Avaliação da atividade antiparasitária do DETC em cepas de Trypanosoma cruzi

forma epimastigota e para a forma tripomastigota de T. cruzi foram 25 dias para sua obtenção. Para tal atividade, os parasitas foram diluídos e contados com auxílio da câmera de Neaubauer e utilizados na concentração de 1 x 107 parasitas/mL. Em seguidas foram plaqueados 200µL em cada poço em placas de 96 poços, em um sistema de triplicatas e posteriormente foi aplicado diversas concentrações do composto dietilditiocarbamato de sódio trihidratado (DETC) variando sua concentração de 444 µM até 4 µM. Em seguida, foram analisados a viabilidade das diferentes cepas do parasita no período de 24 e 48 horas, após o tratamento. Para avaliar a viabilidade dos parasitas tratados com diferentes concentrações de DETC foi realizado o ensaio de redução da resazurina (Sigma Aldrich), que consistiu na aplicação de 20 µL de resazurina na concentração de 1mM nos poços para ambos os períodos de testes do composto. Este processo de redução da resazurina tem a durabilidade de 24 horas após aplicação e em seguida foi realizado a leitura no leitor de microplacas (Epoch, BioTek Instruments, Winooski, VT, USA) utilizando os comprimentos de onda 570nm e 600nm (CORRAL et al., 2013). Na qual o percentual de inibição se deu a partir da seguinte formula:

% 𝐼𝑛𝑖𝑏𝑖çã𝑜 = 100 −

((𝐴570t – (𝐴600𝑡 𝑥 𝑅0))/ (𝐴570c – (𝐴600𝑐 𝑥 𝑅0))) ∗ 100 A570t = Absorção do tratamento no comprimento de onda 570nm A600t = Absorção do tratamento no comprimento de onda 600nm A570c = Absorção do controle no comprimento de onda 570nm A600c = Absorção do controle no comprimento de onda 600nm

RO = Fator de correção do meio interagindo com a resazurina, sendo obtido pela seguinte formula:

𝑅0 = 𝐶𝑚𝑒𝑖𝑜570𝑛𝑚 / 𝐶𝑚𝑒𝑖𝑜600𝑛𝑚

Cmeio570nm = Absorbância do meio no comprimento de onda de 570 nm. Cmeio600nm = Absorbância do meio no comprimento de onda de 600 nm.

Além do ensaio colorimétrico por resazurina, foi utilizado também a microscópia em câmera clara, para todos os testes, através da contagem utilizando a câmera de Neaubauer. Para a confirmação das concentrações que foram quantificadas com 100% de mortalidade dos parasitas após o período de 24h e 48h, os parasitas foram centrifugados a 2000 rpm por 10 min para retirada do composto e colocados em meio LIT adicionado 10% de SFB durante um período de 7 dias e posteriormente analisado por microscopia. Para o controle positivo foi utilizado o benznidazol que é o fármaco tradicionalmente utilizado no Brasil para o tratamendo da doença de Chagas.

3. 3 Citotoxicidade do DETC em linhagem de células animais

Os ensaios de citotoxicidade do DETC foram determinados pela utilização de células das linhagens de fibroblastos (3T3), e macrófagos (RAW 264) cultivadas em meio DMEM, a 37°C e 5% CO2, durante 5 dias, alcançando uma confluência em torno de 70%

a 80%. Em seguida as células foram descoladas da garrada por protocolos específicos, sendo a 3T3 por meio da utilização do método de tripsinização, na qual as células tiveram seu meio retirado e foram previamente lavados com PBS (Solução Básica de Fosfato) e em seguida expostos a 500 µL de tripsina por 5 minutos, enquanto as células RAW devido a sua sensibilidade ao processo de tripsinização foi executado pelo processo de

raspagem da garrafa e então realizado a contagem com a utilização da câmera de Neaubauer. Posteriormente as células foram plaqueadas em placas de 96 poços na concentração de 5 x 103 células por poço e então expostas a diferentes concentrações do DETC que variam de 4 µM até 2222 µM, durante o período de 24 horas. Em seguida para analisar a viabilidade celular foi utilizado o ensaio de redução do MTT [3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide) tetrazolium], durante este processo ocorre a formação do formazan, caracterizando a mitocôndria da célula como viável. Para tal, a reação teve um período de 4 horas e em seguida foi mensurado a redução do MTT utilizando o leitor de microplacas (Epoch, BioTek Instruments, Winooski, VT, USA) no comprimento de onda de 570 nm. A partir daí então foi calculado a taxa de viabilidade celular através da seguinte formula:

% de redução MTT= (Abs amostra/ Abs controle) *100

3. 4 Análise do mecanismo de morte celular dos parasitas submetidos ao tratamento com DETC

Para analisar o mecanismo de morte celular desencadeado pelo DETC no parasita, foi utilizado o marcador de morte celular anexina V-FITC (Invitrogen) que verifica o qual estágio de morte celular (apoptose tardia, necrose, apoptose inicial) utilizando o Kit (Annexin V FITC Apoptose detection Kit - Invitrogen) e seguindo as orientações do fabricante com algumas alterações. Os parasitas foram centrifugados a 2000 rpm por 5 minutos a 4ºC e em seguida lavados com PBS 1x gelado, após foi resuspendido em PBS 1x gelado e adicionado 10 µl de anexina por um período de 15 minutos, em seguida foi centrifugado e o pellet resuspendido novamente em PBS 1x gelado e adicionado PI e posteriormente realizada a leitura no Citometro BD FACSCanto II na Universidade Federal do Rio Grande do Norte nos comprimentos de onda de 488 e 633 nm [45]. Foi analisado as marcações de morte celular para 3 diferentes concentrações do DETC, 4µM, 44,4µM e 444µM, após 24 horas de tratamento). Os resultados foram analisados no software FlowJo (FlowJo, Ashland, OR, EUA) e 10.000 eventos foram quantificados para cada uma das análises realizadas.

3. 5 Análise do dano mitocondrial sofrido em parasito submetidos ao tratamento com DETC

Com o objetivo de analisar os danos mitocondriais desencadeados pelo Dietilditiocarbamato de sódio (DETC), o composto foi testado nas concentrações de 44,4µM, 111µM e 222µM durante 24 horas em diferentes cepas de T. cruzi. Para isso, foi utilizado o marcador de potencial mitocondrial Rodamina 123 (Invitrogen), seguindo as recomendações dos fabricantes com algumas alterações. Resumidamente, os parasitas foram centrifugados a 2000 rpm por 6 min a 4ºC e em seguida foram lavados com PBS 1x gelado. Em seguida resuspendidos em 200µL de PBS e adicionado 0.5µl de rodamina 123 na concentração de 5mg/mL durante 15 minutos. Em seguida foram lavados 2 vezes e realizando a leitura por meio do Citometro BD FACSCanto II na Universidade Federal do Rio Grande do Norte com o comprimento de onda de 488 e 633 nm. Os resultados foram analisados no software FlowJo (FlowJo, Ashland, OR, EUA) e expressos em % de fluorescência emitida em relação as células tratadas, no total 10.000 eventos foram quantificados para cada uma das análises realizadas.

3. 6 Caracterização morfológica de Trypanosoma cruzi submetido ao tratamento com DETC

A morfologia das células de T. cruzi foi visualizada por Microscopia eletrônica de varredura (MEV) na presença do composto DETC por 24h, utilizando a dose referente ao IC50 de acordo com AMORIM-CARMO e colaboradores em 2019 com algumas

alterações [46]. Os parasitas plaqueados na concentração de 1 x 107 _{parasitas/mL foram}

tratados com o DETC por 24 horas utilizando como controle negativo o parasita não tratado. Após incubação, os parasitas foram centrifugados por 10 min a 1500 rpm (4ºC) e em seguida lavado duas vezes com PBS 1x. As células foram então fixadas com uma solução de 2,5% glutaraldeído-PBS por 4 horas. Em seguida as células foram lavadas com 25%, 50%, 80% e 100% de álcool etílico por 15 minutos a 1500 rpm com intervalos de 10 minutos para desidratação em cada concentração alcoólica. Posteriormente, resuspensos em álcool etílico 100%, colocados para secar a temperatura ambiente. Após foram metalizados com uma fina camada de ouro por 2 minutos e então submetidos para caracterização estrutural no Laboratório de Materiais na Universidade Federal do Rio Grande do Norte para obtenção das imagens.

3.7 Analise proteólitica de extratos das cepas de Trypanosoma cruzi e inibição pela