos obtidos de sangue e órgãos como o fígado, a medula óssea e células testiculares foram analisadas e não indicaram nenhum efeito genotóxico significante. Contudo, notou-se que o OEO desempenhou um efeito quimioprotetor contra danos no DNA induzido pela doxorrubicina, está sendo utilizada como controle, sugerindo que estes efeitos protetores podem ser explicados como resultado dos compostos antioxidantes presentes no fruto do açaí.
3.1.4 Limitações e avanços do uso de OEO pela indústria farmacêutica
Apesar dos obstáculos presentes no desenvolvimento de fármacos baseados em derivados de vegetais, o interesse da indústria farmacêutica pela procura de substâncias biologicamente ativas vem sendo estimulada na busca de compostos isolados de plantas capazes de desempenhar atividades biológicas no organismo vivo, mesmo quando sua obtenção parece ser um processo por vezes inviável (WALSH, FISCHBACH, 2010; JAWAD et al., 2014).
Dentre essas possibilidades na prospecção de óleos, destaca-se na biodiversidade várias plantas e seus derivados como extratos, óleos fixos e óleos essenciais. Vários estudos têm avaliado a atividade antibacteriana destes compostos e relataram diferentes mecanismos de ação, como inibição da síntese de ácidos nucleicos, das funções da membrana citoplasmática e do metabolismo energético (WHO, 2017; FRACAROLLI; OLIVEIRA; MARZIALE, 2017).
São citados em estudos, os óleos essenciais (OE), conforme Martins (2003) e Thambi (2013) misturas complexas de substâncias lipofílica, geralmente odoríferas e líquidas, apresentam como principal característica a volatilidade. São compostos sensíveis que podem sofrer degradação sob a ação da luz, oxigênio e temperaturas moderadas. Além disso, são
insolúveis na água, e para certas aplicações exige-se uma liberação controlada (NEVES DE LIMA, 2012; CHAVASCO et al., 2014).
Os óleos fixos são obtidos a partir das partes gordurosas da planta, como sementes, frutos ou caroço, sendo extraído por prensagem a frio ou por meio de solventes orgânicos (RUIVO, 2012). Por constituírem-se especialmente de ácidos graxos de cadeias de hidrocarbonetos longas e insaturadas, exibem algumas limitações quanto à suscetibilidade a processos de degradação, como a oxidação lipídica e degradação de metabólitos secundários. Estes por muitas vezes estão retidos na constituição dos óleos fixos, mas que também são sensíveis à presença de oxigênio e temperatura ambiente (PACHECO-PALENCIA; MERTENS-TALCOTT; TALCOTT, 2008).
O aumentando do índice de acidez, por exemplo, reflete no seu grau de rancidez hidrolitica em consequência da deterioração dos triacilglicerois e aumento dos ácidos graxos livres, reduzindo a vida de prateleira do óleo. Em estudos procedidos por Pacheco-Palencia, Mertens-Talcott e Talcott (2008), percebeu-se que compostos fenólicos obtidos do óleo de açaí, sofreu perda de até 16% após 10 semanas de armazenamento a 20 ou 30 °C e até 33% de perda a 40 °C, enquanto que os oligómeros de procianidinas degradaram-se mais extensivamente (23% a 20 °C, 39% a 30 °C e 74% a 40 °C), demonstrando termosensibilidade. Nesses casos se faz necessário tratamento para a sua conservação, evitando sabores e odores provenientes da rancidez hidrolítica.
Portanto, apesar do arsenal farmacológico dos óleos, sua utilização pela indústria farmacêutica possui limitações, uma vez que algumas de suas características físicas, como solubilidade e estabilidade oxidativa, podem causar instabilidade ao produto final, além apresentar baixa biodisponibilidade. Os aspectos organolépticos como odor, sabor e textura ainda influenciam no consumo do produto (FERREIRA et al., 2008; NEHDI, 2013; WALIA et al., 2013).
Contudo, a Tecnologia Farmacêutica tem evidenciado a utilização de métodos e insumos para melhorar ou alterar características de fármacos, extratos e drogas vegetais não excluindo os óleos. Como exemplo, o uso de complexos de inclusão tem ganhado destaque no desenvolvimento de formulações farmacêuticas a fim de melhorar a solubilidade de fármacos (RODRIGUES DE LIMA, 2012; FERREIRA et al., 2018).
Rodrigues de Lima (2012), evidencia a obtenção de formulações estáveis aplicadas a óleos, ao considerar suas características físico-químicas indesejáveis. Portanto, CDs têm sido amplamente utilizadas pela sua capacidade de encapsular moléculas de fármacos com caráter hidrofóbico (ASTRAY et al., 2009).
Aguiar et al. (2014), afirmam que diversos óleos essenciais e compostos voláteis passaram a ser complexados com ciclodextrinas, aumentando sua estabilidade, solubilidade aquosa, fotoestabilidade e estabilidade térmica, além de protegê-los da oxidação, mascarar ou reduzir efeitos fisiológicos indesejados, além de reduzir sua volatilidade, por vezes até controlar o perfil de liberação do medicamento, despertando a sua aplicação por parte da indústria farmacêutica. Neste contexto, observa-se que objetivos comuns no desenvolvimento de formulações com OEO são de proteção à sua degradação e melhoramento de propriedades físico-químicas.
3.2 Ciclodextrinas
As ciclodextrinas são compostas por unidades D-glicopiranosídicas (glicose) ligadas entre si por meio de ligações α-1,4-glicosídicas, formando oligossacarídeos cíclicos. Obtidas com maior rendimento as constituintes de 6, 7 e 8 unidades de glicose e são respectivamente conhecidas por alfa-ciclodextrina (α-CD), beta-ciclodextrina (β-CD) e gama-ciclodextrina (γ-CD), as quais são naturais, obtidas pela degradação do amido pelas enzimas glicosiltransferases. São caracterizadas por moléculas cristalinas e não higroscópicas (KURKOV; LOFTSSON, 2013; ABOU-OKEIL et al., 2018, CARNEIRO et al., 2019).
Devido à configuração das cadeias de glicose, as ciclodextrinas adotam a forma tronco-cônica, como mostra na Figura 2A, onde os grupos hidroxilas são orientados para o exterior da molécula dando-lhe propriedades hidrofílicas, enquanto que o esqueleto carbônico e os radicais de oxigênio são orientados para a cavidade central, tornando-o hidrofóbico (BREWSTER; LOFTSSON, 2007; LOFTSSON; BREWSTER, 2010; JAMBHEKAR; BREEN, 2016; SURVANA; GUJAR; MURAHARI, 2017).
As CDs são estáveis em meio alcalino, hidrolisam em meio fortemente ácido e são resistentes à degradação enzimática pela β-amilase, embora as CDs, particularmente a γ-CD, sejam suscetíveis ao ataque da α-amilase. Formam hidratos estáveis com estabilidade semelhante à do amido, podendo ser armazenadas por anos sem sofrer qualquer degradação (SZEJTLI, 1994). Modificações químicas podem ser realizadas através da ligação de diferentes grupos funcionais às hidroxilas primárias e secundárias, na porção externa da CD, levando à uma melhora na solubilidade, toxicidade e aumentando a capacidade de inclusão (UEKAMA; IRIE, 2004).
Figura 2. (A) Moléculas de α-, β- e γ-CD (ciclodextrinas); (B) Representação do complexo de inclusão do ligante em ciclodextrinas (CARNEIRO et al., 2019).
A maioria das CDs de interesse farmacêutico são hidrofílicas e, devido à digestão bacteriana, possuidoras de alto peso molecular (973-2163 Da), grande número de doadores e aceitadores de hidrogênio, alta hidrofilicidade (logKo/w entre - 8 e - 12), e biodisponibilidade oral inferior a 4%. Por outro lado, podem ser identificados efeitos colaterais pela administração oral de altas doses desses CDs, semelhantes aos relacionados a carboidratos pouco digeríveis e incluem flatulência e fezes moles. As ciclodextrinas podem ser encontradas em vários medicamentos orais e todas as três ciclodextrinas naturais (isto é, α-CD, β-CD e γ-CD) também têm sido aplicadas a produtos dietéticos (VYAS et al., 2008; WENZ, 2000; PEETERS et al., 2002).
A utilização de ciclodextrinas é evidenciada em virtude do aprimoramento de propriedades físico-químicas de substâncias, pois a sua capacidade de complexar-se a fármacos (Figura 2B) pode viabilizar a sua solubilidade, biodisponibilidade, permeabilidade celular, especificidade, estabilidade térmica e oxidativa e redução da toxicidade (SAENGER, 1980; RODRIGUES DE LIMA, 2012; VIKAS et al., 2018). Estas condições são favorecidas pela encapsulação ocorrente a partir da substituição de moléculas de água, de elevada entalpia, por moléculas hóspedes de menor entalpia, promovendo alterações favoráveis de entalpia, aumento de entropia e redução da energia total do sistema, permitindo a estabilidade do complexo (SURVANA; GUJAR; MURAHARI, 2017).
Estudos com a formação de complexos de inclusão entre óleos e ciclodextrinas têm demonstrado resultados positivos quanto à sua complexação e aplicabilidade (AGUIAR, 2014; RODRIGUES et al., 2017; YU et al., 2018). O trabalho feito por Wang et al. (2011) para complexar óleo de alho em β-CD, demonstrou claramente a eficiência de complexação. Os resultados demonstraram ainda que a solubilidade em água e a estabilidade do óleo foram significativamente aumentadas pela inclusão a CD. Quintans-Junior et al., (2013) apontaram que os complexos de inclusão com β-CD aumentou a biodisponibilidade oral e efeitos antinociceptivos do linalol, se comparado ao fitoquímico isolado, potencializando a sua atividade analgésica.
Este caráter das ciclodextrinas lhes permite a formação de complexos de inclusão podendo ser aplicados a vários campos, como na produção de pesticidas, alimentos e, em especial, à indústria farmacêutica, servindo-lhe como veículos para fármacos nas diversas formas farmacêuticas. Atualmente há mais de 40 formulações no mercado contendo ciclodextrinas, destinados à administração oral, parentérica, oftálmica, retal e via de aplicação dérmica (SAENGER, 1980; GIDWANI; VYAS, 2015).
Portanto, sugere-se que a complexação de óleo de açaí em ciclodextrinas deverá melhorar sua solubilidade, desse modo tenderá a aumentar a biodisponibilidade dos seus constituintes. Tornar-se-á também um produto estável, ao reduzir sua instabilidade oxidativa, obtendo-se um produto farmacologicamente efetivo pela manutenção ou até ampliação do seu efeito farmacológico e, ainda, possivelmente fornecerá uma segurança quanto ao consumo do óleo.
3.2.1 Ciclodextrinas quimicamente modificadas
A fim de melhorar a solubilidade aquosa e a toxicidade de algumas ciclodextrinas, ainda são realizadas modificações químicas nos grupos hidroxilas primários e/ou secundários, onde são ligados diversos grupos funcionais. Os derivados das ciclodextrinas podem ser obtidos pela substituição com grupos metila, etila, carboximetila, hidroxietila, hidroxipropila, sulfobutila, sacarídeos ou através da polimerização das ciclodextrinas. Estes, por sua vez, encontram-se orientados para a porção externa da ciclodextrina, lhes conferindo um caráter hidrofílico (VEIGA; PECORELLI; RIBEIRO, 2006; CARNEIRO et al., 2019).
Segundo Arima (2011) e Leclercq (2016), substituintes ligados às ciclodextrinas influenciam quantitativamente no seu caráter hidrofílico, e isso interfere quanto a sua capacidade de complexação e afinidade por um fármaco. Substituintes hidrofílicos (como 2-hidroxipropil, 3-2-hidroxipropil, maltosil, sulfato, éter sulfobutil), por exemplo, possuem
