O presente trabalho envolveu o estudo dos parâmetros estruturais e interfaciais de misturas cataniónicas selecionadas que se mostraram capazes de formar vesículos estáveis (à temperatura ambiente, razões de mistura molar catiónico/aniónico específicas e regime diluído de concentração de tensioativo, c ≤ 5.0 mM), e para os quais se avaliou o seu perfil toxicológico in vitro, tendo-se determinado os respetivos valores de IC50. Após seleção dos vesículos cataniónicos mais promissores a nível da citobiocompatibilidade, efetuaram-se estudos preliminares de encapsulação de um fármaco modelo anticancerígeno, doxorrubicina, como prova de conceito do potencial dos vesículos como veiculadores efetivos, em condições próximas das fisiológicas, e para uma molécula terapêutica utilizada em formulações lipossómicas comerciais.
Os sistemas vesiculares cataniónicos estudados foram agrupados, de forma sistemática, em 3 séries: série I, vesículos com o tensioativo aniónico SDS, um tensioativo comercial convencional, em comum; série II, vesículos com o tensioativo aniónico SDDS, um tensioativo comercial derivado da sarcosina, em comum; série III, vesículos com os tensioativos DTAB e CTAB, dois tensioativos catiónicos comerciais, em comum, e emparelhados com aniónicos de cadeias alquílicas de comprimento diferente).
Relativamente às propriedades estruturais, os resultados obtidos neste trabalho mostram que os diferentes sistemas cataniónicos são capazes de se auto-organizar em vesículos de diâmetro e forma diversificada, tendo-se verificado a formação de vesículos esferóides e unilamelares (0.5–5 μm) bem como de vesículos multivesiculares e agregados tubulares de grandes dimensões (>> 20 μm). Os estudos realizados por dispersão dinâmica de luz, indicam que estes agregados apresentam, de um modo geral, elevados índices de polidispersão (0.20 ≤ PDI ≤ 0.80). Verificou-se igualmente que a grande maioria destes vesículos, apresentam elevada estabilidade coloidal, avaliada através dos valores absolutos de potencial zeta (valores superiores a ± 30 mV) e que alguns destes sistemas, através da variação da sua composição, possibilitam a modulação da carga superficial efetiva do agregado. Assim, para a mesma mistura cataniónica, em alguns casos foi possível obter vesículos com carga efetiva positiva ou negativa variando-se a quantidade relativa (em termos de fração molar) dos tensioativos individuais que constituem a mistura. Esta característica pode ser particularmente útil e realça a grande versatilidade deste tipo de sistemas, o que poderá ser vantajoso de acordo com a aplicação pretendida.
Quanto às propriedades interfaciais das misturas cataniónicas, os valores de concentração de agregação crítica determinados por tensiometria encontram-se na ordem de 1-100 μmol.kg-1,valores estes muito inferiores aos dos respetivos tensioativos
individuais, o que permite concluir que as misturas exibem um elevado sinergismo interfacial, como seria expectável, indicativo da forte interação eletrostática em solução entre os seus constituintes. Além disso, os valores de tensão superficial na cac mostram também que as soluções vesiculares apresentam propriedades de adsorção na interface ar-água acentuadas e melhoradas em relação aos componentes individuais.
Relativamente à avaliação da citotoxicidade in vitro, na linha celular L929, verificou-se que as composições ricas em tensioativo catiónico são as que apresentam valores de IC50 mais baixos, isto é, são as mais citotóxicas. Os resultados mostram sem exceção que os tensioativos individuais catiónicos apresentam valores de IC50 reduzidos, contrariamente aos aniónicos para os quais, na sua grande maioria, não foi possível determinar os valores de IC50 na gama de concentração (1- 500 μM) aplicada ao meio de cultura das células L929. Estes resultados sugerem que os vesículos cataniónicos que eventualmente poderão constituir um modo de veiculação de princípios ativos para aplicações biomédicas ou relacionadas, devem ser constituídos maioritariamente por um excesso de componente aniónico. Esta possibilidade é suportada, por exemplo, pela diferença observada entre os valores de IC50 obtidos para o sistema CTAB/SOSo x+ = 0.10, IC50
24h = 157 ± 7 μM, comparativamente com x+ =
0.50, IC5024h = 28 ± 2 μM.
Quanto aos estudos de encapsulação de doxorrubicina, os resultados obtidos, sugerem que os sistemas DDAB/SDDS e x+ = 0.60, e 12-2-12/SDDS e x+ = 0.40,
apresentam capacidade de encapsulação e/ou adsorção. Contudo, estes resultados são preliminares e carecerem de validação (repetibilidade e reprodutibilidade dos resultados), assim como de estudos mais aprofundados de modo a se poder tirar conclusões mais sólidas.
Como perspetivas de trabalho futuro, poder-se-ia estudar inicialmente o comportamento de fase e as propriedades de agregação das misturas cataniónicas preparadas em soluções tampão e/ou meio de cultura (condições mais próximas/reais a das verificadas na fisiologia celular), de modo a inferir acerca da influência destes meios na agregação e também nos valores de potencial zeta dos possíveis agregados formados. Posteriormente, verificando-se a formação de agregados vesiculares estáveis, estudar-se o seu perfil toxicológico e a sua eficiência de encapsulação.
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ANEXO 1 – Gráficos da análise por dispersão dinâmica de luz
Figura 2 - Distribuição de tamanho médio dos agregados vesiculares dos sistemas da série II em função da intensidade A) DDAB/SDDS x+ = 0.30, B) 12-2-12/SDDS x+ = 0.40, estudados na concentração de 5.0 mM.
Figura 1 - Distribuição de tamanho médio dos agregados vesiculares dos sistemas da série I em função da intensidade A) DDAB/SDS x+ = 0.30, B) DDAB/SDS x+ = 0.80, C) 12-6-12/SDS x+ = 0.30, D) 12-12-12/SDS
Figura 3 - Distribuição de tamanho médio dos agregados vesiculares dos sistemas da série III em função da intensidade A) CTAB/SOSo x+ = 0.10, B) CTAB/SOSo x+ = 0.50, C) CTAB/SDeSo x+ = 0.60 D)
ANEXO 2 - Gráficos Ensaio da libertação da enzima LDH
Sistemas série I
Figura 1 - Percentagem de libertação de LDH em células L929 tratadas a diferentes concentrações de sistemas da série I e respetivos tensioativos individuais.
Sistemas série II
Figura 2 - Percentagem de libertação de LDH em células L929 tratadas a diferentes concentrações de sistemas da série II e respetivos tensioativos individuais.
Sistemas série III
Figura 3 - Percentagem de libertação de LDH em células L929 tratadas a diferentes concentrações de sistemas da série III e respetivos tensioativos individuais.
Figura 4 - Percentagem de libertação de LDH em células L929 tratadas a diferentes concentrações de sistemas da série III e respetivos tensioativos individuais.
Anexo 3 - Espectros de fluorescência
Figura 1 - Espectros de emissão de fluorescência dos vesículos vazios 12-2-12/SDDS x+ = 0.40 e
DDAB/SDDS x+ = 0.60.
Figura 2 - Espectro de emissão de fluorescência dos sobrenadantes dos sistemas cataniónicos DDAB/SDDS x + = 0.60 e 12-2-2/SDDS x+= 0.40.
Figura 3 - Espectro de emissão de fluorescência das suspensões vesiculares com DOX dos sistemas cataniónicos 12-2-12/SDDS x+ = 0.40 e DDAB/SDDS x+ = 0.60. 0 200 400 600 800 1000 1200 500 600 700 800 Intens ida de de fl uo res cêni ca / UA λ / nm DDAB/SDDS x+ = 0.60 12-2-12/SDDS x+= 0.40