O composto mostrou atividade tripanosomicida em 4 cepas (Dm28c (TcI), Y (TcII), QMM9 (TcIII) e Cl Brener (TcVI)) de diferentes DTU’s de T. cruzi nas formas epimastigota e tripomastigota axênico. As diferentes cepas mostraram perfil inibitório variado, ao observar o IC50 obtidos na forma epimastigota e tripomastigota. Estes perfis
estão diretamente relacionados com os fatores genéticos e filogenéticos expressos por cada uma destas cepas (ZINGALES, 2018).
Quando se analisa a filogenia de T. cruzi é possível inferir que as cepas Dm28c (TcI) e Y (TcII), não são cepas hibridas e na forma infectantes estas cepas não híbridas demonstraram os menores IC50 para o composto. Já as cepas QMM9 (TcIII) e Cl Brener
(TcVI) que são cepas híbridas, foram as que apresentaram a maior resistência ao composto. O hibridismo existente dentro da espécie de Trypanosoma cruzi é um fator influente sobre o perfil de resposta ao composto. Ao analisar a filogênia de T. cruzi, tem- se que as cepas TcIII, variante genética resultante de eventos genéticos entre TcI e TcII, e TcVI, resultante de eventos genéticos entre TcII e TcIII, podem apresentar características genéticas dos precursores que as tornam mais resistentes aos danos causados pelo composto (LEWIS et al., 2009; ZINGALES et al., 2012).
Em estudos primordiais com cepas de T. cruzi em 1982 Dvorak e colaboradores, observaram que entre as diversas cepas que ele estudou tinham variação genética de cerca de 40% entre elas, estando relacionadas com o DNA nuclear e no Kinetoplasto. Posteriormente em 2009 Lewis e colaboradores, isolaram diversas estirpes naturais e ao realizarem a genotipagem observaram que o genoma das cepas apresentava uma variação em tamanho de cerca de 48%, ou seja, dentro desta espécie tem-se variações genéticas em praticamente todo o genoma. Após a indicação da heterogeneidade de T. cruzi resultante de análise de diversos genes individuais, tem-se proposto mecanismo recentemente mecanismo de hibridização a partir de eventos envolvendo troca no DNA nuclear e do kinetoplasto para formação das populações híbridas. Dessa forma esta hibridização contribui para as presentes estruturas populacionais da espécie e evolução de distintos subgrupos. Além disso, processos de hibridização estão diretamente relacionados com desenvolvimento de resistência pelas cepas. (DVORAK et al., 1982; BRISSE et al., 2003; LEWIS et al., 2009)
Portanto, os fatores genéticos e filogenéticos de T. cruzi assumem papel fundamental na diferença de resposta pelas diferentes cepas ao DETC. Contudo, não apenas as variações genéticas e filogenéticas são os únicos fatores ligados a resistência. Tem-se também que os processos de metaciclogenese está diretamente associado com
alteração nos padrões de expressão gênica por parte do parasito. Estas alterações gênicas estão relacionadas com expressão de diferentes proteínas, constituição da membrana do parasito, regulação de níveis transcricionais e traducionais. Estes fatores resultam diferenças de resposta parasitária aos estímulos ou estresse que são submetidos, como quando expostos ao DETC, tem-se que estas alterações podem conferir aumento de resistência a drogas devido a alterações sofridas. Isto foi possível observar nas cepas Y, Dm28c e Cl Brener que por intermédio da metaciclogenese houve redução da eficácia do composto, resultando no aumento do IC50 (GAUNT et al., 2003; LEWIS et al., 2011;
Contudo, não apenas fatores citados interferem diretamente neste processo, o ambiente na qual o parasita está inserido também é um importante fator, seja ele in vitro ou in vivo. O ambiente também coordena os níveis de expressão de T. cruzi e pode estar diretamente relacionado com as variações genéticas sofridas pelos parasitas ao longo dos séculos, sendo assim está relacionado com os diferentes perfis de resistência (MORAIS et al., 2014).
Quando se compara a eficácia do DETC com o benznidazol que é o fármaco tradicionalmente utilizado para o tratamento da doença de Chagas, nos intervalos de 24 e 48 horas após aplicação de ambos os compostos, DETC mostrou-se capaz mais eficaz, apresentou IC50 menor em ambos os intervalos. Sabe-se que o mecanismo proposto pelo
benznidazol consiste na utilização do grupo amina para produção de espécies reativa de oxigênio e nitrogênio levando o parasita a morte, contudo esta liberação ocorre de forma gradual. DETC por ser uma molécula menor e que apresenta essa mesma amina para estimular a produção de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio é mais eficaz na produção das espécies reativas eliminando o parasita mais rapidamente. Contudo, tem-se que os demais mecanismos de ação do benznidazol ainda não foram bem elucidados (GARAVAGLIA et al., 2016; PÉREZ-SILANES et al., 2016).
A ampla ação do DETC em diversas cepas com diferentes tropismos é um fator importante. Sabe-se que as cepas Dm28c e Y, TcI e TcII respectivamente, causam diferentes manifestações clínicas nos estágios crônicos da doença, sendo TcI relacionado ao miotropismo e a TcII ao megafagotropismo, assim, o composto apresenta espectro de ação em cepas que podem causar diferentes manifestações clinicas para doença de Chagas. Contudo para as cepas QMM9 e Cl Brener, poucos estudos demonstram seu perfil clínico, desta forma, são necessários mais estudos para determinar as manifestações clínicas apresentadas por estes parasitos. Porém tem-se que as DTU’s TcIII e TcVI apresentam quadro clínico difuso, ou seja, desencadeiam miotropismo e
megafagotropismo. As manifestações clinicas difusas são associadas às cepas híbridas e também está relacionado com uma maior resistência do parasito. Uma vez que estas DTU’s de T. cruzi infectam diferentes tecidos, eles devem possuir uma maior resistência na forma infectante para ser possível alcançar os seus alvos, resistindo aos mecanismos do sistema imune do hospedeiro (JIMENEZ et al., 2019).
A ação inibitória do DETC já havia sido demonstrada contra Leishmania sp., outro gênero da família dos tripanosomatideos. Em estudos realizados em 2010 por Khouri e colab. E em 2016 por Celes e colab. utilizando as cepas de L. amazonensis e L. braziliensis, respectivamente, eles demonstraram a ação in vitro e in vivo, contra as duas principais formas evolutivas do parasita, promastigota e amastigota. Além do uso tópico do DETC aderido a um biofilme para o tratamento de leishmaniose cutânea. Assim como apresentado neste trabalho para T. cruzi, para Leishmania sp. foi caracterizado um dano significativo sobre a mitocôndria do parasita, podendo este ser um determinante mecanismo do DETC na eliminação dos parasitas. Este severo dano mitocondrial esta associado as diversas metaloproteínas tal como a superóxido dismutase de ferro (Fe- SOD) presentes na mitocôndria do parasita que são os principais responsáveis por mitigar o dano oxidativo, uma vez que DETC inibe estas proteínas e ainda aumenta a produção de espécies reativas, causa severo dano a mitocôndria dos parasitas (RODRIGUES et al., 1995; MIKOYANET al., 1997; KHOURI, 2010; CELES et al., 2016).
Além disso, a capacidade da metabolização da resazurina está diretamente relacionado com o funcionamento dos complexos I, II e III da membrana interna das mitocôndrias. Observa-se que a medida que a concentração do DETC aumenta ocorreu uma diminuição na capacidade de metabolização da resazurina pelas mitocôndrias do parasita. Como T. cruzi apresenta apenas uma mitocôndria associado a movimentação do seu flagelo, a não redução da resazurina está associado a falha nos complexos da membrana interna da mitocôndria do parasito (ZHANG et al., 2004; MENEZES et al., 2006). O ensaio com o marcador de atividade de potencial da membrana interna da mitocôndria mostrou severa redução desse potencial de membrana interna de T. cruzi. As grandes reduções sofridas pelas diferentes cepas nesse potencial indicam que a membrana interna da mitocôndria sofreu danos resultando num mal funcionamento da regulação do gradiente de protonação executados pelos complexos I, II e III e afetam diretamente na síntese do ATP levando a morte celular (MENNA-BARRETO et al., 2009).
Ao analisarmos o ensaio de redução do MTT que está diretamente associado com a viabilidade celular, nota-se que o DETC ocasiona diminuição viabilidade celular das
linhagens celulares RAW e 3T3 em um percentual variando de 80% até 40% a medida que se aumentou a concentração do composto. Nota-se que estas alterações estão relacionadas com a capacidade do DETC de interagir com os componentes que compõe o mecanismo redox das células. Na qual diminui os níveis de expressão de enzimas como catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx) e glutationa redutase (GR), esta redução pode tornar as células mais vulneráveis ao dano oxidativo e assim levar a a morte celular (RAHDEN-STAROŃ et al., 2012). O mesmo padrão de alterações no metabolismo redox também foi observado quando se testou o dissufiram, na qual o DETC é o metabolito principal (GROSICKA-MACIĄG et al., 2010).
Foi observado também que o mesmo apresenta ação antioxidante e também induz o aumento da produção de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio pelos macrófagos. Dessa forma o DETC pode auxiliar na eliminação do parasita por aumentar o dano oxidativo e sobrepor a modulação do dano oxidativo pela via da arginase executadas pelo parasita (BRULEY-ROSSET et al., 1986; MANKHETKORN et al., 1994; HOLZMULLER, 2018).
Quando analisamos o índice de seletividade do DETC mostrando a relação das diferentes DTU’s e s linhagens celulares, nota-se que o DETC apresentou uma seletividade moderada. Ou seja, existe um maior direcionamento para eliminação do parasita do que para as linhagens celulares. Isto é uma característica interessante e importante, uma vez que estes compostos apresentam uma maior seletividade do que os fármacos tradicionais, assim aumentando sua viabilidade para ser empregado para o tratamento da Doença de Chagas (PÉREZ-SILANES et al., 2016).
Com base nos ensaios apoptóticos, na qual o parasita não demonstrou quase nenhuma resposta ao ligante, já foi confirmado que ao depender do tipo celular testado, DETC pode induzir respostas anti-apoptóticas atuando como um regulador da apoptose. Isto se dá, devido sua capacidade de atuar nas caspases e se ligar aos seus sítios ativos através do grupamento tiol e inibi-las, dessa forma inibindo os processos apoptóticos (DUMAY et al., 2006). O mesmo mecanismo pode ser observado no dissulfiram (Nobel et al., 1997). Além disso, o próprio T. cruzi na forma epimastigota não apresenta fosfatidilserina como marcador para processos apoptóticos, logo não pode ser marcado (DAMATTA et al., 2007). O DETC celular pode desencadear tanto necrose quanto apoptose (KIMOTO-KINOSHITA et al.,2004), como foi observado nas cepas Qmm9 e Cl Brener, mesmo em pequena quantidade.
Contudo a presença ou ausência da fosfatidilserina nas diferentes cepas do parasita é algo a se discutir. Como demonstrado em 2007 por DAMATTA e colaboradores, as formas epimastigotas das cepas Y e Dm28c apresentavam a ausência da fosfatidilserina. Estas cepas em questão pertencentem as classes TcII e TcI respectivamente não expressaram nenhuma resposta significativa ao marcador de morte celular.
Contudo para as cepas QMM9 e Cl Brener o resultado demonstrado foi um pouco diferente, o que pode gerar novos questionamentos sobre a presença da fosfatidilserina na forma epimastigota do parasita. Como mostrado na figura 4, as cepas QMM9 e Cl Brener apresentaram, mesmo que baixa, uma pequena reação a fosfatidilserina. Sendo que estas variações de resposta a presença ou ausência da fosfatidilserina pode resultar através das diferenças genéticas das DTU’s do parasita que segundo o modelo Three ancestor model proposto por De Freitas e colaboradores (DE FREITAS et al., 2006).
Este modelo explica que as Cepas da classe TcIII ao qual a cepa QMM9 está contida seria uma terceira variável originada da cepa ancestral e a cepa e a cepa Cl Brener seria uma resultante hibrida pertencente a classe TcVI tendo origem a partir das classes TcII e TcIII. Por apresentar traços genéticos relacionados a classe T III pode ter herdado características genéticas que conferem a está cepa a capacidade de expressar fosfatidilserina, mesmo em pequenas quantidades. Contudo mais estudos são necessários para comprovar esta hipótese.
O estresse oxidativo causado pelo DETC, pode desencadear diferentes alterações morfológicas no parasita. A partir do MEV constatou-se que o DETC causa descontinuidade na membrana plasmática do parasita, formação de poros e ruptura tal como mostrado por SANTA-RITA e colab. na ação da edolfisina sobre o T. cruzi. (MAAROUF et al., 1997). Além disso a descontinuidade da membrana causada pelo DETC pode estar diretamente relacionada com danos causados por estresse oxidativo, estes danos iram afetar a composição da membrana do parasita e dessa forma danifica-la (Santa-Rita et al., 2005). A partir da fragmentação da membrana observada quando o composto foi aplicado, pode se dar devido ao dano oxidativo interferir na organização do citoesqueleto ou na conexão do citoesqueleto com o citoplasma, essa interferência na conexão ocasiona a perca da estrutura celular do parasita que resulta nesta fragmentação (VANNIER-SANTOS & DE CASTRO, 2009).
Ao analisar-se em conjunto os danos na membrana interna da mitocôndria e o MEV, podemos associar que existe uma associação entre os danos mitocondriais e a formação de poros que levam a morte celular. Uma vez que o DETC causa severos danos
a mitocôndria e inibe a liberação de fatores de morte celular mediada por caspazes, os danos intracelulares se acumulam através do estresse oxidativo e inviabilidade mitocondrial, levando assim a desestruturação membranar e morte do parasita através de mecanismos não apoptóticos. Quando os mecanismos de morte celular programada são inibidos outros marcadores são liberados levando a morte celular (XIANG et al.,1996; GREEN & REED, 1998; TAIT & GREEN, 2010).
Como já mencionado as diferentes cepas apresentam diferenças gênicas e níveis de expressão proteica diferentes. Ao analisar o perfil proteolítico em extratos das diferentes cepas de T. cruzi observa-se que a atividade proteolítica demonstrada ocorre de forma diferente, de acordo com a cepa. Notou-se que as cepas Dm28c, Y e Cl Brener tinham bandas bem expressas nas regiões de 40 a 60 kDa e próximos a 80 kDa enquanto a cepa QMM9 teve apenas atividade proteolítica na região de 40 a 60 kDa. Esta diferença na expressão, vai de acordo com a cepa e as características genéticas que ela possui. A expressão destas proteínas na região de 40 a 60 kDa são principalmente metaloproteinas, serino-proteases, císteino proteases, fatores de virulência entre outras, sendo estas importantes proteínas para sobrevivência do parasita, resistência a danos oxidativos, desacelerar processos de reconhecimento e atuantes nos processos de infecção. Já na região de 80 kDa pode-se destacar as glicoproteínas de superfície, gliconjungados, sendo estas proteínas de ancoramento responsável permitir adesão nas células, trans-sialidases que alteram os padrões de reconhecimento por parte do sistema imune dificultando sua ação e muitas outras proteínas. Contudo nota-se que na cepa QMM9 não apresentou atividade proteolítica na região de 80 kDa para a zimografia, devido sua caracterização recente, pouco se tem sobre suas características (SCHARFSTEIN et al., 1986; FAMPA et al., 2008; DE SOUZA et al., 2010; Monteiro, 2015).
Os extratos das diferentes cepas de T. cruzi quando expostos ao DETC na zimografia apresentaram uma alta redução da atividade proteolítica, a diminuição na expressão destas bandas resulta na inibição de diversas enzimas responsáveis pela sobrevivência do parasita, adaptação ao ambiente e resistência. Além disso, a inibição de proteínas na região de 80 kDa que são responsáveis pela adesão, esta diretamente associado a capacidade do parasita de adentrar a célula do hospedeiro, ou seja, a inibição destas proteínas indica a incapacidade do parasita de se aderir as células para o seu processo de infecção, este mecanismo pode ser bastante importante para controle da morbidade da doença de Chagas (RODRIGUEZ et al., 2017).
Além disso, as reduções das demais proteínas na região de 40 kDa a 60 kDa, podem resultar na diminuição de importantes metaloproteínas como GP63 e α-anidrase carbônica, cisteino-proteases como a cruzipaina, GP 57 e GP51 e serino proteases são estruturas proteícas essências para o mecanismo de sobrevivência, infecção e modulação da resposta contra o T. cruzi. (SCHARFSTEIN et al., 1986; DE SOUZA et al., 2010; MONTEIRO, 2015).
Os modelos tridimensionais da α-anidrase carbônicas de T. cruzi gerados e validados são estáveis e representativos. Na qual o sitio ativo das α-anidrases carbônicas são formadas pela interação entre 3 histidinas e o zinco. Além disso as angulações formadas são correspondentes ao sitio ativo desta proteína (SUPURAN em 2016). Na última década α-anidrase carbônica de T. cruzi tem sido alvo da descoberta de vários inibidores, na qual estruturas contendo sulfonamidas e tiois apresentaram-se com alta capacidade de ligação com o zinco e inibição da sua atividade (ALTERIO et al., 2012). A presença do grupamento tiol no DETC e a ação dos ditiocarbamatos no geral podem conferir uma ação contra a α-anidrase carbônica de T. cruzi. Além disso, já foi demonstrado na literatura a capacidade dos ditiocarbamatos serem potenciais inibidores desta enzima (PAN et al., 2013).
Então o ancoramento do DETC no sítio ativo da α-anidrase carbônica de T. cruzi, esta proteína regula diversos processos ligados a controle de pH, osmolaridade, crescimento e diferenciação e além disso apenas uma sequência é encontrada em toda genoma de T. cruzi. A inibição deste alvo proteico irá resultar em dano aos mecanismos de troca iônica, redução da capacidade metaciclogenese por parte do parasita e inibição de crescimento das formas replicantes. O resultado disto irá conduzir o parasito a morte, devido a grande quantidade de estresse sofrido (ASPATWAR et al., 2019).
Outro ponto importante é que α-anidrase carbônica de T. cruzi apresenta sítio ativo semelhante ao da α-anidrase carbônica humanas II, contudo os aminoácidos que controlam o acesso ao sítio ativo são diferentes. Em estudos realizados em 2016 por Del Prete e colaboradores, DETC mostrou inespecífico da α-anidrase carbônica humanas II, isto indica o ancoramento do DETC α-anidrase carbônica de T. cruzi resulta em um mecanismo de eliminação desta importante metaloproteina para o parasita (DEL PRETE, et al., 2016). Uma vez que os aminoácidos que funcionam como “portão” controlam a entrada do acesso, a diferença nestes aminoácidos pode resultar numa facilidade para o
ancoramento do DETC no sitio ativo da proteína do parasita, quelando o zinco e inativando a proteína.
Além disso, como elucidado por PAN et al., 2013, grupos de sulfonamidas, tiois simples e ligantes de metaloproteinas, tais como DETC, demonstraram excelente atuação na inibição α-anidrase carbônicas de T. cruzi. O com que a partir da sua estrutura química assume tanto papel de tiol e ligante em metaloproteinas e possui grande capacidade de interação com a molécula. Além disso, a confirmação do ancoramento in silico com direcionamento do enxofre para interação ao centro metálico da proteína reforça a atuação e a capacidade para o DETC de inibir outras metaloprotreinas (KHOURI, 2010)
Foi observado que o DETC apresenta fatores favoráveis para ser estudado como possível alvo farmacológico para a doença de Chagas. Contudo, estudos com as formas tripomastigotas, amastigotas e in vivo ainda são necessários para sua validação. Os mecanismos de ação, somado a baixa concentração do IC50, seletividade e toxicidade
moderada ou elevada de acordo com a cepa, ação sob cepas pertencente aos grupo (DTU’s) s TcI, TcII, TcIII e TcVI de T. cruzi e o amplo espectro de ação do composto durante o ciclo de vida do parasito, tornam este composto promissor para estudos aprofundados aplicados a doença de Chagas (KATSUNO et al., 2015).