AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE DE MULTIPLICAÇÃO E SOBREVIVÊNCIA

FRESCAL

As Tabelas 6 e 7 mostram as contagens de E. coli O157:H7 durante o processamento do QMF para as cepas RJ581 e EDL 933, respectivamente.

Tabela 6 - Contagens de E. coli O157:H7 (cepa RJ581) durante as etapas de fabricação do queijo Minas frescalb

Pontos de Coleta

Inóculos de E. coli O157:H7(UFC/mL)a

102 103

Após aquecimento a 35°C < 100 5,5 x 104

Após formação da coalhada < 100 2,7 x 104

a: Valores médios.

Tabela 7 - Contagens de E. coli O157:H7 (cepa EDL933) durante as etapas de fabricação do queijo Minas frescala

Pontos de Coleta

Inóculos de E. coli O157:H7(UFC/mL)a

102 103

Após aquecimento a 35°C 9,0 x 102 5,8 x 104

Após formação da coalhada < 100 5,5 x 104

Após salga e agitação a 42°C < 100 2,3 x 104

Queijo pronto (dia 0) < 100 1,2 x 105

a

Valores médios.

Nas amostras coletadas durante o processamento dos QMFs inoculados com 102 células de EHEC O157:H7 por mL leite, não foi possível realizar a contagem desta bactéria, através da metodologia utilizada, com exceção da amostra com a cepa EDL933, coletada após o aquecimento a 35°C. Contudo, após enriquecimento, foi possível recuperar células de E. coli O157:H7 a partir das amostras coletadas, indicando a presença de células viáveis. O teste convencional de contagem padrão em placa através de semeadura em superfície é um teste com baixa sensibilidade, ou seja, não detecta números baixos de células (Silva et al., 2010). A melhor detecção direta de E. coli O157:H7 através do método convencional de plaqueamento é de 102 a 104 UFC/g ou ml, dependendo do alimento (Sata et al., 1999). O simples plaqueamento em CT-SMAC apresenta baixa sensibilidade, pois este meio não é adequado para detecção de células estressadas (McCarthy et al., 1998; Stephens & Joynson, 1998). No queijo, as células bacterianas encontram-se comumente estressadas, devido principalmente a presença de ácido láctico (Jordan & Maher, 2006). Jordan & Maher (2006), relataram que o limite de detecção de E. coli O157:H7, a partir de alimentos, utilizando CT-SMAC, é de

aproximadamente 103 UFC/g. Talvez isso explique a ausência de detecção em algumas avaliações. Para aumentar a sensibilidade de detecção de E. coli O157:H7 em alimentos, utilizando CT-SMAC, uma etapa de enriquecimento é requerida (Zadik et al., 1993), contudo esta etapa aumenta a população bacteriana, não retratando a realidade do produto original.

Quando o QMF foi fabricado com leite contaminado com inóculos iniciais de 103 UFC/mL, ao final do processamento, o queijo apresentou contagem 10 vezes maior que a da matéria-prima na cepa RJ581 e 100 vezes maior para a cepa EDL 933.

Saad et al. (1999), avaliaram a influência da microbiota natural da carne crua no crescimento de E. coli O157:H7 em carne moída, mantida a 8,5°C por 96h. Neste estudo foram inoculados artificialmente cepas de E. coli não patogênicas, concomitantemente, com cepas de E. coli O157:H7, com diferentes níveis de inóculo. Quando níveis intermediários, 103- 104 UFC/g, de E.coli O157:H7 foram incubados com 106 – 107 UFC/g de E.coli não patogênica a contagem de E. coli O157:H7 só foi possível até 24h de armazenamento a 8,5°C e esta contagem foi igual ao inóculo inicial, provavelmente isso ocorreu pela dificuldade de enumerar este patógeno diante de altas contagens de E. coli não patogênica. Quando o inóculo foi menor, 101- 102 UFC/g, as dificuldades aumentaram e não possível a contagem. Diante de inóculos maiores de E. coli O157:H7, 106 – 107 UFC/g, E. coli não patogênica não apresentou interferência no crescimento do patógeno.

D’amico et al. (2010), avaliaram a multiplicação e sobrevivência de E. coli O157:H7, inoculada artificialmente com 20 UFC/mL, durante a manufatura dos queijos cheddar e gouda em diferentes temperaturas de armazenamento. Com esse nível de inóculo, não foi possível observar colônias de E. coli O157:H7 por plaqueamento direto em, aproximadamente, metade dos testes de queijo cheddar, quando houve um crescimento excessivo da microbiota natural do queijo.

Durante a fabricação do QMF com leite inoculado com 103 células de EHEC O157:H7/mL foi possível realizar a contagem bacteriana nas amostras, a partir de todos os pontos de coleta, sendo observado o aumento da população bacteriana em 1 log nas etapas iniciais de coleta e 2 log no queijo pronto. Estes resultados demonstram que as etapas de

E.coli O157:H7.

Desse modo, os resultados mostraram que baixo nível do inóculo inicial de E. coli O157:H7, 102 UFC/mL de leite, e altas contagens de E. coli não patogênica influenciaram o crescimento do patógeno. Também foi constatado que não houve diferença no multiplicação e sobrevivência das diferentes cepas de E. coli O157:H7 avaliadas durante as etapas de processamento do QMF, bem como o processamento não influenciou crescimento deste patógeno, quando o QMF foi preparado com leite inoculado com 103 UFC/mL.

6.4. AVALIAÇÃO DA MULTIPLICAÇÃO E SOBREVIVÊNCIA DE O157:H7 DURANTE O ARMAZENAMETO DO QUEIJO MINAS FRESCAL

Chamamos de tratamento cada grupo comparativo, ou seja, os inóculos iniciais, os tempos de armazenamento e as cepas bacterianas. A partir dos resultados do modelo de regressão múltipla podemos constatar que houve diferença altamente significativa entre os inóculos 102 e 103, e o controle, utilizado como categoria de referência, já comparando o inóculo 102 com 103, não houve diferença significativa. Na comparação entre os dias de armazenamento a 8°C, utilizamos como referência o dia inicial (dia 0), e encontramos, em ambos inóculos iniciais, aumento significativo nos dias 4 e 5 e declínio de sua população em seguida, atingindo queda significativa nos dias 10 e 15. A comparação da evolução da população bacteriana entre as cepas EDL933 e RJ581 não apontou diferença significativa, considerando o nível de significância fixado em 5% (p > 0,05) (Tabela 8).

Tabela 8 - Influência dos tratamentos na multiplicação e sobrevivência de EHEC O157:H7. Tratamentos p- valor Inóculo 102 < 0,001*** Inóculo 103 < 0,001*** Dia 2 0,322873 Dia 4 0,000336*** Dia 5 0,000323*** Dia 7 0,060288

Dia 10 0,041931*

Dia 15 0,000313***

Cepa RJ581 0,088789

Uma análise gráfica do log da contagem de EHEC O157:H7 em relação ao tratamentos aplicados está demonstrada no gráfico da Figura 4.

Figura 4 – Gráfico das contagens de E. coli O157:H7 durante o armazenamento a 8°C

avaliaram a multiplicação e sobrevivência de um mix de cepas de O157:H7 (níveis de inóculos iniciais 102 e 105) no soro pasteurizado de queijo cheddar em temperaturas de armazenamento de 4, 10 e 15°C durante 28 dias. No armazenamento sob temperatura de 10°C e 15°C, independente do nível de inoculação as contagens de E. coli O157:H7 tiveram um aumento significativo nos dias 7 e 4 de armazenamento, respectivamente, e declínio de sua população logo em seguida. Outros autores também descreveram a capacidade de multiplicação e sobrevivência de E. coli O157:H7 em baixas temperaturas. Ransaram et al. (1998), demonstraram a capacidade de E. coli O157:H7 sobreviver em queijo Camembert e Feta, fabricados com leite inoculado com 104 UFC/mL de leite, armazenados a 2°C, por pelo ao menos 60 dias.

Os resultados deste estudo mostraram que a temperatura de armazenamento a 8°C permitiu a multiplicação de E. coli O157:H7 em QMF até, pelo ao menos, do 4° a 5° dia de armazenamento, após este período a população bacteriana diminui, além disso, células viáveis foram encontradas até, pelo ao menos, o 7° e 10° dia de armazenamento nos QMF fabricados com inóculos iniciais de 102 e 103 UFC/ml de leite, respectivamente, Figura 4.