Vesículos cataniónicos caracterização estrutural, avaliação toxicológica e estudos de encapsulação de biomoléculas

2.º CICLO

Vesículos

cataniónicos-caracterização estrutural,

avaliação toxicológica e

estudos de encapsulação

de biomoléculas

Karenina Freitas Bastos Ferreira Dos Santos

Dissertação de Mestrado apresentada à

Faculdade de Ciências da Universidade do Porto e Instituto de

Ciências Biomédicas Abel Salazar

Bioquímica

2019

V e s íc ul os c a ta ni ón ic os -c a ra c te ri za ç ã o e s trut ura l, a v a lia ç ã o tox ic ol óg ic a e e s tud os de e nc a ps ul a ç ã o de bi om ol é c ul a s K a re n in a F re ita s B a s to s F e rr e ir a D o s Sa n to s

S

c

FCUP ICBAS ECUM 2019

Vesículos

cataniónicos-caracterização

estrutural, avaliação

toxicológica e

estudos de

encapsulação de

biomoléculas

Karenina Freitas Bastos Ferreira dos Santos

Mestrado em Bioquímica

Departamento de Química e Bioquímica 2019

Orientador

Eduardo Jorge Figueira Marques, Professor Associado, FCUP

Coorientador

Todas as correções determinadas pelo júri, e só essas, foram efetuadas. O Presidente do Júri,

Agradecimentos

Concluída mais uma etapa particularmente importante, não poderia deixar de expressar o meu agradecimento a todos que apoiaram e contribuíram para a concretização deste projeto.

Ao Professor Eduardo Marques, o meu sincero obrigada pela orientação, apoio e compreensão prestados e por ter contribuído para o meu enriquecimento académico. À Professora Andreia Gomes, coorientadora deste projeto, pela sua disponibilidade e acompanhamento.

À Isabel Oliveira, o meu mais profundo agradecimento pelo apoio, incentivo e motivação que foram fundamentais para a conclusão desta tese.

Aos colegas de laboratório pela sua boa disposição e disponibilidade que tornaram esta caminhada mais leve.

A todos os amigos e familiares que sempre tiveram palavras de incentivo e me deram força para continuar.

Resumo

Nas duas últimas décadas, tem-se assistido ao desenvolvimento acentuado de uma vasta gama de sistemas nanoestruturados de entrega de biomoléculas com características melhoradas, em particular quanto à biocompatibilidade, à biodistribuição, ao direcionamento para células-alvo e ao perfil de libertação. Neste contexto, o desenvolvimento de vesículos tem sido alvo de interesse crescente com vista à otimização das propriedades de entrega controlada e direcionada de fármacos. Os vesículos desenvolvidos a partir de misturas binárias de tensioativos catiónicos e aniónicos – vesículos cataniónicos - apresentam elevada estabilidade coloidal e versatilidade de características estruturais (nomeadamente tamanho e carga) e possibilidade de modulação destas por alteração de pH, constituindo assim, uma abordagem alternativa e promissora face aos vesículos convencionais (lipossomas), constituídos tipicamente por lípidos polares.

Este projeto teve como principal objetivo a caracterização estrutural e a avaliação de propriedades biológicas de sistemas selecionados de vesículos cataniónicos, formados a partir de tensioativos comerciais comuns monoméricos, tensioativos diméricos (ou gemini) e tensioativos monoméricos derivados de aminoácidos. As propriedades estruturais dos vesículos, nomeadamente o tamanho, a forma, a polidispersão e potencial zeta foram avaliadas por recurso a microscopia de luz e à dispersão dinâmica de luz. Em paralelo, foram determinadas as propriedades interfaciais — nomeadamente a concentração de agregação crítica (cac) — das misturas cataniónicas, através de tensiometria pelo método da placa de Wilhelmy. Posteriormente, avaliou-se a citotoxicidade dos vesículos cataniónicos numa linha celular animal e realizaram-se estudos de encapsulação de um fármaco anticancerígeno modelo (doxorrubicina) a fim de se testar a eficácia dos agregados vesiculares em condições próximas das do ambiente fisiológico.

Após triagem inicial das misturas cataniónicas que formam espontaneamente vesículos estáveis, procedeu-se à caracterização estrutural destes agregados. Genericamente, verificou-se que os vesículos dos diferentes sistemas estudados apresentam diâmetro médio muito variável, elevado índice de polidispersão e elevada estabilidade coloidal. Por tensiometria, verificou-se que os valores de cac são da ordem de 10-6 _{mol dm}-3_{, o que é indicativo de forte sinergismo interfacial entre os tensioativos}

constituintes das misturas cataniónicas. Os estudos de citotoxicidade foram realizados na linha celular L929 (fibroblastos de ratinho) através dos ensaios de resazurina e de libertação da enzima lactato desidrogenase (LDH), visando a determinação dos valores de IC50. De um modo geral, observou-se que os sistemas cataniónicos menos citotóxicos foram os constituídos por tensioativos derivados de aminoácidos. Os estudos

de encapsulação de doxorrubicina por parte dos sistemas de maior biocompatibilidade foram efetuados por espectroscopia de fluorescência.

Abstract

Over the past two decades, there has been a marked development of a wide range of nanostructured systems for drug delivery with improved characteristics, in particular with respect to biocompatibility, biodistribution, cell targeting and release profile. In this context, the development of vesicles has been of growing interest with the goal of optimizing the properties of controlled and targeted delivery of drugs. Vesicles developed from binary mixtures of cationic and anionic surfactants - catanionic vesicles - exhibit high colloidal stability and versatility of structural characteristics (namely size, charge) and possibility of modulation of these by pH change, thus providing an alternative and promising approach to conventional vesicles (liposomes), typically consisting of polar lipids.

The main objectives of this project were the structural characterization and the evaluation of the biological properties of selected systems of catanionic vesicles formed from common monomeric commercial surfactants, dimeric (or gemini) surfactants and amino acid-derived monomeric surfactants. The structural properties of the vesicles, namely size, shape, polydispersity and zeta potential were evaluated by light microscopy and dynamic light scattering. In parallel, the interfacial properties, namely the critical aggregation concentration (cac), of the catanionic mixtures were determined by tensiometry using the Wilhelmy plate method. Subsequently, the cytotoxicity of the catanionic vesicles was evaluated in an animal cell line. Further, encapsulation studies of a model anticancer drug (doxorubicin) were performed to test the efficacy of the vesicular aggregates under conditions close to the physiological environment.

After initial screening of the catanionic mixtures that spontaneously formed stable vesicles, the structural characterization of these aggregates was performed. Generally, it was found that the vesicles of the different systems studied exhibit a very variable mean diameter, a high polydispersity index and a high colloidal stability. By tensiometry, the cac values were found to be on the order of 10-6 _mol._dm-3_{, which is indicative of strong}

interfacial synergism between the surfactants constituting the catanionic mixtures. Cytotoxicity studies were performed on the L929 cell line (mouse fibroblasts) by the resazurin and the lactate dehydrogenase enzyme (LDH) release assays in order to determine IC50 values. In general, it was observed that the less cytotoxic catanionic mixtures were those consisting of surfactants derived from amino acids. Doxorubicin encapsulation studies by the higher biocompatibility systems were performed by fluorescence spectroscopy.

Índice Geral

Agradecimentos ... i Resumo……….ii Abstract………... . ..iv Índice Geral ... v Índice de Figuras ... ix

Índice de Tabelas ... xiii

Lista de Abreviaturas e Símbolos ... xv

Capítulo 1. Introdução... 1

1.1. Âmbito do trabalho ... 2

1.2. Tensioativos... 4

1.2.1. Estrutura molecular, propriedades básicas e classes de tensioativos ... 4

1.2.2. Auto-agregação e modelos de racionalização ... 10

1.2.2.1. Parâmetro de empacotamento crítico ... 11

1.2.2.2. Modelo da curvatura espontânea ... 12

1.3. Micelização ... 13

1.3.1. Modelos termodinâmicos do processo de micelização ... 14

1.3.1.1. Modelo da pseudo-separação de fases ... 15

1.3.1.2. Modelo da lei de ação de massas ... 16

1.3.2. Tensão superficial ... 18

1.4. Vesículos ... 19

1.4.1. Estrutura e propriedades ... 19

1.4.2. Métodos de formação ... 21

1.5. Misturas cataniónicas de tensioativos ... 23

1.5.1. Vesículos convencionais e vesículos cataniónicos ... 24

1.6. Propriedades Biológicas ... 26

1.6.1. Cultura Celular... 26

1.6.2. Linha celular L929 ... 27

1.6.3. Avaliação da citotoxicidade em cultura de células ... 27

1.6.3.1. Ensaio da Resazurina ... 28

1.6.3.2. Ensaio da libertação da LDH ... 29

1.7. Doxorrubicina como fármaco modelo ... 30

Capítulo 2 . Materiais e Métodos ... 32

2.1. Compostos utilizados ... 33

2.1.1. Tensioativos ... 33

2.1.2. Preparação das misturas cataniónicas ... 35

2.2. Caracterização Estrutural e Interfacial ... 36

2.2.1. Microscopia de luz ... 36

2.2.2. Microscopia de ótica de luz polarizada ... 37

2.2.3. Microscopia de Contraste por Interferência Diferencial ... 39

2.2.3.1. Procedimento experimental ... 39

2.2.4. Dispersão dinâmica de luz ... 40

2.2.5. Determinação de Potencial Zeta ... 41

2.2.5.1. Procedimento experimental ... 43

2.3. Tensiometria ... 43

2.3.1. Procedimento experimental ... 45

2.3.1.1. Análise de dados ... 45

2.4. Extrusão dos vesículos cataniónicos ... 46

2.4.1. Procedimento experimental ... 46

2.5. Estudos de encapsulação e quantificação de doxorrubicina ... 47

2.6. Avaliação Biológica ... 48

2.6.1. Material biológico ... 48

2.6.2. Soluções e meio de cultura... 48

2.6.3.1. Manutenção e Subcultura Linha Celular L929 ... 49

2.6.3.2. Contagem de células em câmara de Neubauer ... 49

2.6.3.3. Preparação de placas de cultura e adição dos compostos .. 50

2.6.3.4. Avaliação da viabilidade celular: ensaio da resazurina. ... 50

2.6.3.4.1. Procedimento experimental ... 50

2.6.3.4.2. Análise de dados ... 51

2.6.3.5. Avaliação da integridade membranar: ensaio da libertação da LDH ... 51

2.6.3.5.1. Procedimento experimental ... 51

2.6.3.5.2. Análise de dados ... 52

Capítulo 3 . Resultados e Discussão ... 53

3.1. Sistemas cataniónicos estudados ... 54

3.1.1. Série I: sistemas baseados em dodecil sulfato de sódio (SDS) .... 55

3.1.2. Série II: sistemas baseados em SDDS ... 55

3.1.3. Série III: sistemas baseados em CTAB e DTAB ... 56

3.2. Caracterização estrutural ... 57

3.2.1. Caracterização estrutural dos sistemas da série I ... 57

3.2.2. Caracterização estrutural dos sistemas da série II ... 60

3.2.3. Caracterização estrutural dos sistemas da série III ... 63

3.3. Propriedades interfaciais ... 66

3.3.1. Série I: sistemas baseados em SDS ... 67

3.3.2. Série II: sistemas baseados em SDDS ... 68

3.3.3. Série III: sistemas baseados em CTAB e DTAB ... 70

3.4. Avaliação da citotoxicidade in vitro ... 71

3.4.1. Ensaio da resazurina ... 72

3.4.1.1. Sistemas da série I: Avaliação da viabilidade celular ... 72

3.4.1.2. Sistemas da série II: Avaliação da viabilidade celular ... 76

3.4.1.3. Sistemas da série III: Avaliação da viabilidade celular ... 79

3.5. Estudo de encapsulação da doxorrubicina ... 87

3.5.1. Ensaio de eficiência de encapsulação ... 89

3.5.1.1. Quantificação da doxorrubicina encapsulada por espectrofluorimetria ... 90

Capítulo 4 . Conclusão e Perspetivas Futuras ... 92

Bibliografia ... 95

Índice de Figuras

Figura 1.1 - Estrutura genérica de molécula de tensioativo. ... 4 Figura 1.2 - Representação esquemática do comportamento de um tensioativo em solução. ... 5 Figura 1.3 - Estruturas auto-organizadas de moléculas de tensioativos. ... 6 Figura 1.4 - Estrutura molecular do tensioativo aniónico dodecil sulfato de sódio. ... 7 Figura 1.5 - Esquema representativo da substituição de um grupo metilo do tensioativo catiónico DTAB por uma cadeia alquílica dodecílica e respetivas estruturas auto-organizadas. ... 7 Figura 1.6 - Estrutura molecular do tensioativo dodecanoil sarcosinato de sódio na forma zwiteriónica. ... 8 Figura 1.7 - Estrutura molecular de um tensioativo não iónico do tipo C12E4. ... 8

Figura 1.8 - Estrutura molecular do tensioativo cataniónico dodecanoato de dodeciltrimetilamónio. ... 9 Figura 1.9 - Estrutura genérica de um tensioativo gemini (a) com espaçador localizado entre os grupos polares ou (b) na região apolar (hidrofóbica); n = 1-10; m = 0-2; p = 16 -m; R1_{, R}2_{, R}3_{, R}4_,R5 _{e R}6 _{designam grupos substituintes de caráter hidrofóbico ou}

hidrofílico; x- _{designa contra-iões inorgânicos (adaptado}26_{). ... 10}

Figura 1.10 - Representação esquemática da relação entre as formas geométricas assumidas pelos tensioativos e parâmetro de empacotamento crítico. ... 11 Figura 1.11 - Representação esquemática da curvatura adoptada pelas estrututuras auto-organizadas e respetivos raios de curvatura (adaptado20_{). ... 13}

Figura 1.12 - Representação esquemática de um diagrama de fase de um sistema binário tensioativo/água (adaptado19_{)... 14}

Figura 1.13 - Representação esquemática do processo de micelização de um tensiativo não iónico. ... 16 Figura 1.14 - Representação esquemática do processo de micelização de um tensiativo iónico. ... 17 Figura 1.15 - Representação esquemática de um corte de secção transversal de um vesículo. A) fase normal B) fase reversa (adaptado33_{)... 20}

Figura 1.16 - Representação esquemática da formação de vesículos através métodos mecânicos (adaptado33_{). ... 22}

Figura 1.17 - Representação esquemática da formação de um par iónico numa mistura cataniónica na razão molar 1:1, (adaptado14_{). ... 24}

Figura 1.18 - Células em cultura da linha celular L929 cultivadas a baixa densidade celular. ... 27 Figura 1.19 - Esquema representativo da redução da resazurina por células viáveis. 29 Figura 1.20 - Representação esquemática da conversão de piruvato em lactato pela enzima LDH no meio extracelular de uma célula que apresenta danos. ... 30 Figura 1.21 - Estrutura molecular da doxorrubicina. ... 30 Figura 2.1 - Representação esquemática do sistema ótico de um microscópio de luz polarizada, (adaptado81_{)... 38}

Figura 2.2 - Micrografia obtida por microscopia DIC (à esquerda) e de luz polarizada (à direita), evidenciando a presença de cruz de malta devido à birrefringência em vesículos multilamelares para o sistema cataniónico CTAB/SOSo x+ _{= 0.10. ... 39}

Figura 2.3 - Representação esquemática da instrumentação de DLS (adaptado83_{). .. 40}

Figura 2.4 - Representação esquemática da dupla camada difusa de uma partícula carregada negativamente sujeita a um campo elétrico (adaptado83_{). ... 42}

Figura 2.5 - Esquema representativo do método da placa de Wilhelmy (adaptado84_{). 45}

Figura 3.1 - Aspeto macroscópico das soluções do sistema DDAB/SDS e respetivas micrografias: A) x+ _{= 0.30; B) x}+ _{= 0.80, a 5.0 mM. ... 57}

Figura 3.2 - Esquema representativo do comportamento de fase macroscópico das misturas cataniónicas gemini/SDS. No diagrama, os pontos representam as composições estudadas... 58 Figura 3.3 - Micrografias do comportamento em solução das misturas gemini/SDS. A) imagem exemplificativa da presença de precipitado; B), C) agregados formados pelos sistemas 12-6-12/SDS e 12-12-12/SDS para x+ _{= 0.30 respetivamente, a 5.0 mM. ... 59}

Figura 3.4 - Esquema representativo do comportamento de fase macroscópico do sistema DDAB/SDDS. No diagrama, os pontos representam as composições estudadas. ... 60 Figura 3.5 - Micrografias dos agregados vesiculares presentes em solução aquosa para o sistema DDAB/SDDS, para as razões molares x+_{= 0.30, 0.40, 0.60 (A, B, C,}

respetivamente), a 5.0 mM. ... 61 Figura 3.6 - Esquema representativo do comportamento de fase macroscópico das soluções dos sistemas gemini/SDDS. No diagrama, os pontos representam as composições estudadas... 61 Figura 3.7 - Micrografias do sistema 12-2-12/SDDS: A) x+_{= 0.40; B) x}+ _{= 0.50 C) imagem}

exemplificativa de separação de fase líquido-líquido para a composição x+ _{= 0.50 no}

Figura 3.8 - Micrografias dos agregados formados pelos sistemas baseados em CTAB a 5.0 mM. ... 64 Figura 3.9 - Micrografias dos agregados formados pelos sistemas baseados em DTAB/12Lys8 a 5.0 mM. ... 65 Figura 3.10 – Representações gráficas da tensão superficial em função do logaritmo neperiano da concentração molal de tensioativos dos sistemas baseados em SDS, a 25 °C. ... 67 Figura 3.11 - Representações gráficas da tensão superficial em função do logaritmo neperiano da concentração molal de tensioativos dos sistemas baseados em SDDS, a 25 °C. ... 69 Figura 3.12 - Representações gráficas da tensão superficial em função do logaritmo neperiano da concentração molal de tensioativos dos sistemas baseados em CTAB, a 27 °C. ... 70 Figura 3.13 - Viabilidade celular (atividade metabólica) das células L929 em função da concentração de tensioativos aplicados no meio de cultura, para o sistema DDAB/SDS

x+ _{=0.30 (A, C) x}+ _{= 0.80 (B, D) e dos respetivos componentes individuais (E), DDAB;}

SDS (F). ... 73 Figura 3.14 - Viabilidade celular (atividade metabólica) das células L929 em função da concentração de tensioativos aplicados no meio de cultura, para o sistema 12-6-12/SDS

x+ _{= 0.30 (A, C); 12-12-12/SDS x}+ _{= 0.30 (B, D) e dos respetivos componentes}

individuais, (E) 12-6-12; 12-12-12 (F)... 75 Figura 3.15 - Viabilidade celular (atividade metabólica) das células L929 em função da concentração de tensioativos aplicados no meio de cultura, para o sistema DDAB/SDDS

x+ _{= 0.30 (A, C); x}+ _{= 0.60 (B, D) e dos respetivos componentes individuais DDAB (E);}

SDS (F). ... 77 Figura 3.16 - Viabilidade celular (atividade metabólica) das células L929 em função da concentração de tensioativos aplicados no meio de cultura, para o sistema 12-2-12/SDDS x+ _{= 0.40 (A, B); e para o tensioativo 12-2-12 (C). ... 78}

Figura 3.17 - Viabilidade celular (atividade metabólica) das células L929 em função da concentração de tensioativos aplicados no meio de cultura, para o sistema CTAB/SOSo

x+ _{= 0.10 (A, C); x}+ _{= 0.50 (B, D) e dos respetivos componentes individuais CTAB (E); e}

SOSo (F). ... 80 Figura 3.18 - Viabilidade celular (atividade metabólica) das células L929 em função da concentração de tensioativos aplicados no meio de cultura, para o sistema CTAB/SOS

Figura 3.19 - Viabilidade celular (atividade metabólica) das células L929 em função da concentração de tensioativos aplicados no meio de cultura, para o sistema CTAB/SDeSo x+ _{= 0.40 (A, C); x}+ _{= 0.60 (B, D) e dos respetivos componentes}

individuais CTAB (E); e SDeSo (F). ... 82 Figura 3.20 - Viabilidade celular (atividade metabólica) das células L929 em função da concentração de tensioativo aplicados no meio de cultura, para o sistema DTAB/12Lys8

x+ _{= 0.50 (A, C); x}+ _{= 0.75 (B, D) e dos respetivos componentes individuais DTAB (E);}

e 12Lys8 (F)... 83 Figura 3.21 - Variação do tamanho médio dos agregados vesiculares extrudidos ao longo de 15 dias. ... 89 Figura 3.22 - Curva de calibração da DOX em água (A) e respetivo espectro de fluorescência (B). ... 90

Índice de Tabelas

Tabela 1.1 - Relação entre o Ps, e as diferentes estruturas auto-organizadas. …………13

Tabela 1.2 - Classificação dos vesículos de acordo com o seu tamanho e o número de bicamadas no agregado. ……….20

Tabela 1.3 - Principais formulações lipossomais de doxorrubicina atualmente disponíveis no mercado. ………..31

Tabela 2.1 - Tensioativos catiónicos utilizados no decurso deste trabalho. ……….34

Tabela 2.2 - Tensioativos aniónicos utilizados no decurso deste trabalho. ………..34

Tabela 2.3 - Misturas cataniónicas estudadas. ……….36

Tabela 3.1 - Misturas cataniónicas da série I. ………...55

Tabela 3.2 - Misturas cataniónicas da série II. ………..56

Tabela 3.3 - Misturas cataniónicas da série III. ……….56

Tabela 3.4 - Diâmetro hidrodinâmico médio (z-average) e respetivo desvio padrão, índice de polidispersão (PDI) e frequência populacional dos vesículos cataniónicos da série I. ……….59

Tabela 3.5 - Potencial zeta dos vesículos cataniónicos da série I. ……….60

Tabela 3.6 - Diâmetro hidrodinâmico médio (z-average) e respetivo desvio padrão, índice de polidispersão (PDI) e frequência populacional dos vesículos cataniónicos da série II. ………62

Tabela 3.7 - Potencial zeta dos vesículos cataniónicos da série II. ………63

Tabela 3.8 - Diâmetro hidrodinâmico médio (z-average) e respetivo desvio padrão, índice de polidispersão (PDI) e frequência populacional dos vesículos cataniónicos da série III. ………...65

Tabela 3.9 - Potencial zeta dos vesículos cataniónicos da série III. ………..66

Tabela 3.11 - Parâmetros interfaciais das misturas cataniónicas da série II. …………...70 Tabela 3.12 - Parâmetros interfaciais das misturas cataniónicas da série III. …………71 Tabela 3.13 - Valores de IC50 e respetivos desvios padrão dos sistemas da série I e dos respetivos tensioativos individuais determinados pelo ensaio da resazurina, após 24 h e 48 h de exposição aos compostos, em células L929. ………..76 Tabela 3.14 - Valores de IC50 e respetivos desvios padrão dos sistemas da série II e dos respetivos tensioativos individuais determinados pelo ensaio da resazurina, após 24 h e 48 h de exposição aos compostos, em células L929. ………79 Tabela 3.15 - Valores de IC50 e respetivos desvios padrão dos sistemas da série III e dos respetivos tensioativos individuais determinados pelo ensaio da resazurina, após 24 h e 48 h de exposição aos compostos, em células L929. ………84 Tabela 3.16 - Valores de IC5048h e respetivos desvios padrão dos sistemas da série I e

dos respetivos tensioativos individuais determinados pelos ensaios da LDH e da resazurina, após 48 h de exposição aos compostos, em células L929. ………85 Tabela 3.17 - Valores de IC5048h e respetivos desvios padrão dos sistemas da série II e

dos respetivos tensioativos individuais determinados pelos ensaios da LDH e resazurina após 48 h de exposição aos compostos, em células L929. ………86 Tabela 3.18 - Valores de IC5048h e respetivos desvios padrão dos sistemas da série III

e dos respetivos tensioativos individuais determinados pelo ensaio da LDH e resazurina após 48 h de exposição, em células L929. ………87 Tabela 3.19 - Diâmetro hidrodinâmico médio (z-average) e desvio padrão associado, índice de polidispersão (PDI) e potencial zeta dos vesículos cataniónicos extrudidos. 88 Tabela 3.20 - Diâmetro hidrodinâmico médio e desvio padrão associado, potencial zeta e eficiência de encapsulação de DOX por parte dos sistemas cataniónicos DDAB/SDDS

Lista de Abreviaturas e Símbolos

DTAB Brometo de dodeciltrimetilamónio

cmc Concentração micelar crítica

cac Concentração de agregação crítica CTAB Brometo de hexadeciltrimetilamónio

CTAT p-toluenosulfonato de hexadeciltrimetilamónio

CM Controlo de morte

Cv Controlo de vida

DDAB Brometo de didodecildimetilamónio

DLS Dynamic light scattering (dispersão dinâmica de luz)

DOX Doxorrubicina

IC50 Metade da concentração inibitória máxima LDH Lactate Dehydrogenase (lactato desidrogenase)

PDI Polydispersity index (índice de polidispersão)

RMN Ressonância magnética nuclear SDBS Dodecilbenzenosulfonato de sódio SDDS Dodecanoilsarcosinato de sódio SDcSo Dodecilsulfonato de sódio SDeSo Decilsulfonato de sódio SDS Dodecilsulfato de sódio SOS Octilsulfato de sódio SOSo Octilsulfonato de sódio

12Lys8 N-dodecanoíl-Nε-octanoíl-lisinato de sódio

12-2-12 Brometo de etanodiil--bis(dodecildimetilamónio) 12-6-12 Brometo de hexanodiil--bis(dodecildimetilamónio) 12-12-12 Brometo de dodecanodiil--bis(dodecildimetilamónio) DAPI 4',6'-diamino-2-fenil-indol

MTT Brometo de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2, 5-difenil-2H-tetrazólio XTT

2,3-bis-(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-2H-tetrazólio-5-carboxanilida

WST-1 4-[3-(4-iodofenil)-2-(4-nitrofenil)-2H-5-tetrazólio]-1,3-benzeno disulfonato

A

Absorvância

a

gp Área interfacial ótima do grupo polar do tensioativo

   Tensão superficial

ΔH

Variação de entalpia

ΔG

Variação de energia de Gibbs

ΔS

Variação de entropia

D

h Diâmetro hidrodinâmico

D

Coeficiente de difusão F Força

H

o Curvatura espontânea

λ

Comprimento de onda

k

B

Constante de Boltzmann

l

ch Comprimento do grupo apolar do tensioativo

η

Viscosidade

n

ʼ Índice de refração

n

Quantidade de substância

P

s Parâmetro de empacotamento crítico

R Constante dos gases ideais

R

h Raio hidrodinâmico

T

Kr Temperatura de Krafft

T

m Temperatura de transição gel-cristal líquido

V

ch Volume do grupo apolar do tensioativo

µ

Potencial químico

x

Fração molar

1.1. Âmbito do trabalho

As misturas cataniónicas, misturas aquosas de um tensioativo catiónico e um tensioativo aniónico, devido ao forte caráter associativo e comportamento não ideal, exibem frequentemente interessantes efeitos sinergísticos nas suas propriedades interfaciais e de agregação.1, 2 _{Quando comparadas com os tensioativos individuais que}

as constituem, estas misturas são superficialmente mais ativas, apresentam fenómenos de adsorção mais acentuados e os seus valores de concentração de agregação crítica são consideravelmente inferiores. Além disso, apresentam comportamento de fase rico, e, de acordo com a razão molar e a concentração total de tensioativo, é possível a formação de agregados de diversos tipos e dimensões.1, 3-5 _{Todas estas características}

fazem destas misturas um alvo de grande interesse não apenas em estudos fundamentais (por exemplo, em estudos de modelos membranares), mas também em aplicações em áreas como a nanotecnologia e as áreas biomédica e farmacêutica.6-8

O trabalho aqui apresentado insere-se num programa de investigação mais vasto centrado no estudo das propriedades químico-físicas e biológicas de vesículos cataniónicos (a fim de se explorar o seu potencial como sistemas viáveis de veiculação de fármacos e de outras moléculas de interesse biológico ou biomédico), liderado por um grupo de investigação do Centro de Investigação em Química da Universidade do Porto, em parceria com outros grupos.9-13 _{As misturas cataniónicas são de especial}

interesse, dado que frequentemente possibilitam a formação espontânea de vesículos estáveis em regime diluído 14 _{Além disso, os vesículos cataniónicos apresentam elevada}

estabilidade coloidal e possibilitam a modulação das suas características estruturais (por ex., carga e tamanho), constituindo assim, devido à sua versatilidade, uma abordagem alternativa e interessante aos vesículos convencionais, constituídos tipicamente por fosfolípidos.12, 15

Os objetivos concretos deste trabalho assentaram assim:

(i) na caracterização de um conjunto de sistemas cataniónicos previamente escolhidos, com composições específicas, nos quais se verificasse a formação de vesículos estáveis (quer globalmente catiónicos, quer globalmente aniónicos) em regime de concentração diluído;

(ii) na avaliação do perfil toxicológico destes sistemas de modo a inferir acerca da possibilidade do seu uso em aplicações biomédicas;

(iii) na avaliação preliminar da capacidade de encapsulação de moléculas de interesse biológico, tendo sido escolhido como alvo, um fármaco anticancerígeno (doxorrubicina).

Os sistemas cataniónicos selecionados para o presente trabalho consistiram em misturas binárias aquosas de tensioativos comerciais comuns, tensioativos gemini de amónio quaternário e tensioativos derivados de aminoácidos. Para a maioria dos sistemas aqui estudados, existem já estudos anteriores reportando a formação de vesículos estáveis.13, 16-18 _{No entanto, para composições específicas das misturas, não}

existem dados estruturais (por ex. tamanho médio e potencial zeta) e interfaciais (concentrações de agregação críticas) que permitissem prosseguir diretamente para estudos biológicos sistemáticos, nomeadamente o perfil toxicológico e capacidade de encapsulação dos vesículos.

Deste modo, neste capítulo introdutório começaremos por fazer uma breve abordagem à classe de compostos utilizados no presente trabalho, isto é, aos tensioativos, apresentando as suas propriedades básicas e gerais. Uma vez que este trabalho tem como tema o estudo de vesículos cataniónicos, serão também apresentadas as suas propriedades básicas bem como a relevância das suas potenciais aplicações, em particular na entrega dirigida e controlada de fármacos. Ainda neste capítulo, serão apresentados alguns aspetos importantes na avaliação da citotoxicidade em cultura de células, assim como os ensaios utilizados – ensaio da resazurina e da libertação da LDH - na avaliação da atividade biológica das misturas cataniónicas.

1.2. Tensioativos

Os tensioativos constituem uma vasta classe de compostos orgânicos de origem natural ou sintética com aplicabilidade em áreas muito distintas entre si, como por exemplo, em processos de detergência, emulsificação, dispersão, compartimentalização e molhabilidade, e a nível industrial, na área dos produtos de limpeza, tintas, indústria alimentar, cosmética, têxtil, biomédica e farmacológica, entre outras.19 _{Estes compostos, quando de origem natural, podem ainda ser encontrados em}

sistemas biológicos, citando-se a título de exemplo os fosfolípidos (constituintes maioritários de biomembranas), os sais biliares (fundamentais na emulsificação e absorção das gorduras provenientes da dieta alimentar) e ainda o tensioativo pulmonar (que permite a expansão e contração dos alvéolos).20

1.2.1. Estrutura molecular, propriedades básicas e classes de

tensioativos

A nível estrutural os tensioativos são moléculas constituídas por duas regiões fisicamente separadas e bem definidas entre si: uma região polar (hidrofílica), constituída por grupos carregados ou por grupos neutros, e por uma região apolar (hidrofóbica), constituída geralmente por hidrocarbonetos (desde cadeias hidrocarbonadas, ou grupos aromáticos ou policíclicos) (Figura 1.1). A coexistência destas duas regiões de diferentes polaridades leva a que as moléculas de tensioativos apresentem diferentes afinidades num dado solvente aquoso ou oleoso. Para um solvente genérico, a região que interage favoravelmente com o solvente diz-se solvofílica, enquanto que a região que previne o contacto com o solvente diz-se solvofóbica.20

Figura 1.1 - Estrutura genérica de molécula de tensioativo.

O caráter anfifílico das moléculas de tensioativos confere-lhes propriedades únicas, tais como:

 a adsorção em interfaces do tipo polar/apolar;

 a auto-organização em agregados coloidais na presença de solventes polares.

As moléculas de tensioativo, quando em solução aquosa, de modo a evitar interações energeticamente desfavoráveis entre as caudas hidrofóbicas e as moléculas de solvente, tendem a adsorver em interfaces do tipo polar/apolar, tais como água/ar ou água/óleo, orientando-se de maneira a que a cabeça polar fique voltada para a fase aquosa (polar) e a cauda hidrofóbica para a fase apolar. Consequentemente, forma-se um filme molecular na interface e verifica-se uma drástica diminuição da tensão superficial da solução.

No entanto, a tensão superficial não diminui indefinidamente. O seu valor mínimo é atingido aquando do início do processo de auto-organização das moléculas de tensioativo (unímeros). A auto-organização dos unímeros constitui outro modo de evitar o contacto entre as caudas hidrofóbicas e as moléculas de água, sendo este um processo termodinamicamente espontâneo cuja principal força motriz é o efeito hidrofóbico. Frequentemente, os tensioativos auto-organizam-se em solução aquosa formando como primeiros agregados, estruturas denominadas micelas, nas quais as caudas são empacotadas no interior do agregado, ficando as cabeças polares em contacto com as moléculas de solvente (Figura 1.2).

A auto-organização inicia-se somente a partir de um determinado valor de concentração, designada por concentração micelar crítica (cmc) ou, mais genericamente, por concentração de agregação crítica (cac), e acima da temperatura de solubilização (ou temperatura de Krafft, Tkr) do tensioativo em causa. Após a cac

verifica-se a coexistência em solução de estruturas auto-organizadas, (como por Figura 1.2 - Representação esquemática do comportamento de um tensioativo em solução.

exemplo, micelas) e de unímeros, permanecendo a concentração destes aproximadamente constante.

O tipo de estrutura auto-organizada depende não só da própria estrutura molecular do tensioativo, mas também de parâmetros experimentais como a temperatura, a concentração de tensioativo e a força iónica do meio, entre outros fatores.

Os agregados podem ser estruturas discretas de tamanho finito, como as micelas e os vesículos, ou podem ser estruturas virtualmente infinitas como os cristais líquidos. Na Figura 1.3 encontram-se alguns exemplos de estruturas auto-organizadas.

Figura 1.3 - Estruturas auto-organizadas de moléculas de tensioativos.

A existência de uma grande variedade de tensioativos, juntamente com o desenvolvimento acentuado e constante de novas moléculas que visam diferentes aplicações, torna a classificação desta classe de compostos complexa. Contudo, os tensioativos podem ser classificados genericamente de acordo com a carga do grupo polar, dividindo-se assim em aniónicos, catiónicos, zwiteriónicos, não-iónicos e cataniónicos. Os tensioativos podem ainda ser classificados quanto à cadeia hidrofóbica. Geralmente, o grupo hidrofóbico é constituído por uma cadeia alquílica longa (mais de 8 átomos de carbono), podendo apresentar algumas diferenças estruturais, nomeadamente a presença de cadeias lineares ou ramificadas e grau de insaturação. Os tensioativos convencionais são formados por um grupo polar e por uma ou duas cadeias alquílicas.

Tensioativos aniónicos. Representam a maior classe de tensioativos sintéticos,

(Figura 1.4) sendo amplamente utilizados em formulações de detergentes e como agentes emulsionantes.19 _{Os mais usuais são os tensioativos de cadeia simples,}

contendo como grupo polar os carboxilatos (-COO-_{), os sulfatos (-OSO}

(-SO3-) ou os fosfatos (- PO43-); e como contra iões o sódio, o potássio, o amónio, o

cálcio ou ainda catiões alquilamónios.

Figura 1.4 - Estrutura molecular do tensioativo aniónico dodecil sulfato de sódio.

Tensioativos catiónicos. Esta classe de tensioativos é essencialmente constituída por

tensioativos derivados de um amónio ou uma amina quaternária. Embora sejam menos utilizados do que os tensioativos aniónicos por acarretarem problemas ambientais acrescidos, integram uma classe fundamental em diversas aplicações tecnológicas relacionadas com a modificação de superfícies.19 _{São tipicamente utilizados em}

amaciadores de roupa e em condicionadores de cabelo. Além disso, podem ter ação bactericida, possibilitando o seu uso em produtos antibacterianos.21 _{A principal}

vantagem dos tensioativos derivados de amónio quaternário assenta na facilidade de modular tanto o número de cadeias hidrocarbonadas como o tamanho do grupo polar, sendo concomitantemente possível transitar de estruturas micelares para estruturas em bicamada.20 _{A Figura 1.5 ilustra a substituição de um grupo metilo do tensioativo DTAB}

por uma cadeia alquílica dodecílica , originado o tensioativo de dupla cadeia DDAB e as estruturas auto-organizadas formadas em meio aquoso, respetivamente micelas e vesículos.

Figura 1.5 - Esquema representativo da substituição de um grupo metilo do tensioativo catiónico DTAB por uma cadeia alquílica dodecílica e respetivas estruturas auto-organizadas.

Tensioativos zwiteriónicos. Os tensioativos zwiteriónicos possuem dois grupos

polares com carga de sinais contrários (Figura 1.6). O grupo polar catiónico é frequentemente uma amina ou um catião de amónio quaternário, enquanto que os grupos polares aniónicos mais comuns são os carboxilatos, os fosfatos e os sulfonatos. Esta classe de tensioativos apresenta elevada compatibilidade com as restantes classes de tensioativos. Por apresentarem baixa irritação ocular e dérmica, são frequentemente utilizados em formulações de cuidados de higiene e cosméticos. Uma subclasse particularmente importante devido à sua biocompatibilidade e biodegradabilidade, são os tensioativos zwiteriónicos derivados de aminoácidos.20

Figura 1.6 - Estrutura molecular do tensioativo dodecanoil sarcosinato de sódio na forma zwiteriónica.

Tensioativos não-iónicos. Os tensioativos não-iónicos englobam moléculas anfifílicas

cujo grupo polar não possui carga, sendo a sua parte hidrofílica geralmente constituída por grupos polares de polihidroxilos ou poliéteres, como por exemplo unidades de oxi-etileno (Figura 1.7). Os tensioativos derivados de óxidos de oxi-etileno são os mais usuais (tensioativos etoxilados), normalmente referidos como CmEn, em que m designa o

número de átomos de carbono na cadeia hidrocarbonada e n o número de unidades de óxido de etileno presentes na região polar.20 _{O aumento de unidades de óxido de etileno}

no grupo polar e, por conseguinte, o aumento da polaridade levam ao aumento da solubilidade em solventes aquosos/polares, assim como ao aumento dos valores de

cmc.22 _{As principais vantagens dos tensioativos não-iónicos residem no facto de serem}

insensíveis a águas duras e apresentarem elevada compatibilidade com todas as outras classes de tensioativos.19 _{Quanto as aplicações, são frequentemente utilizados em}

detergentes devido à sua grande capacidade espumante e na indústria alimentar como espessantes e emulsionantes.

Tensioativos cataniónicos. Os tensioativos cataniónicos resultam da formação de um

par iónico entre um tensioativo catiónico e um tensioativo aniónico, com remoção dos respetivos contra-iões (Figura 1.8). A formação do par cataniónico ocorre por interação eletrostática entre os grupos polares. Os tensioativos cataniónicos, preparados pela primeira vez por Scott e colaboradores,23 _{exibem propriedades interessantes e que}

diferem significativamente das dos tensioativos individuais que os constituem. Existe um forte sinergismo das propriedades de agregação e interfaciais (o par cataniónico é mais ativo superficialmente e apresenta maior capacidade de adsorção em superfícies), e valores de cmc muito inferiores aos dos tensioativos individuais.24

Figura 1.8 - Estrutura molecular do tensioativo cataniónico dodecanoato de dodeciltrimetilamónio.

No que concerne à estrutura molecular, pode ainda referir-se outras classes de tensioativos. Os tensioativos que possuem um grupo polar em cada extremidade da cadeia hidrofóbica denominam-se tensioativos do tipo bolaforme. Os tensioativos do tipo diméricos ou gemini são constituídos por duas caudas hidrofóbicas ligadas covalentemente a dois grupos polares (ou na sua proximidade) através de um espaçador de comprimento variável.25 _{(Figura 1.9). O espaçador pode ser hidrofílico ou}

hidrofóbico. Estes tensioativos por apresentarem propriedades melhoradas comparativamente aos seus análogos monoméricos têm sido alvo de grande interesse tanto a nível académico como em aplicações industriais.

Figura 1.9 - Estrutura genérica de um tensioativo gemini (a) com espaçador localizado entre os grupos polares ou (b) na região apolar (hidrofóbica); n = 1-10; m = 0-2; p = 16 -m; R1_{, R}2_{, R}3_{, R}4_,R5 _{e R}6 _designam

grupos substituintes de caráter hidrofóbico ou hidrofílico; x- _{designa contra-iões inorgânicos (adaptado}26_).

Quanto às propriedades interfaciais, os tensioativos gemini são superficialmente mais ativos e apresentam valores de cmc 1 a 2 ordens de grandeza inferiores aos correspondentes tensioativos convencionais monoméricos27_{. Normalmente, as}

propriedades reológicas das suas soluções aquosas diluídas são melhoras, exibindo elevada viscosidade e/ou comportamento viscoelástico. Os tensioativos gemini mais usuais são os sais bis-quaternários de amónio e frequentemente têm atividade biológica antimicrobiana.28

1.2.2. Auto-agregação e modelos de racionalização

As moléculas de tensioativos, devido ao seu caráter anfifílico, possuem a capacidade de auto-agregação num dado solvente - geralmente aquoso ou de natureza polar - formando diferentes tipos de estruturas auto-organizadas de dimensão coloidal (0.1 – 10 µm). O processo de auto-agregação é um processo espontâneo que visa a minimização da energia de Gibbs do sistema, sendo conduzido maioritariamente pelo efeito hidrofóbico, que se relaciona com a remoção das cadeias apolares do contacto com o meio aquoso, resultando numa elevada variação positiva de entropia (e consequentemente numa variação de energia de Gibbs negativa) e, portanto, num processo termodinamicamente favorável.

Por outro lado, no decorrer do processo de agregação surgem interações termodinamicamente desfavoráveis, nomeadamente: repulsões estéreas (em todas as classes de tensioativos) e eletrostáticas entre grupos polares hidratados (estas últimas apenas em tensioativos iónicos); restrições conformacionais impostas pelo empacotamento das cadeias hidrofóbicas no interior do agregado; e a criação de uma nova região interfacial entre solvente-superfície do agregado. Assim sendo, apesar do efeito hidrofóbico ser o fator dominante que promove o início da agregação, as repulsões

entre os grupos polares ditam o fim do processo, favorecendo a formação de agregados com tamanhos e formas bem definidos. A forma dos auto-agregados pode ser prevista através de dois modelos teóricos que serão apresentados em seguida.20

1.2.2.1. Parâmetro de empacotamento crítico

O parâmetro de empacotamento crítico, Ps é um modelo de racionalização de

agregação que permite prever o tipo de agregado preferencial de acordo com a estrutura molecular do tensioativo.

Este modelo relaciona a forma geométrica da molécula de tensioativo, tendo como estrutura de referência um cilindro, com o tipo de agregado que esta tende a formar através da seguinte relação (Figura 1.10).29, 30

𝑃

_𝑠

=

𝑉𝑐ℎ

𝑎𝑔𝑝 𝑙𝑐ℎ

(1.1)

onde 𝑉𝑐ℎ e 𝑙𝑐ℎ representam o volume e o comprimento de uma cadeia hidrocarbonada

distendida, respetivamente, e 𝑎𝑔𝑝 é definido como a área efetiva hidratada do grupo

polar.

Figura 1.10 - Representação esquemática da relação entre as formas geométricas assumidas pelos tensioativos e parâmetro de empacotamento crítico.

Assim sendo, os tensioativos cujo volume da cadeia hidrofóbica é inferior à área efetiva do grupo polar de tal modo que a molécula assuma a forma geométrica de um cone (por exemplo, tensioativos de cadeia simples e elevada área do grupo polar), apresentam valores de Ps entre 1/3 e 1/2 o que favorece a formação de agregados

micelares esféricos e cilíndricos, respetivamente. Se o volume da cadeia hidrofóbica é igual ao volume do cilindro (tensioativos de cadeia dupla e área do grupo polar pequena), Ps ~ 1 as moléculas tendem a auto-organizar-se em bicamadas planas. Os

preferencialmente bicamadas flexíveis e vesículos. Valores de Ps > 1 correspondem a

moléculas de tensioativo cuja forma geométrica corresponde a um cone truncado com tendência a formarem micelas esféricas e cilíndricas de curvatura negativa (micelas invertidas).

O volume, 𝑉𝑐ℎ e o comprimento 𝑙𝑐ℎ de uma cadeia hidrocarbonada saturada e

distendida podem ser determinados, através das seguintes equações:20, 30

𝑉𝑐ℎ/ 𝑛𝑚3= 0.027 𝑛CH2+ 0.055 𝑛CH3 (1.2)

𝑙𝑐ℎ / 𝑛𝑚 = 0.150 𝑛CH₃ + 0.127 𝑛CH₂ (1.3)

onde 𝑛CH2 𝑒 𝑛CH3 denotam o número de grupos CH2 e CH3 respetivamente, na cadeia

hidrocarbonada.

A área do grupo polar, 𝑎𝑔𝑝 , não é uma simples relação entre a forma geométrica

e o tamanho do grupo polar. É um parâmetro termodinâmico difícil de estimar, e que pode variar significativamente de acordo com a concentração de tensioativo em solução, a temperatura e a força iónica.

1.2.2.2. Modelo da curvatura espontânea

Um outro modelo de racionalização para o processo de auto-agregação de tensioativos designa-se como modelo da curvatura espontânea, H0. Este modelo

assenta na curvatura média preferencial assumida pelo filme de tensioativo à superfície do agregado, sendo definida pela seguinte expressão:20

𝐻

₀

=

1 2

(

1 𝑅1

+

1 𝑅2

)

(1.4)

onde R1 e R2 são os raios de curvatura ortogonais, como se pode observar na Figura

1.11.

Por convenção atribui-se o sinal positivo ao raio cuja componente vetorial aponta para a região polar. A curvatura média preferencial assumida pelo filme de tensioativo é aquela que visa a minimização da energia de Gibbs do sistema.

Figura 1.11 - Representação esquemática da curvatura adoptada pelas estrututuras auto-organizadas e respetivos raios de curvatura (adaptado20_).

O modelo da curvatura espontânea relaciona-se com o parâmetro de empacotamento crítico, uma vez que a curvatura preferencial que o filme de tensioativo tende a assumir depende do volume relativo entre as partes polares e apolares do tensioativo. Na Tabela 1.1 encontra-se a relação entre a curvatura média espontânea e o parâmetro de empacotamento crítico.

Tabela 1.1 - Relação entre o Ps, e as diferentes estruturas auto-organizadas.

1.3. Micelização

Tal como referido anteriormente, as propriedades únicas exibidas pelos tensioativos resultam do seu carácter anfifílico. Tanto a adsorção dos tensioativos em interfaces do tipo ar/água como a auto-organização em solução aquosa são fenómenos conduzidos maioritariamente pelo efeito hidrofóbico. Isto é, ocorrem de modo a evitar interações desfavoráveis entre as caudas hidrofóbicas e as moléculas de água, tendo como objetivo a minimização da energia de Gibbs do sistema.

Os tensioativos, apesar do seu caráter anfifílico, quando em solução aquosa apresentam uma certa solubilidade (característica de cada tensioativo) na forma de unímeros. Quando a concentração de tensioativo em solução excede a sua solubilidade, atinge-se a concentração micelar crítica, dando-se o início o processo de micelização. A partir da cmc todo o tensioativo adicionado à solução é solubilizado na forma de micelas. Acima da cmc, as micelas coexistem com os unímeros, sendo a concentração destes aproximadamente constante. De referir que o processo de micelização apenas ocorre acima da temperatura de Krafft, definindo-se estritamente esta como a temperatura na qual a solubilidade do tensioativo na forma de unímeros iguala a cmc (Figura 1.12).

Figura 1.12 - Representação esquemática de um diagrama de fase de um sistema binário tensioativo/água (adaptado19_).

No processo de micelização, o balanço entre as interações favoráveis, e desfavoráveis dita a forma e tamanho do agregado micelar, assim como o valor da cmc. Este valor é característico de cada tensioativo, variando de acordo com a estrutura química do tensioativo e condições experimentais, tais como a força iónica do meio, o tipo de solvente e a temperatura.

1.3.1. Modelos termodinâmicos do processo de micelização

Neste trabalho serão abordados os modelos termodinâmicos mais empregues para descrever o processo de micelização: o modelo da pseudo-separação de fase e o modelo da lei da ação de massas ou do equilíbrio.20

1.3.1.1. Modelo da pseudo-separação de fases

O modelo da pseudo-separação de fase parte da premissa que o processo de micelização é análogo a um processo de separação de fase no que concerne à cooperatividade e à formação de uma nova fase condensada, a micela. De facto, a micelização é um processo cooperativo no qual a adição de uma nova molécula de tensioativo na micela em formação, contendo N-moléculas, torna-se mais favorável à medida que N aumenta, tal como num processo de separação de fase. No entanto, a micelização não ocorre indefinidamente. É antes um processo “start-stop”, no qual as micelas apresentam um número de agregação, Nag, finito.

Assim sendo, este modelo falha ao considerar a micela como uma nova fase, pois tal implicaria um número de agregação infinito. Apesar de apresentar limitações, este modelo permite descrever a formação de micelas como ocorrendo a uma concentração de tensioativo bem definida, bem como calcular a energia de Gibbs molar de micelização padrão, Δmic𝐺𝑚o.

Quando a agregação ocorre, as micelas coexistem com os unímeros em solução, sendo a concentração de unímeros aproximadamente constante e igual à cmc. O potencial químico do tensioativo no estado unímero,

𝜇

_un,é dado pela seguinte expressão:

𝜇

_un

= 𝜇ᵒ

_𝑢𝑛

+ 𝑅𝑇𝑙𝑛𝑥

_𝑐𝑚𝑐

(1.5)

onde 𝜇ᵒ𝑢𝑛 designa o potencial químico padrão do unímero, 𝑅 a constante dos gases

ideais, 𝑇 a temperatura absoluta e 𝜒𝑐𝑚𝑐 a concentração micelar crítica, expressa em

fração molar de tensioativo, uma vez que se considera como estado de referência uma solução de tensioativo infinitamente diluída. Assim, o coeficiente de atividade do unímero, 𝛾𝑢𝑛 ,toma valor unitário e a atividade 𝒶𝑢𝑛 pode ser aproximada à fração molar

tendo em conta a seguinte expressão:

𝒶

𝑢𝑛

= 𝛾

𝑢𝑛

. 𝜒

𝑢𝑛

(1.6)

Como neste modelo as micelas são consideradas como uma nova fase, o potencial químico da micela,

𝜇

_𝑚𝑖𝑐

,

é igual ao potencial químico padrão da micela,

𝜇ᵒ

_𝑚𝑖𝑐 (a atividade de uma fase é unitária):

𝜇

_𝑚𝑖𝑐

= 𝜇ᵒ

_𝑚𝑖𝑐

(1.7)

No equilíbrio de fases, a variação da energia de Gibbs molar de micelização é nula,

𝛥

_𝑚𝑖𝑐

𝐺

_𝑚

= 0 ↔ 𝛥

_𝑚𝑖𝑐

𝐺

_𝑚

= 𝜇

_𝑚𝑖𝑐

− 𝜇

_𝑢𝑛

= 0 ↔ 𝜇

_𝑚𝑖𝑐

= 𝜇

_𝑢𝑛

(1.8)

Segue-se então que:

𝜇°

_𝑚𝑖𝑐

= 𝜇ᵒ

_𝑢𝑛

+ 𝑅𝑇𝑙𝑛𝑥

_𝑐𝑚𝑐

(1.9)

Atendendo à definição de variação da energia de Gibbs molar de micelização padrão (como diferença entre os potencias químicos padrão de micela e unímero), segue-se então que:

𝛥

_𝑚𝑖𝑐

𝐺

ᵒ

𝑚

= 𝜇

ᵒ_𝑚𝑖𝑐

− 𝜇

ᵒ_𝑢𝑛

=

𝑅𝑇𝑙𝑛

𝜒_𝑐𝑚𝑐

(1.10)

1.3.1.2. Modelo da lei de ação de massas

O modelo da lei de ação de massas é um modelo mais elaborado, mas que se aproxima mais da realidade. Este modelo considera que as micelas têm um número de agregação bem definido (finito), descrevendo a micelização como um equilíbrio químico (Figura 1.13) contrariamente ao modelo de pseudo-separação de fases20_.

Figura 1.13 - Representação esquemática do processo de micelização de um tensiativo não iónico.

Considerando o equilíbrio químico, no qual N unímeros do tensioativo, S, se auto-organizam para formar um agregado SN, de acordo com a seguinte equação:

e respetiva constante de equilíbrio, KN, dada pela seguinte expressão:

𝐾

_𝑁

=

|𝑆𝑁|

|𝑆|𝑁

(1.11)

A concentração total de tensioativo em solução, ST, deverá ser a soma da

concentração de N agregados e da concentração de tensioativo, S, na forma de unímeros:

|𝑆|

_𝑇

= 𝑁|𝑆

_𝑁

| + |𝑆|

(1.12)

|𝑆|

_𝑇

= 𝑁𝐾

_𝑁

|𝑆|

𝑁

_{+ |𝑆|}

_(1.13)

Através da relação termodinâmica entre a energia de Gibbs padrão e a constante de equilíbrio

𝛥

_𝑚𝑖𝑐

𝐺ᵒ = −𝑅𝑇 𝑙𝑛𝐾

_𝑁

(1.14)

obtém-se a energia de Gibbs molar de micelização padrão:

𝛥

_𝑚𝑖𝑐

𝐺ᵒ

_𝑚

= −

𝑅𝑇

𝑁

|𝑆

𝑁

| + 𝑅𝑇 ln|𝑆|

(1.15)

Para descrever o processo de micelização de tensioativos iónicos (Figura 1.14), é necessário incluir na expressão 1.15 o efeito da dissociação de contra-iões na superfície micelar.

Tomando como exemplo um tensioativo aniónico, 𝑆𝐶−_{, o equilíbrio entre os seus}

unímeros 𝑆−_{, os contra-iões, 𝐶}+_{, e o agregado 𝑆}

𝑁 de carga net negativa (𝑁 − 𝑃)− pode

ser dado pela seguinte equação:

𝑁𝑆−_{+ 𝑃𝐶}+_{↔ 𝑆} 𝑁(𝑁−𝑃)

−

(1.16)

A respetiva constante de equilíbrio, 𝐾𝑁:

𝐾

_𝑁

=

|𝑆𝑁

(𝑁−𝑃)−_|

|𝑆−_|𝑁_+|𝐶+_|𝑃 (1.17)

α, designa o grau de ionização micelar e é dado pela seguinte expressão:

𝛼 =

𝑁−𝑃

𝑁

= 1 −

𝑃

𝑁

(

1.18

)

A energia de Gibbs molar padrão para o processo de micelização de tensioativos iónicos pode ser deduzida através da seguinte relação:

𝛥

_𝑚𝑖𝑐

𝐺ᵒ

_𝑚

=

𝛥𝑚𝑖𝑐𝐺ᵒ 𝑁

= −

𝑅𝑇 𝑁

ln|𝑆

𝑁 (𝑁−𝑃)−

| + 𝑅𝑇 ln |𝑆

−

_{| + (1 − ɑ)𝑅𝑇 ln|𝑐}

+

_|

_(1.19)

Quando o número de agregação N se encontra compreendido entre 50 a 500, sendo este o caso para a maioria das micelas esféricas, o termo ln|𝑆𝑁(𝑁−𝑃)−|/ 𝑁 pode

ser desprezado pelo que a equação 1.19 pode ser simplificada, obtendo-se então a seguinte expressão para a energia de Gibbs molar de micelização padrão para um tensioativo iónico:

𝛥

_𝑚𝑖𝑐

𝐺ᵒ

_𝑚

= (2 − ɑ)𝑅𝑇 ln 𝑐𝑚𝑐

(1.20)

1.3.2. Tensão superficial

Para um líquido em equilíbrio com o seu vapor verifica-se uma diferença de energia entre as moléculas que se encontram à superfície da fase condensada e as

moléculas localizadas no seio desta fase. Esta diferença resulta do facto das interações intermoleculares à superfície serem inferiores às forças intermoleculares existentes no interior da fase líquida/condensada, levando a que a superfície do líquido tenda a reduzir a sua área superficial. Por conseguinte, as moléculas que se encontram na superfície são atraídas (“puxadas”) para o interior do líquido fazendo com que a superfície se comporte como um filme elástico.31

Uma das características fundamentais dos tensioativos é a sua tendência a adsorver em interfaces. Os fenómenos de adsorção ocorrem de modo a evitar o contacto entre os grupos hidrofóbicos e as moléculas de água e, como tal, minimizar a energia de Gibbs do sistema. Assim sendo, a adsorção dos tensioativos nas interfaces conduz à diminuição da tensão superficial.

A tensão superficial corresponde numericamente à energia que tem de se fornecer ao sistema para aumentar, numa transformação isotérmica e isobárica, uma área superficial unitária:

𝛾 = (

𝑤𝑟𝑒𝑠 𝜕𝐴

)

_𝑇,𝑝

= (

𝜕𝐺 𝜕𝐴

)

_𝑇,𝑝

(1.21)

1.4. Vesículos

1.4.1. Estrutura e propriedades

Em 1965, D. A. Bragham e colaboradores reportaram pela primeira vez a formação de vesículos por dispersão mecânica de fosfolípidos em meio aquoso, os quais foram cunhados por lipossomas.32 _{Embora até aos dias de hoje a designação}

lipossoma seja frequentemente utilizada indistintamente para se referir a vesículos constituídos quer por lípidos naturais, quer por moléculas anfifílicas sintéticas como os tensioativos, adotou-se ao longo deste trabalho, o termo vesículo para designar os vesículos constituídos por tensioativos sintéticos.

Os vesículos definem-se como estruturas em bicamada, fechadas sobre si próprias, de forma tipicamente esférica, compreendendo dimensões na gama da escala nanométrica à micrométrica,33 _{com uma cavidade interna que separa um compartimento}

polares, sendo a água o solvente de eleição, é possível a sua formação em solventes apolares, obtendo-se vesículos de fase reversa33 _{(Figura 1.15).}

Figura 1.15 - Representação esquemática de um corte de secção transversal de um vesículo. A) fase normal B) fase reversa (adaptado33_).

Na caracterização estrutural dos vesículos, são vários os parâmetros que podem ser avaliados, em particular o tamanho médio, a distribuição de tamanho, o índice de polidispersão e a carga superficial. Em termos genéricos, os vesículos podem ser classificados de acordo com o seu tamanho e número de bicamadas que contêm (Tabela 1.2).

Tabela 1.2 - Classificação dos vesículos de acordo com o seu tamanho e o número de bicamadas no agregado.

Tipo de Vesículos Abreviatura Gama de tamanho /nm

Vesículos unilamelares ultrapequenos USUV 5 -10

Vesículos unilamelares pequenos SUV 10 - 50

Vesículos unilamelares grandes LUV 50 - 250

Vesículos unilamelares gigantes GUV > 250

Vesículos multilamelares MLV Centenas de nm a µm

Um outro parâmetro físico, particularmente importante, é a temperatura Tm,

temperatura à qual ocorre a transição de fase gel-cristal líquido para a bicamada. Para temperaturas inferiores a Tm, as bicamadas que constituem os vesículos encontram-se

num estado rígido e ordenado, com as cadeias hidrofóbicas e os grupos polares hidratados em configuração trans, correspondente à fase gel. Acima de Tm, na fase

moléculas de tensioativos podem experimentar movimentos rotacionais em torno do seu eixo, difusão lateral e flip-flop ao longo e entre as monocamadas, respetivamente.

A temperatura à qual o sistema se encontra, pode influenciar a morfologia dos vesículos. Os vesículos são usualmente esféricos quando no seu estado fluído, isto é, para T > Tm. Contudo, para temperaturas inferiores à Tm, podem sofrer alteração de

forma devido essencialmente à cristalização das cadeias apolares. Deste modo, várias estruturas não-esferóides têm sido reportadas na literatura, nomeadamente discos, fragmentos de bicamadas planas, estruturas irregularmente facetadas e tubulares33, 34_.

1.4.2. Métodos de formação

De acordo com o seu método de formação, os vesículos podem ser classificados em espontâneos ou em não-espontâneos.33 _{Nos métodos espontâneos, a formação de vesículos}

baseia-se na simples mistura de soluções dos constituintes individuais com fraca ou nenhuma agitação mecânica, originando normalmente vesículos com longa estabilidade coloidal e em alguns casos com estabilidade termodinâmica. Por outro lado, a formação de vesículos não-espontâneos envolve, normalmente, métodos que requerem muita energia, levando à formação de agregados apenas cineticamente estáveis. A formação de vesículos não espontâneos pode ser conseguida através de métodos mecânicos ou químicos.

Métodos mecânicos. Assentam na quebra da bicamada por aplicação de fortes

tensões de corte, por recurso à agitação, a sonicação e a extrusão. Estes métodos por requererem grandes quantidades de energia, produzem vesículos metaestáveis – isto é, vesículos que apresentam apenas estabilidade cinética (ou coloidal) e são termodinamicamente instáveis, pois não se encontram num estado de energia de Gibbs mínima. A Figura 1.16 ilustra os processos mecânicos que levam à formação não espontânea de vesículos, a partir de uma fase lamelar.

Figura 1.16 - Representação esquemática da formação de vesículos através métodos mecânicos (adaptado33_).

A hidratação da fase lamelar seguida de agitação vigorosa, promove a formação de vesículos multilamelares (MLVs, multilamellar vesicles). Após a obtenção de MLVs, diferentes métodos podem ser empregues para produzir dispersões homogéneas de vesículos unilamelares pequenos (SUVs, small unilamellar vesicles) ou vesículos unilamelares grandes (LUVs, large unilamellar vesicles). A sonicação é um método tipicamente utilizado, produzindo vesículos metaestáveis e relativamente polidispersos. Por outro lado, os métodos que envolvem a aplicação de altas pressões como a extrusão produzem lipossomas metaestáveis, contudo com tamanho e polidispersão controláveis.

Métodos químicos. Na formação de vesículos por métodos químicos, a composição da

bicamada é modificada de modo a quebrar a sua simetria, promovendo assim a alteração da curvatura média espontânea para um valor positivo. Tal pode ser conseguido através de diferentes abordagens: adição de um segundo tensioativo, alteração da carga superficial e da força iónica, adsorção de macromoléculas no folheto externo da bicamada, entre outras.

1.5. Misturas cataniónicas de tensioativos

As misturas cataniónicas, tal como a designação sugere, são formadas a partir da mistura de um tensioativo catiónico e de um tensioativo aniónico, sendo geralmente preparadas em meio aquoso para diferentes razões molares dos seus constituintes individuais. Os primeiros estudos experimentais destas misturas devem-se a Hargreaves e Deamer35 _{e a Khan et al,}36 _{cujo contributo na área de formação de}

vesículos por tensioativos foi fundamental para os estudos posteriores de Kaler, que reportou pela primeira vez a formação de estruturas vesiculares estáveis constituídas por misturas cataniónicas de tensioativos comerciais (CTAT/SDBS).37 _Mais

recentemente, as misturas cataniónicas têm sido alvo de grande interesse não apenas em estudos fundamentais, mas também em aplicações industriais.38

O seu interesse reside no facto de, quando comparadas com os seus constituintes individuais, apresentarem propriedades únicas e melhoradas, nomeadamente39_:

 comportamento de solução não ideal e forte sinergismo das propriedades de agregação e interfaciais - as misturas são superficialmente mais ativas e os valores de cac podem ser várias ordens de grandeza inferiores aos dos tensioativos individuais;

 comportamento de fase rico – de acordo com a razão molar e a concentração total dos tensioativos individuais, é possível a formação de agregados de diversos tipos e dimensões, tais como micelas, vesículos, túbulos e fases líquido-cristalinas;

 formação espontânea de vesículos estáveis em regime diluído;

 possibilidade de formar vesículos de carga superficial global positiva ou negativa, por variação da razão molar entre os constituintes da mistura.

Estas propriedades surgem devido às interações hidrofóbicas entre as cadeias apolares e à forte atração eletrostática entre os grupos polares dos tensioativos de carga oposta, que levam à formação de um par iónico (Figura 1.17), resultando que a variação