Caracterização da atividade antiparasitária do dietilditiocarbamato frente a diferentes cepas de Trypanosoma cruzi

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA

JOHNY WYSLLAS DE FREITAS OLIVEIRA

CARACTERIZAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIPARASITÁRIA DO

DIETILDITIOCARBAMATO FRENTE A DIFERENTES CEPAS DE Trypanosoma cruzi

JOHNY WYSLLAS DE FREITAS OLIVEIRA

CARACTERIZAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIPARASITÁRIA DO

DIETILDITIOCARBAMATO FRENTE A DIFERENTES CEPAS DE Trypanosoma cruzi

Dissertação apresentada ao programa de Pós-graduação em Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Bioquímica.

Orientador: Prof. Dr. Marcelo Sousa Silva

Coorientador:

Prof. Dr. Hugo Alexandre O. Rocha

Oliveira, Johny Wysllas de Freitas.

Caracterização da atividade antiparasitária do

dietilditiocarbamato frente a diferentes cepas de Trypanosoma cruzi / Johny Wysllas de Freitas Oliveira. - Natal, 2019. 142 f.: il.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica.

Orientador: Prof. Dr. Marcelo Sousa Silva.

Coorientador: Prof. Dr. Hugo Alexandre Rocha de Oliveira.

1. Doença de Chagas Dissertação. 2. Trypanosoma cruzi -Dissertação. 3. DETC - -Dissertação. 4. Atividade antiparasitária - Dissertação. 5. DTU's - Dissertação. I. Silva, Marcelo Sousa. II. Oliveira, Hugo Alexandre Rocha de. III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título.

RN/UF/BSE-CB CDU 616.937

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI

Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson - -Centro de Biociências - CB

DEDICATÓRIA

Dedico este projeto a meu Deus, minha família, minha namorada,

meus amigos e a todos que me acompanharam e me fizeram crescer.

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus por me dar forças todos os dias e por me

ajudar nessa jornada.

Agradeço minha mãe (em memória) à pessoa mais especial e fundamental

na minha vida que ajudou a construir meu caráter e me tornar o homem

que eu sou.

Agradeço a minha família, minha avó Judite, meu Irmão Weslley e meu

tio Assuero, meu pai e demais familiares, por sempre estarem comigo, me

dando força e apoio nos momentos difíceis.

Agradeço minha namorada Alzira Regina, por todo carinho, amor,

compreensão e por me ajudar nos momentos difíceis.

Agradeço aos meus amigos Lucas e Augusto, por sempre me apoiarem

nas minhas escolhas e me ajudar quando preciso.

Agradeço também a família da minha namorada por sempre me receber

tão bem e me tratar como sendo parte da família.

Agradeço ao apoio do meu orientador Marcelo em todos os momentos

acadêmicos e pelo amigo que se tornou fora da universidade.

Agradeço aos meus colegas de laboratório, Claudia, Silvia, Junior, Saile,

Ana Clara, Kivia, Emily, Aline, Guilherme, Wendy, Joice e Jonatas por

todo apoio prestado e pelos momentos de descontração.

Também agradeço aos meus amigos de Mossoró Rose, Belicia, Laysa e

Breno pela amizade.

Agradeço aos meus colaboradores Professor Dr. Hugo, Bruno, Dr. Ana

Katarina, Claudia, Taffarel.

Agradeço aos meus amigos de Mestrado Geovana, Cinthia, Aquiles,

Lucas, Luiz e Thais por todos os momentos de diversão e momentos

pesados que passamos juntos nessa Pós.

Agradeço a todos os professores da Pós-Graduação por todo

conhecimento que me foi repassado em suas aulas e fora delas.

Agradeço a Aline Rimoldi, João Aristeu da Rosa e Carlos Robelo pela

doação das cepas tornando possível a execução do trabalho.

Agradeço a UFRN pela formação.

RESUMO

A doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, acomete milhares de pessoas anualmente. Os fármacos tradicionalmente utilizados além de serem altamente citotóxicos não são eficazes na fase crônica da doença. Além disso, o parasita apresenta diversidade genética que pode ocasionar diferentes manifestações clínicas e resistência aos tratamentos. O dietilditiocarbamato de sódio pertencente a classe dos ditiocarbamatos, compostos químicos de alta versatilidade farmacológica que podem interagir com metais e induzir a produção das espécies reativas de oxigênio e nitrogênio. O objetivo deste trabalho é caracterizar a ação inibitória do DETC frente diferentes cepas de T. cruzi. Primeiramente, as diferentes cepas Dm28c (TcI), Y (TcII), QMM9 (TcIII) e Cl Brener (TCVI) foram cultivadas em meio LIT. Os ensaios antiparasitários avaliaram diferentes concentrações do DETC em períodos de 24h e 48h, através dos métodos de contagem e da resazurina, contra as formas epimastigota e tripomastigota de T. cruzi. A citotoxicidade celular foi analisada frente as linhagens animais 3T3 (fibroblasto) e RAW (macrófago) das 24 horas após aplicação do composto e avaliada por meio do ensaio de redução do MTT. Adicionalmente, foi analisado os mecanismos de morte parasitária desencadeados pelo composto frente a epimastigota de T. cruzi no período de 24 horas. Foi observado também a atividade mitocondrial das diferentes cepas de T. cruzi na forma epimastigota após 24 horas de tratamento com o composto por meio do ensaio de potencial de membrana. Além disso, as alterações morfológicas causadas pelo composto após 24 horas de tratamento através da microscopia eletrônica de varredura. Ademais, analisou-se a ação inibitória do DETC sob proteínas proteolíticas dos extratos do T. cruzi por zimográfia seguido de densitometria. Considerando que os ditiocarbamatos apresentam importante ação inibitória sob a α-anidrase carbônica de T. cruzi buscou-se evidenciar o ancoramento do DETC nesta proteína através do ensaio in silico de docking molecular. A partir dos ensaios antiparasitários determinou-se a concentração do DETC necessária para reduzir o crescimento populacional em 50% (IC50) de cada uma das cepas

em 24 horas, resultando de 28,8 µM até 66,4 µM para forma epimastigota e de 23,5 µM até 79,0 µM para forma tripomastigota a depender da cepa. Por meio da citotoxicidade celular observou-se perfil inibitório do composto que demonstrou citotoxicidade moderada contra as linhagens animais 3T3 e RAW, determinando assim os IC50 de81,46

µM para 3T3 e 96,34 µM para RAW. A inexistência ou baixíssima atividados dos marcadores anexina e do PI (fosfato inorgânico), tornaram inviável determinar os mecanismos de morte celular desencadeados pelo composto frente ao parasita. Mediante a avaliação do potencial da membrana mitocondrial observou-se danos mitocondriais causados pelo DETC nas diferentes cepas do parasita inibindo o potencial de atividade da membrana interna da mitocôndria, chegando a atingir 80%. Por intermedio das análises da microscopia eletrônica de varredura observou-se que o composto desencadeia ações na estrutura celular parasitária, resultando na descontinuidade na membrana, rompimento e formação de poros. Por meio da zimografia foi constatado uma redução na atividade proteolítica dos extratos dos parasitas alcançando 36%. Observou-se que o DETC apresentou alta capacidade de interação para inibir a α- Anidrase carbônica, analisando o posicionamento do ancoramento na estrutura proteica. Portanto, o DETC apresenta-se como possível candidato para tratamento alternativo a doença de Chagas devido a elevada atividade antiparasitária, citotoxicidade moderada e apresenta ações sobre compartimentos específicos do parasita.

Palavras chave: doença de Chagas, Trypanosoma cruzi, DETC, Atividade antiparasitária, DTU’s.

ABSTRACT

The Chagas Disease caused by protozoan Trypanosoma cruzi, affects thousands of people annually. The traditional pharmaceuticals used in treatment have high toxicity and are not efficient in the chronic phase of disease. Furthermore, the genetic diversity of parasite may cause different clinical manifestations and resistance for treatment. The sodium diethyldithiocarbamate attachment the dithiocarbamate class, chemical compounds of high pharmacological versatility that can interact with metals and induced the production of radical oxygen and nitrogen species. The main of this project is characterize the inhibitory action of DETC against different strains of T. cruzi. Firstly, the different strains Dm28c (TcI), Y (TcII), QMM9 (TcIII) e Cl Brener (TCVI) grown in LIT medium. The antiparasitic assay evaluated distinct concentration of DETC at time 24 hours and 48 hours, by count and resazurin methods, against epimastigote and trypomastigote forms of T. cruzi. The cellular cytotoxicity was analyzed utilizing animal lineage 3T3 (fibroblasts) and RAW (Macrophage) 24 hours after compound application and evaluated by the MTT assay. Additionally, was analyzed the parasite dead mechanisms triggered by the compound averse to T. cruzi epimastigote in 24 hours. Was observed too the mitochondrial activity of different strains of T. cruzi in epimastigote form after 24 hours of treatment by scanning electronic microscopy. In addiction, was evaluate the inhibitory action of DETC on proteolytic proteins of T. cruzi extracts by zymography followed by densitometry. Considering that the dithiocarbamate has an important inhibitory action against α-carbonic anhydrase of T. cruzi sought to demonstrate the docking of DETC in this protein through of in silico assay of molecular docking. Upon antiparasitic assay was determinate DETC concentration necessary for reducing the populational growth in 50% (IC50) each strains in 24 hours, resulting of 28,8 µM until 66,4 µM for epimastigote form

and 23,5 µM until 79,0 µM for trypomastigote form depending on strain. Through of cellular cytotoxicity was evaluate inhibitory profile of compound that demonstrated moderate cytotoxicity against animal lineages 3T3 and RAW, thus determining IC50

81,46 µM for 3T3 e 96,34 µM for RAW. The inexistence or very low activity of markers annexin and PI (Inorganic phosphate),cause the unavailability determinate of cellular death mechanism by DETC against the parasite. Upon the mitochondrial potential evaluation was show the mitochondrial damages caused by DETC on different parasite strains, inhibiting the internal mitochondrial potential activity in 80%. Through the scanning electronic microscopy was observed that the compound present different actions in parasite cellular structure, resulting in membrane discontinuity, pores and ruptures. Furthermore the zymography founded the reduction in proteolytic activity of parasite extracts achieving 36%. Furthermore, DETC showed high capacity for biding with α-carbonic anhydrase of T. cruzi, analyzing the docking location in protein structure. Therefore, DETC presents like a possible candidate for alternative treatment of Chagas Disease due elevate antiparasitic activity, moderate cytotoxicity and present acting against specific targets of parasite.

LISTA DE FIGURAS

Figura 2: Principais fármacos utilizados para o tratamento da doença de Chagas.

Figura 3: Distribuição das diferentes DTU’s de Trypanosoma cruzi no continente americano e suas manifestações clínicas.

Figura 4: Ciclo biológico e formas evolutivas de Trypanosoma cruzi. Figura 5: As diferentes formas evolutivas do parasita Trypanosoma cruzi. Figura 6: Metaciclogenese de T.cruzi durante o ciclo biológico.

Figura 7: Representação esquemática dos ditiocarbamatos.

Figura 8: Estrutura 3-D do composto Dietilditiocarbamato de Sódio.

Figura 9: Atividade antiparasitária do DETC em diferentes cepas e formas evolutivas de Trypanosoma cruzi determinada pelo método de resazurina

Figura 10: Atividade antiparasitária do DETC em diferentes cepas e formas evolutivas de Trypanosoma cruzi determinada por ensaio de contagem em câmera clara

Figura 11: Perfil inibitório do DETC frente às linhagens celulares 3T3 e RAW.

Figura 12: Análise do mecanismo de morte celular de Trypanosoma cruzi tratados com DETC. Figura 13: Danos mitocondriais causados pelo DETC em diferentes cepas de Trypanosoma cruzi. Figura 14: Microscopia eletrônica de varredura da forma epimastigota de T. cruzi exposto ao DETC Figura 15: Espectroscópia de energia dispersa do parasita após tratamento com DETC 24 horas contra epimastigota de T. cruzi para confirmação da estrutura carbonária do parasita.

Figura 16: SDS´PAGE com substrato de gelatina utilizando extratos das cepas de T. cruzi na forma epimastigota.

Figura 17: Perfil inibitório em gel de zimográfia 24 horas após aplicação do DETC em extratos de diferentes cepas de T. cruzi.

Figura 18: Modelo in silico da α-Anidrase Carbônica de Trypanosoma cruzi.

Figura 19: Modelo in silico do docking entre o DETC e o centro ativo da α-nidrase carbônica de T. cruzi. Figura 20 - Modelo de visualização 2D da interação entre o DETC e o sítio ativo da proteína α-anidrase carbônica.

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Boletim de ocorrência de casos de Doença de Chagas aguda relatados ao Ministério da Saúde até o ano de 2015.

Tabela 2: IC50 do DETC frente as diferentes cepas de Trypanosoma cruzi nas formas evolutivas

epimastigota e tripomastigota.

Tabela 3: Índice de seletividade (IS) entre as diferentes cepas em diferentes formas evolutivas de Trypanosoma cruzi e as linhagens celulares RAW e 3T3.

Tabela 4: Validação segundo scores MolProbity, QMEAN, Clash Socre e Ramachandra Favoured para construção dos modelos tridimensionais proteicos das α-Anydrases Carbônicas

LISTA DE ABREVIAÇÕES

BSA – Proteína Sérica Bovina

CAT - Catalase Glutationa redutase (GR) CD – Doença de Chagas

DNA – Ácido desoxirribonuclieco

DNDi – Drogas para Doenças Negligenciadas iniciativa DTU – Unidades Discretas de Tipagem

DETC – Dietilditiocarbamato de Sódio Trihidratado Fe-SOD – Superóxido Dismutase de Ferro

GPx - Glutationa Peroxidase GR - Glutationa Redutase

HSP – Proteínas de Choque Térmico LIT – Liver Infusion Tryptose

MEV – Microscopia Eletrônica de Varredura MLEE - Multi Locus Enzyme Electrophoresis

MTT - 3-(4,5-dimetiltiaol-2-il) brometo -2,5-difeniltratrazólio) tetrazólio) NCBI - Nacional Center of Biotechnology Information

NK – Natural Killer NKT – Natural Killer T

NOS – Espécies Reativas de Nitrogênio

PAMP's - Padrões Moleculares Associados a Patógenos PBS - Solução Básica de Fosfato

RAPD - Random amplification of polymorphic DNA RNA – Ácido ribonucleico

ROS – Espécies Reativas de Oxigênio

SDS- PAGE – Dodecil sulfato de sódio (SDS) de poliacrilamida (PAGE) SFB – Soro Fetal Bovino

SUMÁRIO

I. INTRODUÇÃO ... 15

1.1 Doença de Chagas ... 16

1.2 Trypanosoma cruzi ... 19

1.2.1 Caracterização genética de Trypanosoma cruzi e distribuição genotípica ... 20

1.2.3 Caracterização morfológica ... 24

1.2.4 Mecanismos de adaptação de Trypanosoma cruzi para os desafios do ambiente . 25 1.2.5 Estresse oxidativo ... 31

1.2.6 Anidrase carbônica de Trypanosoma cruzi ... 32

1.3 Ditiocarbamatos ... 33

1.3.1 Principais grupamentos químicos dos Ditiocarbamatos e aplicações ... 35

1.3.2 Dietilditiocarbamato de Sódio (DETC) ... 37

II. OBJETIVOS ... 39

2.1Objetivo geral...39

2.2 Objetivos específicos ... 39

III. MATERIAIS E MÉTODOS ... 40

3. 1 Cultivo axênico de Trypanosoma cruzi ... 41

3.2 Avaliação da atividade antiparasitária do DETC em cepas de Trypanosoma cruzi 41 3. 3 Citotoxicidade do DETC em linhagem de células animais ... 42

3. 4 Análise do mecanismo de morte celular dos parasitas submetidos ao tratamento com DETC ... 43

3. 5 Análise do dano mitocondrial sofrido em parasito submetidos ao tratamento com DETC ... 44

3. 6 Caracterização morfológica de Trypanosoma cruzi submetido ao tratamento com DETC ... 44

3.7 Analise proteólitica de extratos das cepas de Trypanosoma cruzi e inibição pela ação do DETC ... 45

3.8 Construção, validação e estrutura dos alvos proteicos e docking molecular ao DETC ... 46

3.9 Análise estatística ... 46

IV. RESULTADOS ... 47

4.1 Efeito antiparasitário do DETC emdiferentes cepas e diferentes formas evolutivas de Trypanosoma cruzi ... 48

4.3 Caracterização da atividade antiparasitária do DETC: Mecanismos de morte celular

... 53

4.4 Caracterização da atividade antiparasitária do DETC: Danos Mitocondriais ... 54

4.5 Caracterização da atividade antiparasitária do DETC: Alterações Morfológicas .... 56

4.6 Capacidade inibitória em metaloproteinases de Trypanosoma cruzi por DETC... 58

4.7 Construção do modelo tridimensional da α-anidrase carbônica do Trypanosoma cruzi ... 60

4.8 Ancoramento do DETC a estrutura proteica in silico da α-anidrase carbonica conferindo ação inibitória ... 62

V. DISCUSSÃO ... 65

VI. CONCLUSÕES ... 74

VII. REFERÊNCIAS ... 76

1.1 Doença de Chagas

Caracterizado por Carlos Chagas em 1909, o parasita monoflagelado Trypanosoma cruzi é causador da zoonose conhecida como doença de Chagas (DC). Esta doença está presente na América, afetando principalmente a América central e America do Sul, apresentando um quadro epidemiológico de mais de 8 milhões de infectados, mais de 30 mil novos casos anualmente e mais de 14 mil mortes. Além disso, mais de 80 milhões de pessoas vivem em áreas endêmicas (CHAGAS, 1909; WHO, 2019; DnDi, 2017). Na figura 1 é mostrado a distribuição global de casos da doença de Chagas apontando áreas endêmicas e não endêmicas.

Figura 1: Epidemiologia da doença de Chagas. Fonte: Boletim de Registro Anual do Drugs for Neglected Diseases iniciative (DNDi, 2017).

Segundo a organização mundial de saúde, no Brasil estima-se que 1 milhão de pessoas estejam infectadas pelo parasita e que anualmente são registrados de 150 a 200 novos casos de DC aguda. A distribuição de casos de DC ocorre de forma divergente entre as regiões, tendo em vista a alta concentração de casos de DC aguda confirmados na região Norte, principalmente no estado do Pará (1.173 casos confirmados), devido à ingestão de alimentos contaminados com fezes de triatomíneo infectado por T. cruzi. Por outro lado, na região Nordeste os estados do Maranhão (24 casos confirmados) e do

Pernambuco (17 casos confirmados) são os estados que concentram os maiores números de casos registrados pela Secretária da Saúde nos períodos de 2000-2013. Contudo, um estudo realizado no Rio Grande do Norte em 2016 confirmou 18 novos casos de DC aguda presente em cidades do interior do estado, acredita-se que muitos outros casos não tenham sido notificados. (MINISTERIO DA SAÚDE, 2015; VARGAS et al. 2018; MINISTERIO DA SAÚDE, 2019).

Tabela 1: Boletim epidemiológico da Doença de Chagas aguda relatados ao Ministério da Saúde até o ano de 2015. Fonte: Ministério da Saúde, 2015.

Os danos desencadeados pela doença de Chagas não afetam apenas a saúde dos pacientes, também causa um impacto econômico para o país. Devido ao grande impacto no Brasil estima-se um custo anual de cerca de 129 milhões de dólares (LEE et al., 2013).

Clinicamente a CD apresenta as fases aguda e crônica. A fase aguda é responsável por cerca de 2% a 8% dos óbitos tendo como quadro sintomatológico geral de febre,

mal-estar, hepatoesplenomegalia, linfodenopatia e edemas faciais. Já na fase crônica, que pode apresentar-se na forma indeterminada ou sintomática, desencadeia sérias complicações cardiovasculares e gastrointestinais, resultando em processos inflamatórios e mudanças anatômicas (LARANJA et al., 1956; DIAS, 1989; STIMPERT & MONTGOMERY, 2010; PÉREZ-MOLINA & MOLINA, 2018).

Um dos problemas enfrentados atualmente no tratamento da doença de chagas é a falta de um diagnóstico preciso. Apenas 10% dos casos são diagnosticados, ou seja, uma grande parcela da população não tem conhecimento do seu estado de saúde, além disso, desses 10% que são identificados apenas 1% recebe tratamento adequado. O principal motivo da falta de diagnóstico deve-se a grande parte da população que desconhece os males da doença dificultando o diagnóstico preciso. Além disto outros motivos desta baixa eficácia no diagnóstico ocorrem devido as características morfológicas e invasivas do parasita durante seu ciclo biológico dificultando sua identificação e mão de obra não qualificada para exames próprios para auxiliar esta identificação. Por ser uma doença Tropical Negligenciada, atinge principalmente as populações menos favorecidas financeiramente atrai poucos investimentos para busca e desenvolvimento de novos alvos terapêuticos (DNDi, 2017).

Além disso, a distribuição dos triatomíneos, vetores da doença de Chagas é outro fator agravante para o surgimento de novos casos. Triatomíneos de diferentes genes com dezenas de espécies que apresentam ampla distribuição ao longo da América Central e do Sul. Além disso, constantemente o ser humano invade o habitat natural desde inseto, o que facilita ainda mais o contato com ele. Por ser hospedeiro do parasito facilita o contagio da doença de Chagas (EDUARDO et al., 2019).

A forma clássica de transmissão da DC é através do vetor que realiza a hematofagia. Após praticar a hematofagia, os triatomíneos defecam próximo ao local e em suas fezes misturadas com urina contém o parasita. Devido às reações provocadas pela picada, pode ocorrer uma leve irritação que leva ao prurido desencadeando um processo inflamatório. Durante o prurido, ocorre o rompimento da epiderme criando assim uma porta de entrada para T. cruzi que no interior do organismo invadem diferentes células. Contudo, existem outros mecanismos de transmissão da doença como: por meio de alimentos contaminados com fezes do inseto ou o próprio triatomíneo, transfusão de sangue, transplante de órgãos, transferência congênita e acidentes laboratoriais (COURA et al, 1985; HERWALDT, 2001; CICORA et al., 2014; COURA, 2015).

Os principais fármacos utilizados no combate desta doença são benzonidazol e nifurtimox, sendo estes recomendados durante a fase aguda ou inicial da doença (figura 2). Uma vez que durante a fase crônica estes medicamentos apresentam baixa eficácia farmacológica na eliminação do parasita, devido a incapacidade de alcançar o parasito que ficam alojados nos tecidos. Estes fármacos atuam produzindo a partir do grupamento R-NO2 espécies reativas de oxigênio tais como radicais superóxidos, peróxido de

hidrogênio ocasionando um severo dano oxidativo levando a morte do parasita. Contudo, ambos os medicamentos apresentam elevada toxicidade, apresentando reações adversas tais como citotoxicidade, danos hepáticos, danos pancreáticos, irritações na pele, baixa espermiogenese entre outros (CASTRO & DE TORANZO DIAZ, 1988; FERREIRA, 1990; CANÇADO, 2002; CASTRO et al., 2006; VIOTTI et al., 2009;APT et al., 2010; JACKSON et al., 2010).

Figura 2: Principais fármacos utilizados para o tratamento da doença de Chagas.

1.2 Trypanosoma cruzi

Todos os tripanosomas do gênero Trypanosoma são parasitas de vertebrados com característica morfológia, estão presentes em todos os continentes e podem infectar peixes, aves, anfibios, plantas e mamiferos. A grande maioria destas parasitoses são transmitidas por sanguessugas ou por artropodes. A grande diversidade genética desse genês foi caracterizada ao longo dos anos com o uso de diferentes marcadores genéticos e moleculares (HAMILTON & STEVENS,2017).

A complexidade deste gênero é de suma importância para o entendimento de T. cruzi, uma vez que entender a ancestralidade deste parasita facilitiria na identificação de

mecanismos de combate e relação com outros parasitas. Em suma, a partir de análises moleculares para construção da árvore filogenética de T. cruzi. Tem-se que o mesmo é originário de único ancestral, ou seja, o parasita é monofilético. A partir deste ancestral em comum foi que teve-se o surgimento das diversas variantes genéticas (HAMILTON & STEVENS,2017).

1.2.1 Caracterização genética de Trypanosoma cruzi e distribuição genotípica A primeira caracterização da variabilidade genética das cepas de T. cruzi foi realizada pela Fiocruz no ano de 1999. A partir de uma análise genética, utilizando técnicas de biologia molecular e bioquímica, tais como: multi locus enzyme electrophoresis (MLEE), Random amplification of polymorphic DNA (RAPD), mini-exon e DNA ribossomal 24α; foi possível separar genotipicamente as cepas de T. cruzi em dois grandes grupos: T. cruzi I (TcI) e T. cruzi II (TcII). Contudo não foi possível a separação de cepas híbridas (ANNEX, 1999).

Dez anos depois, após analises de multilocus de diversas cepas naturais e hídridas, foi possível realizar a nova classificação genotípica de T. cruzi, pertencendo então a seis Discrete Type Units (DTU's). As DTU's são definidas como conjuntos de populações que apresentam alta proximidade genética e foram identificadas a partir de marcadores genéticos, moleculares e imunológicos (ZINGALES et al., 2009). Assim, as diferentes DTU's devem ser vistas como cepas que apresentam diversas linhagens clonais relacionadas e não apenas um tipo clonal, sendo que cada cepa corresponde a uma grupo com características genéticas semelhantes (TIBAYRENC & AYALA, 1988).

Os principais modelos teóricos que explicam a hidridização das DTU’s são os modelos Two-hibridization model (WESTENBERGER et al., 2006) e Three ancestor model (DE FREITAS et al., 2006), na qual ambos incorporam modelos de hibridização. No modelo Two-hibridization, um ancestral em comum a partir de variações genéticas deu origem a uma nova variável a TcII, a partir disso, eventos genéticos entre TcI e TcII deram origem as cepas TcIII e TcIV e eventos genéticos entre TcII e TcIII deu origem as cepas TcV e TcVI, sendo que este processo se deu através da análise do RNA ribossômico 5S presente na mitocôndria dos parasitas, na qual foi possível observar distintas sequências que compõem cada cepa e as suas interações. Já no modelo Three ancestor ao inves da cepa primordial gerar apenas uma variação, seriam uma dupla variação e dessa forma neste modelo apresenta-se 3 DTU's base que seriam a TcI, TcII e TcIII. Na qual

interações de hibridização entre as cepas TcII e TcIII dão origem as DTU's TcV e TcVI, sendo estás observações realizadas a partir de análises de diversos microssatélites sob DNA genômico mitocondrial.

O grupo TcI é a mais abundante e mais dispersa em toda América. Esta variante genética é comumente encontrada nos triatomíneos e estão presentes principalmente no norte da América do Sul e na América Central, podendo infectar tanto hospedeiros silvestres quanto domésticos. . A heterogeneidade do grupo TcI pode ser explicada pela dispersão ao longo do continente proporcionando diferentes ambientes (APT et al., 1987; MACHADO & AYALA, 2001; ROELLIG et al., 2008). O grupo TcII é encontrado principalmente nas regiões sudeste e central da América do Sul, porém, sua extensão não é totalmente conhecida. É o principal grupo responsável por manifestações clinicas cardíacas, megacolon e megaesôfago presentes nos indivíduos com DC (ZINGALES et al., 1999; LISBOA et al., 2007).

A DTU TcIII é comumente associada aos ciclos silvestre no Brasil e países adjacentes e casos de infecções em humanos são bastante raras, contudo o grupo já foi isolado de cães, sendo característico principalmente de nichos terrestres (CARDINAL et al., 2008; LLEWELLYN et al., 2009). A DTU TcIV apresenta uma distribuição semelhante ao grupo TcIII de T. cruzi, contudo diferente desta cepa, a TcIV é frequente em humanos, sendo o segundo maior grupo responsável por causar DC na Venezuela, atrás somente da DTU TcI. Contudo, evidências comprovam o grupo pode se desenvolver fora do seu local habitual e apresenta cepas bastante distintas no norte e no sul das Américas (MILES et al., 1981; YEO et al., 2005; LEWIS et al., 2009).

Os grupos TcV e TcVI de T. cruzi são geneticamente similares e estão associadas com a DC no Sudeste e no Centro da América do Sul. Estas duas DTU’s apresentam características genéticas dos grupos TcII e TcIII. Estudos afirmam que estas DTU’s são mais geograficamente distribuídas do que compreendidas e podem ser encontradas muito ao norte da América do Sul (ZAFRA et al., 2008; ZINGALES, 2018). A figura 5 mostra a distribuição das diferentes DTU’s na América.

Além destes grupos caracterizados em 2009, outra DTU foi caracterizada em 2012 chamada de TcBat, sendo que esta DTU caracterizada pela analíse do rRNA 18s, obtida no Panamá. Primordialmente esta variante genética seria silvestre infectando apenas

morcegos, contudo casos já foram confirmados em humanos (PINTO et al., 2012; RAMÍREZ et al., 2014; LIMA et al., 2015).

Figura 3: Distribuição das diferentes DTU’s de Trypanosoma cruzi no continente americano e suas manifestações clínicas. CCC corresponde as manifestações clínicas miotrópicas e DIG as manifestações clínicas megafagotrópicas. Fonte: Artigo de revisão (ZINGALES, 2018).

Cada DTU apresenta uma associação com as manifestações clínicas da doença de Chagas na fase crônica. Além disso, essas variações geralmente estão associadas com a patogenicidade da doença. A TcI está principalmente relacionada a cardiomiopatia e com maior número de casos na fase crônica da doença, contudo mostra-se menos patogênica. O grupo TcII aponta relação com o megatropismo resultando na formação da síndrome mega-visceral com poucos casos relacionados com a cardiomiopatia. Além disso apresenta fatores de virulência que possivelmente estão relacionadas com a sua alta patogenicidade. As DTU’s TcIII e Tc V estão relacionadas com um sistema difuso, ou seja, podem desencadear tanto cardiomiopatia quanto síndrome mega-visceral, contudo são menos frequentes em humanos. TcV e TcVI também apresentam um sistema difuso, ou seja, podem desencadear cardiomiopatia e síndrome mega-visceral, contudo a cardiomiopatia desencadeada por estes grupos é menos agressiva (JIMENEZ et al., 2019).

1.2.2 Ciclo biológico

Durante o ciclo biológico, as formas evolutivas do T. cruzi estão diretamente associados com as alterações morfológicas e fisiológicas presentes nos diferentes hospedeiros vertebrados e invertebrados. O triatomíneo não infectado ao realizar o repasto sanguíne de um mamífero previamente infectado com DC irá obter a partir da corrente sanguínea o parasita na forma tripomastigota sanguíneo. No interior do sistema digestório do triatomíneo, o parasito irá se diferenciar no processo chamado metaciclogênese devido as alterações de pH e osmolaridade que o parasito sofre no interior do estômago resultando na diferenciação para a forma epimastigota. A forma epimastigota é replicativa, ao atingir o intestino delgado que é rico em nutrientes e tem um ambiente mais favorável irá replicar-se. Devido aos processos digestórios, as formas epimastigotas de T. cruzi migram para o intestino grosso e ao atingir este novo ambiente que apresenta pH mais baixo que o intestino delgado, escassez de fonte de nutrientes e mudanças na osmolaridade diferenciam para a forma tripomastigota metaciclíca (BRENER, 1973).

Uma vez infectado com o parasita, o triatomíneo quando realizar um novo repasto sanguíneo em um outro mamífero, após se alimentar, irá liberar pela ampola retal, urina e fezes juntamente com as formas tripomastigotas metacíclica de T. cruzi. Ao invadirem o organismo, essas formas infectantes irão migrar e invadir principalmente fibroblastos e macrófagos residentes. Ao invadirem os macrófagos, o mesmo irá buscar uma forma de eliminar o invasor através do burst oxidativo, na qual forma-se ao redor do parasita um vacúolo parasitóforo sendo liberados espécies reativas de oxigênio e nitrogênio. Contudo, os parasitos apresentam mecanismos de adaptação e resistência diferenciam-se para a forma amastigota que é replicante e mais resistente ao dano oxidativo (BRENER, 1973). Após a replicação no interior dos vacuólos parasitóforos, as amastigotas escapam desse vacúolo e migram para o citoplasma retornando a forma tripomastigota sanguínea com populações largas e delgadas, apresentando-se macrofogotrópicas e miotrópicas. O grande acumulo dos parasitas no interior da célula resulta em lise e o parasita retorna a corrente sanguínea infectando novas células dando continuidade ao seu ciclo biológico. Devido, este constante fluxo dos parasitas na corrente sanguínea, o triatomíneo ao se alimentar deste mamífero infectado contrairá o parasita a partir do sangue contaminado (BRENER, 1973). Na figura 4 é demonstrado resumidamente o ciclo de vida das diferentes formas evolutivas de T. cruzi.

Figura 4: Ciclo biológico e formas evolutivas de Trypanosoma cruzi. A igura foi desenhada com a ferramenta Biorender. (www.Biorender.com).

1.2.3 Caracterização morfológica

Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas pertencente ao super-grupo Excavata sendo o primeiro rank Englenozoa e segundo rank Kinetoplastea. Sua estrutura é caracterizada pela presença de um flagelo e apenas uma mitocôndria localizada no seu kinetoplasto, sendo esta uma organela que contem DNA específico (CHAGAS, 1909; MOREL et al., 1980; ADL et al., 2005). O parasita é predominantemente diploide e o método de reprodução se dá por meio de fissão binária (EL-SAYED et al., 2005).

As formas evolutivas do T. cruzi durante o ciclo biológico apresentam peculiaridades morfológicas durante o processo de adaptação em diferentes hospedeiros. A forma amastigota apresenta uma morfologia arredondada com um pequeno flagelo que está preso ao corpo do parasita e apresentam tamanho de 1,5 a 3 µm de comprimento e 2 µm de diâmetro. As formas amastigotas são intracelulares e apresentam a capacidade de infectar células de mamíferos. A forma evolutiva tripomastigota apresenta um longo flagelo livre originado após o núcleo, sendo esta a forma infectante para as células dos mamíferos. Morfologicamente, os tripanomastigotas apresentam o corpo alongado e é uma forma não replicativa do parasita. Já a forma epimastigota, que é uma forma de transição, está presente no intestino delgado dos triatomíneos e também nos hospedeiros

vertebrados, em pequenas quantidades, contendo um flagelo livre formado anteriormente ao núcleo, não é infectante, contudo é uma forma evolutiva altamente replicante através da fissão binária (DE SOUZA, 2010). Na Figura 5 são mostradas as diferentes formas evolutivas e as características morfológicas do T. cruzi.

Figura 4: As diferentes formas evolutivas do parasita Trypanosoma cruzi. Diferentes formas coradas com guiemsa e visualizadas por meio da microscopia óptica. Fonte: Adaptado e modificado a partir de (TELLERIA & TIBAYRENC, 2017).

A metaciclogênese no parasita é intermediado por diversas alterações genéticas. Os genes constitutivos transcritos praticamente não sofrem alterações durante a diferenciação. Contudo, outros diversos genes apresentam níveis de expressão modificados de acordo com a forma evolutiva, principalmente, aqueles genes envolvidos nos mecanismos patogênicos, aderência, sobrevivência e de infecção. Não apenas as diferentes formas evolutivas irão influenciar nestas alterações genéticas, as diferentes cepas e grupos que a espécie T. cruzi apresenta, também irão conferir a cada um destes grupos e cepas níveis de expressão diferente (TEIXEIRA et al., 1995; ABUIN et al., 1999; BARTHOLOMEU et al., 2002; BUSCAGLIA et al., 2006; GENTIL et al., 2009; ZINGALES et al., 2009).

1.2.4 Mecanismos de adaptação de Trypanosoma cruzi para os desafios do ambiente Todas as células e organismos se desenvolvem em ambientes com constantes mudanças. Estas mudanças ambientais influenciam diretamente na geração de transcritos e na expressão gênica das células. O destino celular depende da relação existente entre os balanço de estresses ambientais e alterações compensatórias que as células executam para

equilibrar este sistema (KÜLTZ, 2005). Quando o ambiente é desfavorável e aumenta a quantidade dos estresses as células apresentam dois tipos de respostas. Em um primeiro caso os estresses sofridos ocasionam tantos danos as células e mecanismos de defesa celular não são capazes de corrigir induzindo a morte celular e em um segundo quadro de resposta oposto ao primeiro na qual os danos não são suficientes para eliminar a célula que apresenta mecanismos de sobrevivência e dessa forma restaurar o equilíbrio com o ambiente (KÜLTZ, 2005).

No contexto do ciclo biológico de Trypanosoma cruzi, o parasito transita entre diversos ambientes que muitas vezes não são favoráveis ao seu desenvolvimento. Contudo o mesmo apresenta rede sistemática complexa responsável por modificações genéticas, morfológicas e outros que conferem resistência aos danos e restaurar a o equilíbrio. Dessa forma, permite ao parasita o desenvolvimento do seu ciclo de infecção e sua sobrevivência nos diferentes hospedeiros (JIMENEZ, 2014).

Determinados fatores como: adaptação ambiental (mudança de temperatura, avaliação nutricional e estresse osmótico), adaptação às respostas imunes dos hospedeiros e modulação e resistência ao estresse oxidativo durante o parasitismo são importantes para o processo de adaptações parasitárias (JIMENEZ, 2014; TARLETON, 2007; NAGAJYOTHI et al., 2012). Como pode ser visto na figura 6 os diferentes tipos de estresse envolvidos durante a metaciclogenese do parasita.

Figura 6: Metaciclogenese de T.cruzi durante o ciclo biológico. O esquema destaca diferentes fontes de estresse para o parasita. Figura desenhada com a ferramenta Biorender. (www.Biorender.com).

As alterações de temperatura sofridas pelo parasita percorrem todo o ciclo biológico. No hospedeiro invertebrado (triatomíneos) que é um organismo pecilotérmico, ou seja sua temperatura varia de acordo com o ambiente, a temperatura média neste hospedeiro é de 26ºC. Contudo, variações ambientais podem acarretar o aumento ou diminuição de até 10ºC em relação à média desta temperatura. E por isso, os genes envolvidos na expressão das Heat Shock Proteins (HSP) são mais expressos, pois este processo evitar o desenovelamento e a agregação de proteínas, além de regular sua localização e secreção. No momento que o parasito alcança o hospedeiro vertebrado na qual são homeotérmicos, com temperatura próxima a 37ºC, os níveis gerais de expressão gênica tendem a diminuir, contudo os transcritos que codificam as proteínas de choque térmico como por exemplo as HSP 40, HSP 60 e HSP 70 tem seu nível de expressão elevados (DE CARVALHO et al., 1990; FOLGUEIRA & REQUENA, 2007; PÉREZ-MORALES, et al., 2012).

Outro ponto importante a ser ressaltado sobre a proteína HSP 70 é a sua atuação imunomoduladora da resposta imune nos hospedeiros vertebrados, uma vez que em T.

cruzi, a proteína de choque térmico HSP 70 é uma proteína recombinante e devido variabilidade acaba por confundir o sistema imune controlando os níveis de expressão das IgG’s, expressando apenas tendo uma expressão significativa de IgG1 e auxiliando na produção de uma resposta inespecífica para eliminação do parasita (FLECHAS et al., 2009).

Somado a isso, modificações na composição lipídica do parasita presentes na membrana e interior da célula permitem minimizar os danos causados pelas alterações de temperatura. Uma vez que variações na membrana ocorrem para preservar a fluidez e funcionalidade das proteínas, o processo é chamado de adaptação homeoviscosa. Durante a mudança de temperatura de 26º C para 37ºC que ocorre durante a passagem do hospedeiro invertebrado para o hospedeiro vertebrado, é notado aumento na proporção esterol/fosfolípideo e na proporção de ácidos graxos saturados no período de 24 a 48 horas após ativação das proteínas de choque térmico. Assim sugerindo que alterações na composição da membrana possam estar ocorrendo para adaptar-se ao novo ambiente e associado aos processos de metaciclogenese (FLORIN-CHRISTENSEN et al., 1997).

Estresse relacionado a variação nutricional interfere diretamente no ciclo de vida do parasita, expressão metabólica, crescimento e na sua forma evolutiva. Uma vez que a forma epimastigota ao ser exposta a um estresse nutricional com falta de aminoácidos essenciais ou soro sofre diferenciação para a forma tripomastigota metacíclica in vitro. Este estresse ocorre durante a migração do intestino delgado para o intestino grosso do triatómineo, na qual a região da ampola, local onde fica alojado o parasita junto com as urina e fezes, é um ambiente com baixo pH e pobre em nutrientes, essa redução nutricional leva a diferenciação da forma epimastigota para tripomastigota (CONTRERAS et al., 1985; FIGUEIREDO et al., 2000).

O estresse nutritivo reduz a tradução mediada pela fosforilação e inibição de Eukaryotic Translation Initiation Factor 2 (eIF2). Contudo, já foi comprovado que a total inibição de eIF2α impede a diferenciação do parasita para a forma tripomastigota metacíclica indicando que este componente pode estar relacionado com a metaciclogenese e ciclo biológico de T. cruzi (TONELLI et al., 2011).

Um outro importante ponto a se destacar é a necessidade de ancoramento de proteínas de superfície de T. cruzi que em sua grande parte é realizado por proteínas glicosiladas. Tendo como principais proteínas responsáveis pela ancoragem na

membrana, a GP82 e a GP90. Estas glicoproteínas desempenham um importante papel durante o processo invasivo da forma tripomastigota. Ambas só são altamente expressas na forma tripomastigota permitindo que ancorem na superfície das células e assim invadi-las, estão diretamente ligadas também no processo de interconversão da forma epimastigota para a forma tripomastigota. Além disso, os altos níveis de expressão de GP90, para a forma tripomastigota, permitem o ancoramento do parasita no trato gastrointestinal durante a infecção oral e a rápida estabilização do quadro infeccioso. Em cepas que não apresentam esta alta expressão de GP90 o processo durante a infecção oral ocorre de forma lenta (RUIZ et al., 1998; BAYER-SANTOS et al., 2013; RODRIGUEZ et al., 2017).

O estresse osmótico, que consiste na alteração dos gradientes iónicos que provoca alterações na entrada e saída de íons e alterações na osmolaridade da célula do parasito, ocorre principalmente durante a migração do intestino delgado para o intestino grosso e durante o processo de infecção celular por tripomastigotas da corrente sanguínea (KOLLIEN et al., 2001; GO et al., 2004). O mecanismo de osmoregulação de T. cruzi é constituído pelos acidocalcisomas e o complexo de vacúolos contráteis desempenham papel fundamental na regulação do volume celular. Os acidocalcisomas são organelas membranares que contém altas concentrações de cálcio e fosfato presentes no citoplasma do parasita e a rede de vacúolos contráteis é formado por um vacúolo ou bexiga e uma rede de tubos chamadas de espongeomas (ROHLOFF et al., 2004).

Sob condições de hipo-osmolaridade o parasita utiliza o mecanismo chamado de decréscimo de volume regulatório (RMD) reduzindo seu volume intracelular liberando diversos aminoácidos neutros e aniônicos. Após o estresse, o sistema de recuperação é ativado e após uma cascata de reações desencadeadas pela adenosina monofosfato cíclica (cAMP) segue-se a recuperação do seu volume inicial (ROHLOFF etal., 2003).

Sob condições de hiper-osmolaridade os parasitas sofrem um rápido encolhimento, contudo não apresentam um mecanismo para recuperação do volume normal de forma rápida. Esse encolhimento é causado pelo bloqueio ou nocaute de APQ1 e bloqueio dos canais de cálcio. Nos estágios iniciais de hiper-osmolaridade ocorre aumento dos vacúolos contráteis, redução global dos níveis proteicos associados a regulação osmótica e aumento de aminoácidos livres. Além disso é notável que T. cruzi se adapte bem as situações de hiperosmolaridade, contudo sofre alterações gênicas, tais

como aumento da síntese de trans-sialidases, proteínas flagelares, aumento do mRNA direcionado ao ribossomo e transporte de aminoácidos (LI et al., 2011).

A mudança no transporte de aminoácidos está diretamente associado com as diferentes formas evolutivas que precisam de aminoácidos específicos para ajustes estruturais e diferentes expressões proteicas. O produto gerado a partir da metabolização destes aminoácidos resultam na formação de amônia (NH4) que é tóxico para o parasita, necessitando assim, sua detoxificação e externalização. O Transportador Intracelular de Amônio (TcAMT) é um mecanismo transportador de amônia que está situado em compartimentos ácidos do parasita. Este transporte é essencial para o parasita, pois o acumulo de amônia interfere diretamente na replicação, metaciclogênese, replicação das formas amastigotas, resistência ao estravasamento e estresse osmótico (CRUZ-BUSTOS et al., 2018).

Durante o ciclo de vida de T. cruzi, o processo de migração para o hospedeiro mamífero em especial, o homem é marcado por estresse que pode ser desencadeado pelo sistema imune para a eliminação do parasita. Durante este processo diversos mecanismos são ativados buscando evadir as defesas e garantir a infectividade até atingir a cronicidade. Os processos de recombinação de Padrões Moleculares Associados a Patógenos (PAMP's) permitem ao parasita a capacidade de alterar as sequências ou composição de determinados fatores ou complexos imunogênicos dificultando assim moléculas de reconhecimento. Estudos também sugerem a capacidade do parasita de interagir com as células natural killer (NK) e natural killer T (NKT) através de específicos ligantes que alteram a percepção destas células e as tornam ineficientes ao combater o parasita (DE AVALOS et al., 2002; LIEKE. et al., 2006; CREAGH & O’NEILL, 2006).

Além do sistema imune inato, o sistema imune adaptativo desencadeia processos de combate ao parasita. Contudo a capacidade do direcionamento das células T CD8+ para os locais nas quais foram reconhecidos os epítopos dos invasores acaba por ser ineficaz, pois o parasita apresenta grande família de genes tais como as trans-sialidases capazes de reconfigurar e gerar novas variações de epítopos que dificultam a identificação do parasita pois confundem o sistema imune, sendo assim, considerado um mecanismo de defesa (MARTIN et al., 2006; TARLETON, 2007).

1.2.5 Estresse oxidativo

No interior do hospedeiro vertebrado, o parasita libera através do sistema excretor-secretor diferentes fatores de virulência, proteínas degradadas e outros componentes para escapar do sistema imune do hospedeiro e produzir nutrientes pela hidrolíse de proteínas do hospedeiro em seu favor e posteriormente irão migrar e ao encontrar o macrófago ele irá se aderir e adentrar. Em uma resposta normal desencadeada pelo macrófago, ou seja, quando ele fagocita qualquer invasor, é produzido grande quantidade de espécies reativa de oxigênio (ROS) e de nitrogênio (NOS) pela ação de diversas enzimas digestivas presentes nos lisossomos para eliminar o invasor. Todavia, para a produção dessas espécies reativas a célula usa como co-fator a arginase que acelera e potencializa a produção destas espécies reativas. O mecanismo de eliminação com base nos danos oxidativos executada pelos macrófagos resulta em severos danos estruturais, na membrana, DNA, proteínas e inviabiliza a célula invasora levando a sua morte (TANAKA et al., 1983; ALVAREZ et al., 2011).

Contudo T. cruzi apresenta a capacidade de modular esse dano oxidativo produzido pelos macrófagos. Uma vez que a alta produção de espécies reativas de nitrogênio (NOS) e oxigênio (ROS) que são usadas para eliminar o parasita dependem da l-arginina como co-fator, o parasita modula a resposta capturando a l-argina do organismo invadido. Essa l-arginia é direcionada como substrato para produção de fatores de crescimento do parasita, bem como diminuem a capacidade dos macrófagos de produzirem grandes quantidades de espécies reativas para eliminar o parasita. Desta forma, os parasitas apresentam enzimas que competem juntamente com as enzimas do hospedeiro por l-arginina. A redução da produção de espécies reativas, a redução do pH, mudanças na osmolaridade e nutrientes produzidos a partir da l-arginina tornam o ambiente favorável para metaciclogenese e garantir a sobrevivência (HOLZMULLER et al., 2018).

T. cruzi também apresenta uma rede bastante complexa de proteínas que desempenham papel vital no combate ao estresse oxidativo, como: duas peroxidases dependentes de glutationa, duas peroxirredoxinas e quatro superóxidos dismutases dependentes de ferro (KRAUTH-SIEGEL & COMINI, 2008). Adicionalmente, o sistema ainda conta com diversas outras enzimas que desempenham papel vital para o correto funcionamento deste sistema complexo e eficaz (PIACENZA et al., 2013).

Além dos processos de morte celular, altas concentrações de espécies reativas de oxigênio (ROS) e de espécies reativas de nitrogênio (NOS) podem ocasionar danos diretos ao DNA do parasita, podendo ser induzido a quebra da dupla fita de DNA ou a formação da 8-oxoguanina. Quando o parasita é exposto estresse oxidativo no interior dos macrofagos, este estresse oxidativo mesmo que modulado ainda é capaz de causar dano ao DNA do parasita, resultando principalmente na formação de 8-oxoguanina tanto para o DNA nuclear quanto para o DNA presente no kinetoplasto. Este dano no DNA é facilmente reconhecido e reparado pelo sistema de excisão de base (BER). Além do sistema de reparo por excisão de base, o parasita apresenta um sistema de reparo através da incompatibilidade dos pares de bases que é utilizado quando o mecanismo de BER não consegue reconhecer os erros na sequência do DNA. Ambos os sistemas estão envolvidos no reparo do DNA nuclear e mitocondrial (CABRERA et al., 2011; CAMPOS et al., 2011).

Por fim, a interação do estresse oxidativo e respostas desencadeadas por outros tipos de estresse ocorrem durante o ciclo de vida do parasita constantemente, contudo o T. cruzi um mecanismo de adaptação e tolerância (SWINDELL et al., 2007; MORANO et al., 2012).

1.2.6 Anidrase carbônica de Trypanosoma cruzi

As anidrases carbônicas constituem uma classe de metaloproteínas que estão presentes em todos os organismos, estando envolvidas em diversos processos fisiológicos e patológicos mostram como principal função a conversão do dióxido de carbono em bicarbonato e prótons na presença de água. Estas metaloproteinas podem ser divididas em várias subclasses: α-, β-, γ-, δ-, ξ – anidrase carbônica (PASTOREKOVA et al., 2004; PAN et al., 2013).

Presente em T. cruzi a α-anidrase carbônica (TcCA) é uma dessas subclasses que tem importante papel na sobrevivência do parasita, essa metaloprteína foi caracterizada e apresentou uma atividade catalítica semelhante à anidrase carbônica de humano II (hCA II). Para esta estrutura observou-se um sítio catalítico na qual o íon metálico de zinco (Zn2+) desempenha papel central na estrutura interagindo com 3 Histidinas de forma coordenada nas posições His158, His160 e His177 (PASTOREKOVA et al., 2004).

Outro ponto a se destacar na estrutura da α-anidrase carbônica é a presença de uma espécie de “portão” que coordena a interação com substratos e inibidores feitos pela glutamina na posição 106 e uma treonina na posição 199. Contudo, o átomo responsável pelo transporte de prótons para o centro metálico de zinco na grande maioria das α-anidrase carbônica é feita por uma Histidina presente na posição 64. Contudo, em T. cruzi o mesmo não ocorre, pois, o parasita apresenta uma asparagina ASN na posição 64 indicando que o transporte de prótons de forma coordenada para ativação do centro metálico no desencadeamento do processo de conversão do dióxido de carbono em bicarbonato é coordenado por outro aminoácido. Isto se dá porque a asparagina não apresenta um pKa adequado para realizar tal transferência de prótons (FISHER et al, 2012; MIKULSKI et al., 2012; PAN et al., 2013). Mesmo com esta troca, a α-anidrase carbônica de T. cruzi apresenta uma alta eficiência neste processo de conversão, indicando que possivelmente os átomos de histidina presentes na região terminal na posição 27 (His27) ou na posição 35 (His35) coordenem o processo de protonação para o desencadear da atividade biológica (PAN et al., 2013).

A α-anidrase carbônica de T. cruzi é caracterizado como um alvo para ação de novos fármacos, devido que primeiramente que em todo o genoma de T. cruzi foi encontrada apenas uma sequência para a síntese da α-anidrase carbônica e está sequência é truncadatruncada. Além disso, esta proteína está associada com fatores de crescimento e fatores de virulência para patógenos (SUPURAN, 2008). As suas funções estão envolvidas em mecanismos como: respiração, transporte de CO2 e bicarbonato, regulação

do pH, secreções eletrolíticas, reações biossintetícas e outras. A associação destas funções com o ciclo de vida do parasita está diretamente relacionada com a metaciclogenese (ASPATWAR et al., 2019). Portanto a inibição desta proteína é um importante fator para eliminação do parasita.

1.3 Ditiocarbamatos

O ano em que os ácidos ditiocarbâmicos foram descobertos não é conhecido, mas o primeiro relato de seu uso foi em 1850 por Debus (DEBUS, 1850). Os ácidos ditiocarbâmicos são uma classe de compostos químicos usados em uma variedade de aplicações farmacológicas, tais como atividades antiparasitárias, antifúngicas, antivirais e antitumorais. Estruturalmente, os ditiocarbamatos consistem de uma ampla classe de monoácidos 1,1-ditioligantes que interagem com metais de forma coordenada, nas quais eles podem ser facilmente sintetizados a partir de uma ampla variedade de compostos

precursores (TOPPING & JONES, 1988; MECO et al., 1994; SANCHEZ-CORTES et al., 2001; PANG et al., 2007; BUAC et al., 2012; GUCCHAIT et al., 2018).

A rota de síntese dos ditiocarbamatos pode ser bastante diversificada, na qual varia de acordo com o produto que se deseja obter. O método tradicional é baseado na reação de uma amina primária ou secundária com dissulfeto de carbono na presença de metal ou sal alcalino (Figura 7). Nesse processo, o tipo de amina interfere na formação dos substituintes, diferindo em mono ou diacil ditiocarbâmico, e o tipo de estrutura pode variar entre cíclico ou linear (BONAMICO et al., 1965a; BONAMICO et al., 1965b; BONAMICO et al., 1965c; HOGARTH, 2005).

As estruturas produzidas apresentam 2 estágios de coordenação para interação com os complexos metálicos. Na ressonância, o elétron é descentralizado entre os dois enxofres no grupo SCS-_{. Essa descentralização provoca uma aproximação entre os dois}

enxofres com o carbono reduzindo sua reatividade em relação a outras moléculas, pois o sistema apresenta uma maior estabilidade. No hibrido de ressonância ocorre o desemparelhamento do elétron em um dos enxofres do grupo SCS. Por causa disso, a extremidade C-S terá uma carga negativa, o que resulta numa distância maior do carbono, tornando esta extremidade mais reativa para se ligar com outras moléculas, contudo quando comparamos a estabilidade desta interação, nota-se que a formação de um polo confere uma estrutura menos estável para interação do que quando os dois enxofres mesmo que menos reativos são capazes de interagir (BONAMICO et al., 1965a; BONAMICO et al., 1965b; HOGARTH, 2012).

O tipo de ligação química formada entre o grupo SCS e metais pode variar de acordo com as características de reatividade química do metal, que podem ser do tipo monodentado (Uma ligação entre o ditiocarbamato e o metal), do tipo bidentado (duas ligações simétricas entre o ditiocarbamato e o metal) ou do tipo anisobidentado (as duas ligações com distâncias diferentes entre o ditiocarbamato e o metal). A interação SCS mostra um aumento na força de união dependendo do tamanho do centro metálico / grupo químico e do alinhamento (BONAMICO et al., 1965b).

A capacidade de interação dessas estruturas com metais dá um importante valor biológico, pois muitas proteínas e enzimas apresentam em suas composições centros metálicos essenciais para suas funções. Os ditiocarbamatos atuam como quelantes de metais desestabilizando a estrutura dessas moléculas e inibindo sua ação (HOGARTH, 2005). Além disso, conforme revisado por Bond e Martin, a interação com alguns metais

está relacionada à processos oxidativos que são mecanismos importantes para a eliminação de micro-organismos (BOND & MARTIN, 1984).

Não apenas a extremidade SCS tem uma função biológica, mas a amina presente nesta estrutura pode interagir com diferentes substituintes modulando respostas e direcionando para alvos específicos. Além disso, atua produzindo espécies reativas de oxigênio (ROS) conferindo uma importante atividade biológica para os ditiocarbamatos (COUCOUVANIS, 1970; DE KONING, 2011).

Mesmo se as características gerais da cadeia principal forem semelhantes, cada grupo químico terá sua própria estrutura particular. Assim, pequenas alterações na estrutura, como mudanças espaciais de um determinado segmento, podem gerar mudanças na função e no comportamento dos derivados formados, permitindo maior versatilidade para a aplicação biológica de novos compostos sintetizados (CORREDOR et al., 2009). Na figura 7 é exposto o processo de síntese dos ditiocarbamatos.

Figura 7: Representação esquemática da síntese dos ditiocarbamatos (OLIVEIRA et al., 2019).

1.3.1 Principais grupamentos químicos dos Ditiocarbamatos e aplicações

Os diferentes compostos gerados são estabelecidos pela capacidade de formação de complexos por essas estruturas, não apenas com metais, mas também pela substituição dos grupos químicos por segmentos diferentes. Isto promove a esta classe de compostos

uma separação em diferentes grupamentos, de acordo com o tipo de elemento que se liga à estrutura (HOGARTH, 2005).

Destaca-se os principais grupos de derivados formados são: os complexos formados entre os ditiocarbamatos com os compostos do grupo III A que são complexos geralmente formados por iodetos metálicos, principalmente de boro ou alumínio, com um parente (hidratado) do grupo I A metal ou sal ditiocarbâmico de amônio. Os complexos formados entre os ditiocarbamatos e com os compostos do grupo IV A são compostos carbonados, ésteres do ácido ditiocarbâmico, também classificado como compostos orgânicos, os quais apresentam aplicações voltadas diretamente para o campo farmacêutico, agroquímicos, intermediários de sínteses orgânicas, para formação de drogas e pró-drogas, entre outros. Os complexos formados entre os ditiocarbamatos e com os compostos do grupo V A são complexos ditiocarbamicos homolépticos e ligantes-mistos que foram estudados extensivamente e apresentam considerável diversidade estrutural. O ligante ditiocarbamato deste grupo tende a atuar como quelante assimétrico sendo que uma das interações com metal SCS-M consideravelmente mais curta que a outra. Os complexos formados entre os ditiocarbamatos e com os compostos do grupo VI A tem como principal característica a alteração na coordenação de centros metálicos, alterando os mecanismos de interação com outras estruturas, apresentando derivados que se ligam principalmente a sulfatos, dando origem a compostos orgânicos tais como os thiuram, além disso, podem interagir com os outros componentes desse grupo como o selênio e o telurênio que atuam como aceleradores em processos de vulcanização (HEARD, 2005; CORREDOR et al, 2009; CHATURVEDI & ZAIDI, 2016).

Existem centenas de compostos pertencentes a cada um destes grupos, que podem variar entre os substituintes em tamanho, tipo de cadeia (orgânico ou inorgânico), geometria espacial, principais ligantes, funções, alvos moleculares, etc. Em detrimento destas características, os compostos podem atuar direta ou indiretamente sobre vários micro-organismos (CHATURVEDI & ZAIDI, 2016; KANCHI et al., 2014).

Os ditiocarbamatos de maneira geral apresentam-se como compostos de alta eficiência na inibição α-anidrases carbônicas. Sendo importante para o tratamento de diversas doenças como glaucoma e alguns tipos de tumores (CARTA et al., 2012; BOZDAG et al., 2015). Além disso, os ditiocarbamatos foram elucidados ao longo dos anos como compostos com alta atividade antiparasitária. Bem como a sua ação sob as

α-anidrases carbônicas de diversos parasitas (PAL et al., 2015; VERMELHO et al., 2017; OLIVEIRA et al., 2019).

1.3.2 Dietilditiocarbamato de Sódio (DETC)

Dietilditiocarbamato de sódio é um composto pertencente a classe dos ditiocarbamatos formado por dois substituintes etil ligados a uma amina que está ligada ao dissulfeto de carbono interagindo com o íon de sódio (2H5C2NSCSNa). Além disso,

este composto é o principal subproduto produzido durante a metabolização do dissulfiram. (TOPPING & JONES, 1988). A estrutura 3-D do DETC pode ser visualizada na figura 8.

Diversos estudos da sua aplicação ao longo dos anos já foram elucidadas. Como, tratamento de HIV, estimulante da produção de óxidos por macrófagos, nanoformulações para tratamento de cânceres, atividade antioxidante e outros (BRULEY-ROSSET et al., 1986; MANKHETKORN et al., 1994; PANG et al., 2007; CHEN et al., 2016).

Esta molécula com ampla diversidade biológica apresenta mecanismos de ação ligado a sua estrutura. A parte amina formada pelo nitrogênio e os dois grupamentos etíl, atuam semelhante aos fármacos tradicionais, pois estes estimulam a produção de espécies reativas de oxigênio devido a sua porção aminada. Além disso, sua extremidade SCS, apresenta-se como forte ligante de metais (CHANTHAL et al., 2011; DE KONING, 2011).

Este composto assim como todo ditiocarbamato apresenta forte atuação como quelante de metais. Já foi aplicado anteriormente na parasitologia contra Leishmania sp. demonstrando resultados favoráveis tanto para testes in vitro quanto in vivo e sendo capaz de inibir enzimas importantes do metabolismo antioxidante como é o caso da superóxido dismutase de ferro que é a principal responsável por metabolizar radicais superóxidos para o parasita (Khouri et al., 2010; Celes, et al., 2016).

Figura 8: Estrutura 3-D do composto Dietilditiocarbamato de Sódio. As esferas de diferentes cores representam os diferentes átomos que compõe a estrutura do DETC. Fonte: (OLIVEIRA, 2019).

Testes já demonstraram a inespecificidade do DETC pela α-anidrase carbônica II humana que apresenta um sítio ativo semelhante ao do parasita, desta forma a atuação na α-anidrase carbônica do parasita pode vir a ser um importante alvo deste cmposto(DEL PRETE, et al., 2016). Esta possível diferente ação resulta da coordenação dos aminoácidos que atuam como “portão” para alcançar o sítio ativo das anidrases carbônicas de humano e do parasita, uma vez que, são diferentes em ambas as proteínas.

2.1 Objetivo Geral

Analisar e caracterizar a atividade antiparasitária do dietilditiocarbamato (DETC) em diferentes cepas de T. cruzi.

2.2 Objetivos específicos

- Avaliar a atividade antiparasitária do DETCin vitro frente nas cepas Cl Brener, Dm28c, Qmm9 e Y de T. cruzi nos períodos de 24 e 48 horas.

- Analisar os mecanismos de morte celular desencadeados pelo DETC em 4 diferentes cepas de T. cruzi.

- Avaliar as alterações morfológicas desencadeados pelo DETC em T. cruzi. - Avaliar a Citotoxicidade celular desencadeada pelo DETC nas linhagens celulares 3T3 e RAW.

- Investigar a ação de inibitória do DETC por meio da atividade proteolítica em gel de gelatina.

3. 1 Cultivo axênico de Trypanosoma cruzi

Diferentes cepas do T. cruzi [TcI (cepa Dm28c) (GOLDENBERG, 1984); TcII (cepa Y) (FREITAS, 1950); Tc (cepa QMM9) (RIBEIRO et al., 2014) e TcVI (cepa CLBlener) (BRENER & CHIARI, 1963) foram cultivados em meio LIT (Liver Infusion Tryptose) suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado (SFB) (v/v) e 5% de antibiótico streptomicina/penicilina 100UI/ml. Os cultivos foram mantidos a 27º C, para as formas epimastigotas de T. cruzi. Para a obtenção da forma evolutiva tripomastigota de T. cruzi foi utilizado o método de estresse nutricional, à partir da forma epimastigota do parasito por um período de 25 dias. O estresse sofrido pela escassez de alimento pode causar alterações genéticas e aumento de expressão de vários proteínas que provocam a diferenciação de T. cruzi, alterações foram confirmadas por meio de microscopia considerando os cultivos que apresentaram na sua concentração parasitária total de formas tripomastigotas 75% ou mais (CAMAROO et al., 1964.).

3.2 Avaliação da atividade antiparasitária do DETC em cepas de Trypanosoma cruzi Os parasitas foram cultivados durante 5 a 7 dias para obtenção da fase log da forma epimastigota e para a forma tripomastigota de T. cruzi foram 25 dias para sua obtenção. Para tal atividade, os parasitas foram diluídos e contados com auxílio da câmera de Neaubauer e utilizados na concentração de 1 x 107 parasitas/mL. Em seguidas foram plaqueados 200µL em cada poço em placas de 96 poços, em um sistema de triplicatas e posteriormente foi aplicado diversas concentrações do composto dietilditiocarbamato de sódio trihidratado (DETC) variando sua concentração de 444 µM até 4 µM. Em seguida, foram analisados a viabilidade das diferentes cepas do parasita no período de 24 e 48 horas, após o tratamento. Para avaliar a viabilidade dos parasitas tratados com diferentes concentrações de DETC foi realizado o ensaio de redução da resazurina (Sigma Aldrich), que consistiu na aplicação de 20 µL de resazurina na concentração de 1mM nos poços para ambos os períodos de testes do composto. Este processo de redução da resazurina tem a durabilidade de 24 horas após aplicação e em seguida foi realizado a leitura no leitor de microplacas (Epoch, BioTek Instruments, Winooski, VT, USA) utilizando os comprimentos de onda 570nm e 600nm (CORRAL et al., 2013). Na qual o percentual de inibição se deu a partir da seguinte formula: