Avaliação Biológica

2.6.1. Material biológico

Para a realização dos ensaios de toxicidade in vitro, utilizou-se a linha celular L929, derivada de fibroblastos de ratinho (Mus musculus), registada na base de dados da ATCC - American Type Cell Culture, com a referência ATCC® CRL-6364. As células usadas encontravam-se entre as passagens #14 e #31.

2.6.2. Soluções e meio de cultura

Solução tampão fosfato salina – constituída por NaCl (137 mM); KCl (2.7 mM); KH2PO4 (1.75 mM) e Na2HPO4.2H2O (10 mM) e acertada a pH 7.4.

Meio de cultura com soro - constituído por meio base - Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium (DMEM; com 4.5 g.L-1 _{de glicose), suplementado com 2 mM L-glutamina 200}

Life techologies) e antibióticos (200 µg·mL-1 _{de Penicilina e 200 µg·mL}-1 _{Estreptomicina)}

(Sigma aldrich).

2.6.3. Cultura Celular

Os procedimentos de assepsia de todas as culturas celulares estão padronizados e otimizados de modo a prevenir contaminações por bactérias, fungos, micoplasmas e entre culturas.87 _{Deste modo, o manuseamento desta linha celular foi}

realizado em câmara de fluxo laminar vertical (classe II). Todo o material envolvido no manuseamento da cultura de células encontrava-se esterilizado.

2.6.3.1. Manutenção e Subcultura da Linha Celular L929

A manutenção da linha celular L929 foi realizada 2 vezes por semana, o que envolveu a renovação do meio de cultura e, quando as células apresentavam 80 a 90 % de confluência, a subcultura. As células foram mantidas em incubadora com 5 % CO2,

a 37 ºC e com humidade controlada.

Para a subcultura, removeu-se o meio de cultura, procedeu-se à lavagem com PBS e promoveu-se a desaderência das células com uma incubação com tripsina, durante 4 min, a 37ºC, de modo a romper as interações intercelulares e entre as células e o substrato. De seguida, inibiu-se a ação da tripsina com meio contendo soro. A suspensão celular resultante serviu para manter a cultura numa diluição 1:6, e a restante para utilizar nos ensaios biológicos.

2.6.3.2. Contagem de células em câmara de Neubauer

Para a contagem de células em câmara de Neubauer ou hemocitómetro, procedeu-se à visualização das células e contagem destas num microscópio de contraste de fase usando a objetiva 10X. Com base no número médio de células presentes nos campos de contagem, procedeu-se à diluição da suspensão celular a fim de obter a densidade celular pretendida, ou seja, 10x103 _células/mL.

2.6.3.3. Preparação de placas de cultura e adição dos

compostos

Para a avaliação da atividade biológica pelo ensaio da libertação da LDH e pelo ensaio da resazurina, as células diluídas para a densidade de 10×103 _{células/mL, foram}

adicionadas a microplacas de cultura de 96 poços (100 µL por poço).

Posteriormente as microplacas foram incubadas na incubadora com 5 % CO2;

95 % de ar a 37 ºC para que as células aderissem ao substrato. Após 24 h, as células foram incubadas com diferentes concentrações dos sistemas em estudos, diluídos em meio completo, num volume final de 100µL.

No controlo de vida foi adicionado 100 µL de suspensão celular em meio de cultura completo. No controlo de morte, as células foram expostas a 30% DMSO v/v para o ensaio da resazurina ou 100% água ultrapura para o ensaio de libertação da LDH.

2.6.3.4. Avaliação da viabilidade celular: ensaio da

resazurina

Para a monitorização da atividade metabólica recorreu-se ao ensaio da resazurina tendo-se estudado o efeito de exposição de 24 e 48 h, em contínuo, após a adição dos sistemas cataniónicos (em triplicados) diluídos em meio DMEM com soro nas concentrações finais de 1,10, 50, 100 e 500 µM. A metodologia empregue consistiu em medições fluorométricas ao cdo de excitação 530 nm e 590 nm de emissão. As medições de emissão de fluorescência foram realizadas num fluorímetro, modelo Fluoroskan ascent FL Thermo Scientific.

2.6.3.4.1. Procedimento experimental

Após 24 h de exposição aos sistemas cataniónicos, removeu-se com uma micropipeta a totalidade do meio de cultura das microplacas de 96 poços, tendo-se adicionado a cada poço 100µL de solução de resazurina diluída em meio de cultura com soro na concentração final de 2.5x10-4 _{M. Este procedimento foi realizado em câmara}

de fluxo laminar e ao abrigo da luz de modo a evitar a extinção da fluorescência. Após a adição de resazurina, as placas foram incubadas durante 2 horas na incubadora com 5 % CO2 a 37 ºC. Findo o tempo de incubação transferiu-se o sobrenadante para uma

placa de 96 poços de poliestireno preto para leitura da fluorescência a 590 nm. Simultaneamente, adicionou-se às microplacas com células 100 µL/poço de PBS 1X pH 7.4 de modo a remover algum vestígio de resazurina e voltou-se a aplicar os sistemas em estudo nas concentrações supramencionadas. Este procedimento foi repetido após 48 h (com a exceção do passo de lavagem com PBS) a contabilizar após a primeira adição dos sistemas.

2.6.3.4.2. Análise de dados

Os valores de fluorescência absolutos, obtidos em triplicado, para cada condição de ensaio (concentração), foram normalizados relativamente ao controlo de vida (controlo positivo). Posteriormente construi-se gráficos que expressam a percentagem de viabilidade celular em função da concentração dos sistemas cataniónicos. Em simultâneo, construi-se curvas de inibição da proliferação celular em função do logaritmo da concentração, a partir das quais determinaram-se os valores de IC50. Os cálculos foram efetuados com o software Graphpad Prism.

2.6.3.5. Avaliação da integridade membranar: e nsaio da

libertação da LDH

Para o ensaio da libertação de LDH, foi estudado o efeito de exposição de 48 h após a adição dos sistemas cataniónicos nas concentrações de 1, 10 e 50 µM.

2.6.3.5.1. Procedimento experimental

Removeu-se, com uma micropipeta, a totalidade do sobrenadante das microplacas e transferiu-se para tubos cónicos de 1.5 mL, devidamente identificados, para avaliar a libertação da LDH presente neste meio.

Para avaliar a atividade da LDH no meio intracelular, adicionou-se 125 µL de solução tampão Tris a cada poço e raspou-se o fundo do poço de modo a promover a lise celular. Após a homogeneização com micropipeta transferiu-se a suspensão celular para outra série de tubos cónicos de 1.5 mL devidamente identificados, e centrifugou-

se durante 1 min a 14000 rpm. A atividade da LDH, foi determinada em microplacas de 96 poços. Para tal, adicionou-se um volume total de 250 µL/poço, constituído por: 200 µL de meio reacional (NADH 86 mM em tampão fosfato pH 7.4); 40 µL de proteína (conteúdo dos eppendorfs) e, imediatamente antes da leitura da absorvância a 430 nm, em leitor de microplaca (SPECTRAmax Plus 384, Molecular Devices), 10 µL de solução piruvato (100 mM) em tampão PBS pH 7.4.

2.6.3.5.2. Análise de dados

A metodologia empregue para a determinação da libertação total de LDH baseou-se na análise da variação da absorvância do cofator NADH, a 340 nm em ordem ao tempo, em intervalos de 10 segundos, durante 180 s. Os valores de absorvância absolutos foram normalizados relativamente ao controlo de morte (controlo positivo). Posteriormente, construiu-se gráficos que expressam a percentagem de LDH libertada em função da concentração dos sistemas cataniónicos.