UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
CIÊNCIAS APLICADAS A PRODUTOS PARA SAÚDE
JESIELI BRAZ FROZI
MULTIPLICAÇÃO E SOBREVIVÊNCIA DE ESCHERICHIA COLI PRODUTORA DE TOXINA SHIGA (STEC) DO SOROTIPO O157:H7 DURANTE O PROCESSAMENTO E
JESIELI BRAZ FROZI
MULTIPLICAÇÃO E SOBREVIVÊNCIA DE ESCHERICHIA COLI PRODUTORA DE TOXINA SHIGA (STEC) DO SOROTIPO O157:H7 DURANTE O PROCESSAMENTO E
ARMAZENAMENTO DE QUEIJO MINAS FRESCAL
Dissertação apresentada ao curso de Pós Graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para a Saúde da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para a obtenção do Grau de Mestre. Área de concentração: interdisciplinar.
Orientador(a): Profa Dra. Alice Gonçalves Martins Gonzalez Co-orientador(a): Profa Dra. Josiane Roberto Domingues
NITERÓI 2012
JESIELI BRAZ FROZI
MULTIPLICAÇÃO E SOBREVIVÊNCIA DE ESCHERICHIA COLI PRODUTORA DE TOXINA SHIGA (STEC) DO SOROTIPO O157:H7 DURANTE O PROCESSAMENTO E ARMAZENAMENTO DE QUEIJO MINAS FRESCAL
Dissertação apresentada ao curso de Pós Graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para a Saúde da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para a obtenção do Grau de Mestre. Área de concentração: interdisciplinar.
BANCA EXAMINADORA
__________________________________________________________________ Profa. Dra. ALICE GONÇALVES MARTINS GONZALEZ – Orientadora – UFF
__________________________________________________________________ Profa. Dra. LUCIANA MARIA RAMIRES ESPER – UFF
__________________________________________________________________ Profa. Dra. RAQUEL REGINA BONELLI – UFRJ
__________________________________________________________________ Profa. Dra. KAREN SIGNORI PEREIRA – Revisora – UFRJ
Dedico este trabalho aos amores da minha vida, meus pais Marise e Jeziel, minhas irmãs Lorena e Lícia e ao meu marido Vinícius.
AGRADECIMENTOS
À Deus, por permitir e abençoar a realização deste sonho.
Aos meus pais, pelo amor incondicional e incentivo durante toda a minha vida. Sem eles jamais chegaria até aqui.
Ao meu marido Vinícius por acreditar na importância desse sonho.
À minha orientadora Profa Dra. Alice Gonçalves Martins Gonzalez, Co-Orientadora Profa Dra. Josiane Roberto Domingues, Prof. Dr. Joel Rosa, a coordenação e aos professores do Programa de Pós-graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para a Saúde, pelo apoio e pelos ensinamentos compartilhados.
Às colegas de laboratório Ana Luiza e Lúcia Helena pela participação tão importante na realização deste trabalho.
À amiga Kallyne por todos bons momentos de estudo, conversas e conselhos.
ÍNDICE
LISTA DE TABELAS ... 9
LISTA DE FIGURAS ... 10
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ... 11
RESUMO ... 12
ABSTRACT ... 13
1. INTRODUÇÃO ... 14
2. REVISÃO DE LITERATURA ... 16
2.1. QUEIJO MINAS FRESCAL ... 16
2.1.1. Características Físico-Químicas ... 16
2.1.2. Características Microbiológicas ... 17
2.1.3. Etapas de Fabricação do Queijo Minas Frescal ... 19
2.2. ASPECTOS GERAIS DE ESCHERICHIA COLI NÃO PATOGÊNICA ... 22
2.3. ESHERICHIA COLI PRODUTORA DE TOXINA SHIGA (STEC/EHEC) ... 23
2.3.1. História e Definições... 23
2.3.2. Multiplicação e sobrevivência de EHEC O157:H7 em alimentos ... 25
2.3.3. Reservatório Animal e Transmissão ... 27
2.3.4. Considerações Clínicas ... 27 3. OBJETIVO GERAL ... 29 4. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 29 5. MATERIAIS E MÉTODOS ... 30 5.1. CEPAS BACTERIANAS ... 30 5.1.1. Cepas Utilizadas ... 30 5.2. MATÉRIA-PRIMA ... 30
5.3. AVALIAÇÃO DA QUALIDADE FÍSICO-QUÍMICA E MICROBIOLÓGICA DO LEITE ... 30
5.3.1. Controle Físico-Químico do Leite ... 31
5.3.2. Controle Microbiológico do leite ... 32
5.4. FABRICAÇÃO DO QUEIJO MINAS FRESCAL ... 34
5.4.1. Contaminação artificial do queijo Minas frescal ... 36
5.4.2. Avaliação da Qualidade Físico-Química do Queijo Minas Frescal ... 38
5.4.3. Avaliação da Qualidade Microbiológica do Queijo Minas Frescal ... 39
5.5. AVALIAÇÃO DA MULTIPLICAÇÃO E SOBREVIVÊNCIA DE O157:H7 DURANTE AS ETAPAS DE PROCESSAMENTO E ARMAZENAMENTO DO QUEIJO MINAS FRESCAL ... 41
5.5.1. Avaliação da Multiplicação e Sobrevivência de EHEC O157:H7 ... 41
5.5.2. Processamento das Amostras para Realização da PCR ... 44
5.5.3. Cepas Controle ... 44
5.5.4. Reação da PCR ... 44
5.5.5. Programa Utilizado ... 45
6.1. AVALIAÇÃO QUALIDADE FÍSICO-QUÍMICA E MICROBIOLÓGICA DO
LEITE ... 46
6.2. QUALIDADE FÍSICO-QUÍMICA E MICROBIOLÓGICA DO QUEIJO MINAS FRESCAL ... 50
6.3. AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE DE MULTIPLICAÇÃO E SOBREVIVÊNCIA DE O157:H7 DURANTE AS ETAPAS DE PROCESSAMENTO DO QUEIJO MINAS FRESCAL ... 53
6.4. AVALIAÇÃO DA MULTIPLICAÇÃO E SOBREVIVÊNCIA DE O157:H7 DURANTE O ARMAZENAMETO DO QUEIJO MINAS FRESCAL ... 56
6.5. CONFIRMAÇÃO DAS CEPAS DE EHEC O157:H7 ... 58
7. CONCLUSÕES ... 58
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Denominação das amostras de QMF em relação a cepa bacteriana, ao inóculo inicial e ao lote de leite pasteurizado tipo C utilizado como matéria-prima. ... 36 Tabela 2 – Número de amostras de queijo Minas frescal estudadas... 38 Tabela 3 - Parâmetros Físico-Químicos e Microbiológicos das de Leite Pasteurizado utilizadas como matéria prima ... 47 Tabela 4 - Avaliação da Qualidade Físico-Química dos Queijos Minas Frescal Estudados .... 50 Tabela 5 - Qualidade microbiológica do QMF inoculado artificialmente com as cepa RJ 581 e EDL933. ... 52 Tabela 6 - Contagens de E. coli O157:H7 (cepa RJ581) durante as etapas de fabricação do queijo Minas frescalb ... 53 Tabela 7 - Contagens de E. coli O157:H7 (cepa EDL933) durante as etapas de fabricação do queijo Minas frescala ... 54 Tabela 8 - Influência dos tratamentos na multiplicação e sobrevivência de EHEC O157:H7 . 56
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Fluxograma de Preparação do Queijo Minas Frescal, Furtado (2004). ... 35 Figura 2 - Esquema demonstrativo da inoculação artificial do leite para preparo do queijo Minas frescal. ... 37 Figura 3 - Pontos de coleta de amostra durante as etapas de processamento e armazenamento do queijo minas frescal inoculado artificialmente. ... 43 Figura 4 – Gráfico de multiplicação e sobrevivência de E. coli O157:H7 durante o armazenamento a 8°C ... 57
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
STEC - Escherichia coli produtora de toxina Shiga EHEC - Escherichia coli enterohemorrágica EIEC - Escherichia coli enteroinvasiva EPEC - Escherichia coli enteropatogênica DAEC - Escherichia coli de aderência difusa VTEC - Escherichia coli verotoxigênica QMF- Queijo minas frescal
UFC - Unidade formadora de colônia
CT- SMAC - Ágar MacConkey Sorbitol com cefixime e telurito PCR - Polymerase chain reaction
mL - Mililitros
pH - Potencial hidrogeniônico CH - Colite hemorrágica
SHU - Síndrome Hemolítica Urêmica PTT - Púrpura trombocitopênica trombótica A/E - Attaching/Effacing
Kg - Kilograma
ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária SLT - Shiga-like toxin
TSB - Trypticase Soy Broth BPW - Buffered Peptone Water TSI - Triple sugar iron
VRB -Vermelho Violeta Bile µL - Microlitros
LEB - Listeria enrichment broth AP - Ágar palcam
VM - Vermelho de Metila VP -Voges Proskauer
RESUMO
O objetivo deste estudo foi determinar a multiplicação e a sobrevivência de E. coli produtora de toxina Shiga (STEC) do sorotipo O157:H7 em queijo Minas frescal (QMF). Duas cepas de E. coli O157:H7 (RJ581 e EDL933) foram, experimentalmente, inoculadas no leite pasteurizado usado para a fabricação do QMF com inóculos de 102 e 103 células/mL. A avaliação da multiplicação e sobrevivência das cepas de E. coli, através da contagem de unidades formadoras de colônia (UFC) em ágar MacConkey Sorbitol suplementado com cefixime e telurito (CT-SMAC), foi realizado durante as diferentes etapas de processamento do queijo e durante os tempos de 0, 2, 4, 5, 7, 10 e 15 dias de armazenamento. Os queijos foram mantidos a 8ºC até o fim das análises. As colônias foram confirmadas como E. coli O157 através da pesquisa do gene rfb O157 por reação em cadeia da polimerase (PCR). Os padrões físico-químicos do leite utilizado como matéria prima e do QMF fabricado estavam de acordo com os padrões recomendados, com exceção de duas amostras que apresentaram o valor de pH levemente mais ácido que o encontrado na literatura. As análises microbiológicas do leite e do QMF apresentaram contagens de E. coli indicadora de contaminação fecal muito acima dos padrões recomendados pela legislação. Quando o QMF foi fabricado com leite contaminado experimentalmente com inóculos iniciais de 103 células/mL, ao final do processamento, o queijo apresentou contagem 10 vezes maior que a da matéria-prima para a cepa RJ581 e 100 vezes maior para a cepa EDL 933. Durante o armazenamento, os inóculos de 102 células/mL, de ambas as cepas, apresentaram o máximo crescimento no 4° dia de armazenamento, enquanto que os inóculos de 103 células/mL, apresentaram máximo de crescimento no 5° dia de armazenamento, a partir deste ponto observamos declínio na população, até ausência de detecção. Contudo, células viáveis foram encontradas até, pelo ao menos, o 7° e 10° dia de armazenamento dos QMFs fabricados com inóculos iniciais de 102 e 103 células/mL de leite, respectivamente. Estes resultados mostraram que E. coli O157:H7 foi capaz de se multiplicar e sobreviver no QMF, partindo de inóculos inicias com baixo número de células (102 e 103), encontramos na literatura que esta quantidade de células por grama ou ml de alimento é capaz de causar infecções em humanos e que o QMF, mesmo quando armazenado sob refrigeração é um veículo em potencial de doença provocada por STEC O157:H7.
Palavras chaves: E. coli O157:H7, Multiplicação e sobrevivência, Queijo Minas Frescal
ABSTRACT
The objective of this study was to determine the proliferation and survival of E. coli O157:H7 in Brazilian Minas Frescal Cheese (QMF). Two E. coli strains were experimentally inoculated into pasteurized milk used in Minas Frescal cheese production at level 102 and 103 cells/mL. The study of the proliferation and survival of E. coli strains, by counting the colony forming units (CFU) on MacConkey agar Sorbitol (CT-SMAC) was performed during various stages of processing of the cheese and during the times 0, 2, 4, 5, 7, 10 and 15 storage day. The cheeses were stored at 8ºC until the end of the analysis. The microbiological and physico-chemical quality of pasteurized milk and cheese were also evaluated. The colonies on CT-SMAC were confirmed as STEC O157: H7 through research of rfb O157 gene by polymerase chain reaction (PCR). The microbiological and physico-chemistry analysis of pasteurized milk and cheese were also evaluated, and were according to standards recommended. Microbiological analyzes of milk and QMF presented counts of E. coli far above the recommended legislation.When the QMF was made from milk inoculated with initial inoculum 103 cells/mL in the end of processing, the cheese had count 10-folds higher that of the raw material from the RJ581 strain and 100-folds higher from the EDL strain 933. During storage at 8° C, the inoculum of 102 cells/mL, both strains showed the most growth in the cheese on the 4th day of storage, whereas inoculum 103 cells/mL, grew up in 5th storage. Additionally, viable cells were found to at the least, the 7th and 10th day of storage in the QMF made from initial inoculum of 102 and 103 cells/mL of milk, respectively. These results showed that STEC O157:H7 was able to survive and multiply in counts able to cause infection in humans even when stored under refrigeration.
1. INTRODUÇÃO
Um sorotipo particularmente virulento de Escherichia coli produtora de toxina Shiga (STEC), sorotipo O157:H7, desde que foi reconhecido como patógeno humano em 1982 é em muitos países considerado uma ameaça à saúde pública por estar envolvido em muitos surtos e causar uma variedade de doenças principalmente em crianças, idosos e pacientes imunocomprometidos. As doenças causadas por STEC O157:H7 incluem colite hemorrágica (CH), síndrome hemolítica urêmica (SHU) e púrpura trombocitopênica trombótica (PTT), complicações provenientes destas doenças podem levar a morte (Riley, 1983; Karmali et al., 1983; Machin, 1984; Buchanan & Doyle, 1997). Sorotipos de STEC capazes de causar doença em humanos e de produzirem uma lesão denominada lesão A/E (attaching-effacing), que leva ao aplainamento e destruição das microvilosidades intestinais, são também classificadas como E. coli enterohemorrágica (EHEC). EHEC é um subgrupo de STEC e o sorotipo O157:H7 é o protótipo deste grupo (Mainil & Daube, 2005, Caprioli et al., 2005).
Muitos casos esporádicos e surtos de CH e SHU relacionados a EHEC O157:H7 tem sido registrados na América do Norte, Reino Unido e Japão, além de ser o sorotipo de EHEC mais frequentemente isolado de pessoas doentes nesses lugares (Lim et al., 2010; Sánchez et al., 2010). Um surto de EHEC O157:H7 no Japão afetou cerca de 8.763 crianças, entre hospitalizadas e sintomáticas (Michino et al, 1998). Apenas no período compreendido entre maio e setembro de 2010, o Japão registrou cinco surtos de EHEC O157:H7 (IDSC, 2011). Nos Estados Unidos os mais recentes casos registrados foram dois surtos multi-estaduais, relacionados ao consumo de alface, nos meses de março e abril de 2011 (CDC, 2011) e estima-se que neste país, infecções provocadas por EHEC O157:H7 causem 73.000 casos de pessoas doentes, 2.200 hospitalizações e 60 mortes por ano (Mead et al., 1999) e o custo anual para tratar as doenças é de 405 milhões de dólares, incluindo perda de produtividade, cuidados médicos e mortes prematuras (Frezen et al., 2005).
Em 1996 um surto na Escócia destacou a importância deste patógeno, onde dos 120 pacientes afetados 34 desenvolveram SHU e 16 morreram (Dundas et al., 2001). Um
trágico evento ocorrido em maio de 2000 em Walkerton no Canadá, ficou conhecido como a tragédia de Walkerton, onde 7 pessoas morreram e cerca de 2.300 pessoas ficaram doentes após consumirem água contaminada com E. coli O157:H7 (Holme, 2003; Salvadori et al., 2009).
A Argentina tem a maior incidência de casos de SHU do mundo em crianças com cinco anos de idade ou menos e esta síndrome é a maior responsável pelo desenvolvimento de falha renal aguda e segunda maior causa de falha renal crônica e transplante de rins em crianças, sendo a taxa de mortalidade de crianças com essa síndrome em torno de 5%. Alguns autores constataram a presença de EHEC O157:H7 em crianças com SHU, indicando uma relação entre este patógeno e esta enfermidade (Rivas et al., 2008; Rivero et al., 2010).
No Brasil não há um sistema de vigilância que apresente dados sistemáticos de infecção por EHEC O157:H7 e casos de SHU. Pesquisas realizadas no país nos últimos anos, ainda são poucas, mas têm demonstrado a ocorrência de importantes sorotipos de STEC (O26:H11, O157:H7, O111NM, O111:H8) em humanos como causa de doenças, tais como diarréia sanguinolenta, anemia hemolítica e SHU (Guth et al., 2002; Irino et al., 2002; Vaz et al., 2004).
E. coli O157:H7 coloniza naturalmente o trato gastrointestinal e a junção reto-anal do gado bovino, principal reservatório de STEC, e em geral estes animais são assintomáticos (Lim et al.; 2007; Naylor et al., 2003). E. coli O157:H7 já foi isolada de bovinos em vários países, incluindo o Brasil (Cerqueira et al., 1997; Cerqueira et al., 1999; Irino et al., 2005; Aspán & Eriksson, 2010; Grauke et al., 2002; Gonzalez, 2003; Van Baale et al., 2004). Muitos surtos causados por este patógeno estão associados ao consumo de alimentos de origem bovina, bem como aqueles alimentos e água que possam ter entrado em contato com o animal e ou suas fezes (Watanabe et al., 1999; Honish et al., 2005; Salvadori et al., 2009; CDC, 2000).
Devido ao alto potencial de contaminação, à severidade das doenças e aos surtos de larga escala causados por alimentos contaminados, pesquisas têm sido realizadas para avaliar o multiplicação e sobrevivência deste patógeno em alimentos prontos para consumo e
durante sua manufatura (D’amico et al., 2010; Carvalho et al. 2007; Breidt & Cadwell, 2011).
Surtos envolvendo EHEC O157:H7 causados pelo consumo de vários tipos de queijo, leite e iogurte tem sido relatados ao longo dos anos (Duncan et al., 1987; Morgan et al., 1993; Upton & Coia, 1994).
No Brasil, a produção de queijos representa uma das mais importantes atividades da indústria de laticínios, dentre os quais se destaca o queijo Minas frescal (QMF), que é um dos queijos mais amplamente conhecidos e difundidos (Isepon & Oliveira, 1995). O QMF caracteriza-se por ser um queijo, fresco, macio, com alta atividade de água, pH em torno de 5,0 e baixo conteúdo de sal (Buriti et al. 2005), sendo assim, as características físico-químicas desse queijo aumentam o potencial de risco da incidência de alguns patógenos por constituir um meio adequado para o crescimento dos mesmos (Carvalho et al., 2007). Com isso, é de grande relevância avaliar a multiplicação e sobrevivência de EHEC O157:H7 durante o processamento e armazenamento de QMF produzido a partir de leite pasteurizado contaminado artificialmente.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. QUEIJO MINAS FRESCAL
2.1.1. Características Físico-Químicas
O QMF é um dos produtos lácteos mais difundidos no Brasil, possuindo ampla aceitação no mercado nacional. Devido a sua simples tecnologia de fabricação, ele é amplamente produzido pela indústria de laticínios, e comercializado a preços acessíveis a grande parte da população (ABIQ, 2005), sua produção, em números, fica atrás apenas da produção dos queijos prato e muçarela (Uliana & Rosa, 2009). Algumas projeções mostram o crescimento do setor de fabricação de queijos, a partir de 2000, variando entre 4 e 5% ao ano. Apenas em 2005, foram produzidas 510 mil toneladas de queijo, o que gerou uma receita de 3,75 bilhões de reais. As cerca de 2.500 empresas do setor, que fornecem os 4,5 kg per capita
consumidos anualmente pelos brasileiros, podendo chegar até a 8kg nos grandes centros, geram 375 mil empregos diretos, além das vagas indiretas na indústria pecuária nacional (INMETRO, 2006).
De acordo com a Portaria n° 146 (Brasil, 1996) e Portaria n° 352 (Brasil, 1997) do Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA), o QMF é um queijo fresco obtido por coagulação enzimática do leite com o coalho e/ou enzimas coagulantes apropriadas, complementada ou não com ação de bactérias lácticas específicas. É classificado como queijo semigordo (25-44,9% de matéria gorda no extrato seco), de muito alta umidade (umidade não inferior a 55%). Outras características relevantes nesse tipo de queijo são, o baixo pH (5,1-5,6) e baixo conteúdo de sal (1,6%) (Freitas et al., 1993).
2.1.2. Características Microbiológicas
A qualidade microbiológica é um parâmetro que indica tanto as condições higiênicas de produção como a segurança do produto para consumo. O QMF apresenta vários pontos críticos durante a fabricação que podem levar a alterações no produto final, destacando-se, matéria-prima com alta contaminação microbiológica, recontaminação do leite pasteurizado e temperatura inadequada de armazenamento (Lopes & Stamford, 1997).
Segundo Spreer (1991), o leite e seus derivados constituem um meio nutritivo ideal para os microrganismos, pois contém todos os nutrientes necessários para seu crescimento. No caso do QMF, o pH em torno de 5,0 (Buriti et al., 2005), alto teor de umidade e baixo conteúdo de sal o tornam um meio, ainda mais adequado para o crescimento de microrganismos, inclusive patógenos. Desse modo deve ser consumido nos primeiros quinze dias após sua fabricação, pois é altamente perecível mesmo sob refrigeração (Silva et al., 2003; Perry, 2004; Hoffmaan et al., 2002; Furtado, 2005).
A contaminação do QMF tem ganhado importância destacada, sendo considerado pela Vigilância Sanitária um problema emergente que exige atenção por parte dos órgãos oficiais, principalmente no que diz respeito ao controle higiênico-sanitário do produto
microbiológica para alimentos é a Resolução RDC no 12, de 2 de janeiro de 2001, da Agência Nacional de Vigilância Sanitária – ANVISA (Brasil, 2001). Os padrões estabelecido para QMF são ausência de Salmonella sp. e Listeria monocytogenes em 25g, limites máximos para estafilococos coagulase positiva de 103 UFC.g-1 e coliformes a 45ºC de 5 x 102 UFC. g-1.
Muitas espécies patogênicas de bactérias como, Salmonella sp., Staphylococcus aureus, L. monocytogenes e E. coli tem sido encontradas em QMF durante os processos de fabricação e armazenamento sob refrigeração. Na verdade, a ocorrência de microrganismos e elevados níveis de contaminação ocorrem quando a manipulação e processos de fabricação, limpeza dos equipamentos, temperaturas de transporte, estocagem e os procedimentos de pasteurização são negligenciados (Lopes & Stamford, 1997; Araújo et al., 2002; Silva et al., 2003; Buriti & Rocha, 2006; Uhlich et al., 2006; Pastore et al., 2008), apresentando, este alimento, um risco potencial a saúde do consumidor.
EHEC O157:H7 tem emergido como um patógeno de transmissão alimentar e produtos lácteos tem sido, constantemente, associados com surtos causados por esse microrganismo. Após um surto de infecção alimentar associado ao consumo de queijo fresco nos EUA, a presença de EHEC O157:H7 neste produto adquiriu considerável importância (CDC, 2002).
EHEC O157:H7 foi detectada em 7,84% das amostras de queijo fresco provenientes de Lima, no Peru (Mora et al., 2007) e em 4% dos queijos fabricados a partir de leite cru na Turquia (Öksuz et al., 2003). Embora a detecção de EHEC O157:H7 em produtos lácteos seja de grande importância e o QMF seja um alimento com características intrínsecas adequadas ao crescimento deste microrganismo, poucos são os trabalhos encontrados na literatura que estudaram a detecção de EHEC O157:H7 em QMF, principalmente fabricados com leite pasteurizado.
Surtos associados à EHEC O157:H7 ainda não foram confirmados em nosso país, no entanto, existem relatos de alta prevalência de STEC em bovinos saudáveis (Cerqueira et al., 1999; Gonzalez, 2003; Irino et al., 2005, Sandrini et al., 2007; Stella et al., 2008), além disso, Paneto et al. (2007), ao estudarem 50 QMF elaborados com leite não pasteurizado obtidos em supermercados da região Centro Oeste do Brasil, encontraram E. coli em 96% e,
destas, 6% pertenciam a categoria STEC. Apesar de não ter sido isolado o sorotipo O157:H7, os autores sugerem que o QMF pode ser veículo de transmissão de STEC e por consequência de EHEC O157:H7.
2.1.3. Etapas de Fabricação do Queijo Minas Frescal
2.1.3.1. Obtenção da Matéria-Prima
O leite utilizado como matéria-prima deve conter 3,3-3,5% de gordura e ser pasteurizado ou submetido a tratamento térmico equivalente que garantam a inocuidade do produto (Brasil, 2007; Perry, 2004).
A obtenção do leite de vacas sadias, em condições higiênicas adequadas, e o seu resfriamento imediato a 4ºC são medidas fundamentais e primárias para garantir a qualidade e a segurança do leite e seus derivados, além de otimizar o resultado do processo de pasteurização, uma vez que um alto número de microrganismos no leite cru pode contribuir para contagens de microrganismos além do permitido pelos padrões regulatórios (Arcuri et al., 2006).
A microbiota inicial do leite pasteurizado consiste, primariamente, de bactérias termodúricas e esporos provenientes do leite cru, dentre as bactérias mais comuns estão as espécies pertencentes aos gêneros, Bacillus, Micrococcus, Lactobacillus, Microbacterium, Corynebacterium, Streptococcus, Enterococcus e Anthrobacter (Cousin, 1982). Muitas bactérias termodúricas crescem, vagarosamente, em leite refrigerado e, geralmente, tem o crescimento inibido por algumas espécies de bactérias psicrotróficas (Pseudomonas, Flavobacterium) que podem contaminar o leite pós-pasteurização devido a deficiência no processo de limpeza dos equipamentos e utensílios, falta de higiene dos manipuladores, ou até mesmo falha no processo de pasteurização. Todavia, na ausência de bactérias psicrotróficas ou se grande número de termodúricos sobreviverem a pasteurização, eles podem se multiplicar e causar deterioração do leite, assim como as bactérias psicrotróficas. (Bodyfelt,
1980; Overcast & Atmaram, 1974).
O gênero Pseudomonas, dentre as bactérias psicrotróficas é o que mais deteriora os produtos lácteos. Estes microrganismos são termosensíveis, e facilmente destruídos pela pasteurização, porém produzem enzimas extracelulares (lipases e proteases) que são termorresistentes, permanecendo no leite mesmo após o tratamento térmico (Fox et al., 2000; Moura, 1997). No entanto existem bactérias psicrotróficas formadoras de esporo que podem sobreviver à pasteurização e afetar a qualidade do leite e seus derivados (Boor et al., 1998).
Existem dois sistemas de pasteurização do leite. A pasteurização rápida envolve um tratamento térmico do leite na faixa de temperatura de 72 a 75ºC durante 15 a 20 segundos, seguindo-se de resfriamento imediato em aparelhagem em placas até temperatura igual ou inferior a 4ºC e envase em circuito fechado no menor prazo possível, sob condições que minimizem contaminações. Nestas condições de operação, a enzima fosfatase alcalina é inativada e a peroxidase não se desnatura (Brasil, 2002). Na pasteurização lenta (63 ºC por 30 minutos) o efeito térmico não é tão eficiente quando o número inicial de microrganismos é elevado. O custo dos equipamentos é, em comparação com seu rendimento, muito elevado (Speer, 1991).
2.1.3.2. Coagulação e Corte da Coalhada
A coagulação do leite é a etapa fundamental para a elaboração de queijos, normalmente, faz-se uso de enzimas coagulantes, que, dependendo de sua origem, apresentam composições enzimáticas diferenciadas, tanto em quantidade (proporção das enzimas), quanto em qualidade (tipo de enzima) (Neelakantan et al., 1999). A principal enzima responsável pela função de coagular a caseína presente no leite, é a quimosina, uma fosfoproteína de ação proteolítica presente no estômago de ruminantes jovens. Ela atua hidrolisando ligações peptídicas da k-caseína, transformando-a em para-caseína que precipita em presença de íons Ca2+ formando, então a coalhada (Perry, 2004).
As enzimas utilizadas podem ser oriundas de animais, vegetais ou de microrganismos e podem ser usadas isoladamente ou misturadas entre si (Rani & Verma,
1995). O agente coagulante convencional utilizado na produção de queijos é o coalho de bezerro, que é extraído do quarto estômago de bezerros em lactação. Este coalho é composto pelas enzimas quimosina e pepsina, em proporção de cerca de 895% de quimosina para 5-15% de pepsina (Yousif et al., 1996) e sua função é coagular a caseína presente no leite. Ela atua hidrolisando ligações peptídicas da k-caseína, transformando-a em para-caseína que precipita em presença de íons Ca2+ formando, então a coalhada (Perry, 2004).
Como alternativa para o coalho de bezerro, existem microrganismos, tais quais Rhizomucor miehei, R. pusillus, Endothia parasitica, Aspergillus oryzae e Irpex lactics, que são usados para a produção de proteinases empregadas como coagulantes de leite. Outra alternativa é o “coalho genético”, que é constituído de quimosina pura e sua obtenção é possível devido a tecnologia do DNA recombinante, que permite a clonagem do gene que codifica para quimosina de bezerro em células de E. coli, Saccharomyces cerevisae, Aspergillus oryzae, Kluyveromyces lactics, A. nidulans, A. niger e Trichoderma reesei (Neelakantan et al., 1999).
A coalhada enzimática é um gel bastante estável se mantido em descanso, mas ao ser cortado, ele rapidamente sofre sinérese, expulsando soro. A taxa e extensão da sinérese é influenciada pela composição do leite, especialmente as concentrações de Ca2+ e caseína; o pH do soro; a temperatura de cozimento; a taxa de mexedura da mistura coalhada-soro; e o tempo (Fox et al., 2000).
A pasteurização pode alterar o equilíbrio salino do leite e para corrigir este problema o CaCl2 deve ser adicionado ao leite, repondo o cálcio insolubilizado durante a pasteurização (Scott et al., 1998).
A temperatura ótima de coagulação do leite é em torno de 40ºC, mas é comum a utilização de temperaturas ligeiramente mais baixas, em torno de 35ºC, produzindo assim um queijo mais macio, uma vez que a coalhada fica menos dura (Spreer, 1991).
2.1.3.3. Salga e Dessoragem
O processo de salga do QMF pode ocorrer de várias maneiras. Uma delas é a salga a seco, que é realizada na proporção de 0,7% do peso do queijo, em cada face do produto. É feita durante as viragens sucessivas dos queijos. A outra maneira é a salga em salmoura (20% de sal) a 10-12ºC, por períodos proporcionais ao peso e formato do queijo. A salga na massa também é possível, utilizando-se, geralmente, salmoura a 2% de sal (Fox et al., 2000; Nascimento, 2007). Após a salga, a massa obtida é colocada em formas e prensada para que o soro seja expulso, sendo em seguida, o queijo embalado (Perry, 2004).
2.2. ASPECTOS GERAIS DE ESCHERICHIA COLI NÃO PATOGÊNICA
Desde 1885, quando foi isolada pela primeira vez a partir de fezes de criança e descrita pelo bacteriologista alemão, Theodor Escherich, a atenção científica foi empregada, de modo que, atualmente E. coli talvez seja o microrganismo de vida livre mais conhecido (Adam & Moss, 2008).
E. coli pertence à família Enterobacteriaceae é um anaeróbio facultativo, predominante na microbiota de animais de sangue quente, Gram-negativa, no formato de bacilo com 1 a 2µm de comprimento, não esporulado, catalase-positiva, oxidase-negativa, fermentam glicose com produção de ácido e gás e a maioria fermenta também a lactose, sendo, algumas cepas ácido resistentes (Bhunia, 2008 ).
Esse microrganismo coloniza o trato gastrintestinal das crianças logo após as primeiras horas de vida. Depois E. coli e hospedeiro passam a ter uma relação de benefício mútuo. E. coli, geralmente, permanece inofensivamente no lúmen intestinal, todavia, em um hospedeiro limitado ou imunodeprimido, cepas de E. coli. mesmo não patogênicas, podem causar infecção. Mas mesmo o mais saudável membro da espécie humana pode ser susceptível a um dos várias cepas de E. coli altamente adaptadas e que causam um amplo espectro de doenças (Nataro & Kaper, 1998; Adams & Moss, 2008; Bhunia, 2008 ).
Cepas patogênicas de E. coli conhecidas como causadoras de gastroenterite são classificadas com base na sua propriedade de virulência em: EPEC (E. coli enteropatogênica), EIEC (E. coli enteroinvasiva), ETEC (E. coli enterotoxigênica), STEC/EHEC (E. coli produtora de toxina Shiga/E. coli enterohemorrágica), EAEC (E. coli enteroagregativa) e DAEC (E. coli de aderência difusa) (Adams & Moss, 2008).
E. coli é rotineiramente exposta ao ambiente através das fezes e podem contaminar a água e o solo e, consequentemente, frutas e vegetais, especialmente se adubos não tratados forem usados como fertilizantes. As carnes também são uma fonte comum de E. coli, uma vez que podem ser contaminadas durante o abate por contato fecal. Esse microrganismo também tem sido associado com produtos lácteos e maionese (Bhunia, 2008).
A sorotipagem de E. coli ocupa um lugar central na história deste patógeno. Kauffman, em 1944, propôs um esquema para classificação sorológica que ainda continua sendo utilizado com algumas modificações. A classificação baseia-se na caracterização dos antígenos somáticos (O), flagelares (H), e capsulares (K). A combinação entre os antígenos O e H define o sorotipo de uma estirpe (Nataro & Kaper, 1998).
2.3. ESHERICHIA COLI PRODUTORA DE TOXINA SHIGA (STEC/EHEC)
2.3.1. História e Definições
O reconhecimento de STEC como uma classe de E. coli patogênica resultou de duas observações microbiológicas chave. A primeira foi em 1983, relatada por Riley et al. que investigaram dois surtos de doença gastrintestinal caracterizada por cólica abdominal, diarréia aquosa seguida de diarréia sanguinolenta e um pouco de febre Essa doença foi nomeada de colite hemorrágica e estava associada com a ingestão de hambúrguer mal cozido de uma cadeia de fast-food. Cultura de fezes desses pacientes diagnosticaram um sorotipo raramente isolado, O157:H7.
presença de uma citotoxina produzida por E. coli. SHU foi definida pela tríade falha renal aguda, trombocitopenia e anemia hemolítica microangiopática, sendo observado que SHU é tipicamente precedida de diarréia sanguinolenta indistinguível de CH.
O ensaio com a citotoxina realizado por Karmali et al., (1983) foi originalmente realizado por Konowalchuk et al., (1977), os quais observaram que o sobrenadante da cultura de cepas de E. coli produziam um efeito citopático irreversível em culturas de células Vero (linhagem celular derivada de rim de macaco verde africano), denominando esta toxina de Verotoxina (VT).
O`Brien et al. (1983) relataram que algumas cepas de E. coli apresentaram efeito citotóxico para células HeLa (adenocarcinoma uterino humano) e que os efeitos tóxicos eram neutralizados por anti-toxina preparada contra Shigella dysenteriae 1 (toxina Shiga). Por conseguinte, denominaram então esta toxina de “Shiga-like toxin” (SLT). O`Brien et al., demostraram que SLT e VT eram a mesma toxina e que as cepas de E. coli O157:H7 descritas por Riley et al. (1983), produziam esta toxina.
A dupla nomenclatura (VT/SLT) adotada para referir-se à toxina e suas variantes fez com que Calderwood et al., (1996) propusessem uma nova nomenclatura, reconhecendo estas toxinas como pertencentes a família das toxinas Shiga (Stx). Nesta nomenclatura, as E. coli que carreiam o gene stx ou elaboram Stx são referidas como STEC (“Shiga toxin-producing E. coli”).
Durante muito tempo EHEC foi sinônimo do sorotipo O157:H7, mas depois outros sorotipos (O26:H11, O103:H2, O111:H-, O145:H-, O157:H-) também foram associados com CH. Então, a definição de EHEC foi ampliada para incluir outros sorotipos e o termo EHEC passou a ser utilizado para designar cepas de STEC que causam CH, SHU, produzem toxina Shiga (Stx), e causam lesão A/E (attaching-effacing) nas células epiteliais ou possuem material genético para produção desta lesão. STEC ou VTEC é o termo utilizado para cepas de E. coli que produzem somente Stx (Mainil & Daube, 2005).
Então, a nomenclatura EHEC denota um subgrupo de STEC que além de produzir toxina Shiga possui os fatores de virulência citados acima. No entanto não é claro que, no
caso das STEC, apenas a produção de toxina Shiga sem os outros fatores de virulência lhe confira patogenicidade, enquanto que todas as cepas de EHEC são patogênicas (Nataro & Kaper, 1998). Portanto, O157:H7 é uma STEC que produz Stx, lesão A/E ou possuem material genético para a produção da mesma.
2.3.2. Multiplicação e sobrevivência de EHEC O157:H7 em alimentos
STEC, em particular o sorotipo O157:H7, tem emergido nos últimos anos como um importante patógeno transmitido por alimentos não apenas por sua crescente incidência por todo mundo, mas também pela severidade da doença e baixa dose infecciosa do sorotipo O157:H7 para estabelecer a doença (Duffy et al., 2001).
Dados obtidos de vários surtos sugerem que a baixa dose infecciosa de EHEC O157:H7 pode estar relacionada à capacidade de sobreviver em ambientes com baixo pH como os encontrados no rúmen e estômago (Diez-Gonzalez et al., 1998). Surtos envolvendo O157:H7 em alimentos indicam que doses baixas como ≤ 100 ou mesmo ≤ 10 são capazes de causar doença em crianças, idosos e imunodeprimidos (Neil et al., 2001; Peacock et al., 2001; Varade., 2000).
EHEC pertencentes ao sorotipo O157:H7 possuem características únicas, não encontradas em outras cepas de E. coli, como inabilidade para crescer bem em temperaturas ≥ 44,5oC, incapacidade de fermentar sorbitol em 24 horas e incapacidade de produzir a enzima ß-D-glucuronidase (Echeverry, 2004).
Os alimentos crus de origem animal são os mais susceptíveis a contaminação por STEC. O leite pode ser contaminado durante a ordenha, as carcaças durante o abate e ambos também podem ser contaminados em etapas posteriores de processamento. Alguns dos alimentos que têm sido associados com contaminação causada por cepas de O157:H7 são: carne de hambúrguer mal cozida, leite, queijos produzidos com leite cru, água e vegetais (Reid, 2001).
influenciados por uma série de parâmetros incluindo temperatura, pH, atividade de água (Aa), agentes antimicrobianos, atmosfera em que o alimento é mantido e a microbiota competitiva. Enquanto as características de multiplicação de STEC são muito similares a outras E. coli, tem sido relatado que o sorotipo O157:H7 é um atípico ácido tolerante (Duffy et al., 2001).
Baixas temperaturas são usadas para reduzir atividade enzimática e metabólica dos microrganismos, assim reduzindo ou prevenindo sua multiplicação. Armazenamento de alimentos a baixas temperaturas pode reduzir a população de microrganismos, mas não completamente, como quando comparada ao tratamento térmico (Echeverry, 2004). Os estudos do efeito da temperatura na multiplicação de E. coli O157:H7 em uma série de alimentos, tem focado em sua sobrevivência em temperaturas habituais de armazenamento e temperaturas de inativação pelo calor (Duffy et al., 2001). Alguns trabalhos apontam que a temperatura mínima para multiplicação de E. coli O157:H7 é aproximadamente 8-10ºC (Buchanam & Klawitter, 1992; Rajknowski & Marmer, 1995).
Infecções em humanos têm sido associadas com leite cru contaminado com material fecal de bovinos, assim como leite pasteurizado, mas somente quando a pasteurização é inadequada ou a contaminação acontece posteriormente ao processamento (Anon, 1999; Upton & Cola 1994).
E. coli O157:H7, é capaz de sobreviver em temperaturas de congelamento comercial (aproximadamente -20 oC) e foi recuperada de carne de hambúrguer, morango e rabanete congelados (Ansay et al., 1999; Gooding& Choudary,1997; Hara-Kudo et al., 1997).
Em relação a atividade de água, o sorotipo O157:H7 pode sobreviver bem em alimento secos, tolerando baixos valores de Aa. Estudos de sobrevivência feitos em peperoni, têm demostrado a habilidade de EHEC O157:H7 em sobreviver neste tipo de produto, normalmente considerado seguro devido sua baixa Aa (0,87 a 0,89) e baixo pH (4,68 a 4,85) (Echeverry, 2004).
A sobrevivência de bactérias em baixo pH tem sido identificada como um dos maiores determinantes para a virulência de patógenos entéricos. Essa resistência em ambientes ácidos lhes confere a vantagem de sobreviver no sistema gástrico, estabelecer
infecção no cólon com reduzida dose infecciosa (Duffy et al., 2001).
2.3.3. Reservatório Animal e Transmissão
STEC pode ser encontrada no intestino de animais sadios e são excretadas nas fezes de uma variedade de animais incluindo bovinos, caprinos, suínos, cães, gatos, galinha, entre outros. O gado é um dos mais importantes reservatórios de STEC, e altas taxas de colonização, por STEC, foram observadas no rebanho bovino de muitos países (Griffin et al., 1991; Hancock et al., 1994; Wells et al., 1991), incluindo o Brasil (Cerqueira et al., 1999; Silva, 2001; Gonzalez, 2003; Tristão, 2007).
A transmissão de STEC acontece por alimentos e água contaminada e, menos freqüentemente, pessoa-a-pessoa. Muitos casos de infecção são causados especialmente por alimentos de origem bovina (Nataro & Kaper, 1998).
Vários autores relatam a contaminação de produtos lácteos por STEC. Morgan et al., (1993) relacionaram casos de infecção humana, ocorridos no noroeste da Inglaterra, provocados por EHEC do sorotipo O157:H7 com o consumo de iogurte produzido localmente com leite “gordo” pasteurizado, onde sessenta casos foram identificados no período de 1 de setembro a 1 de novembro de 1991. No ano de 2001, em Edmonton, Canadá; ocorreu um surto envolvendo EHEC O157:H7 que foi associado ao consumo de queijo gouda não pasteurizado (Honish, 2005).
2.3.4. Considerações Clínicas
As manifestações clínicas causadas por EHEC podem variar de diarréia branda, não sanguinolenta, até CH, SHU e PTT (Púrpura Trombocitopênica Trombótica). O período de incubação é, geralmente de 3 a 4 dias, embora períodos de incubação longos, como de 5 a 8 dias, ou curtos, de 1 a 2 dois dias têm sido descritos em alguns surtos (Nataro & Kaper,
A queixa inicial é geralmente diarréia não sanguinolenta, embora em muito pacientes, esta seja precedida de febre de curta duração e dores abdominais. Vômitos acontecem em cerca de metade dos pacientes no período da diarréia não sanguinolenta e/ou em outros momentos da doença. Dentro de 1 a 2 dias a diarréia torna-se sangrenta e as dores abdominais aumentam e esse estágio normalmente dura de 4 a 10 dias. Em muitos pacientes a diarréia sanguinolenta desaparece sem nenhuma sequela aparente, mas em 10% dos casos, em pacientes menores que 10 anos e idosos a doença pode avançar para SHU (Riley et al., 1983).
SHU é definida pela tríade: anemia hemolítica, trombocitopenia e falência renal. As manifestações clínicas iniciais incluem oligúria ou anúria, edema, palidez e algumas vezes convulsões. A maioria dos pacientes se recupera com terapias adequadas, mas, de 3 a 5% dos afetadas morrem, e 12 a 30% ficam com seqüelas, tais como falência renal, hipertensão ou manifestações do sistema nervoso central (Griffin, 1991).
PTT é caracterizada por dano ao endotélio, fragmentação e destruição dos glóbulos vermelhos, destruição das plaquetas e inadequado suprimento de sangue aos tecidos. Os rins são especialmente susceptíveis a tais danos vasculares, mas o cérebro, intestino e outros órgãos também podem ser afetados (Donnenberg et al., 2000; Fratamico et al., 2002). A diferença entre SHU e PTT não é clara. Em PTT, existe deficiência de uma proteína no plasma, chamada de fator de Willebrand que causa uma condição caracterizada por sangramento excessivo que tende a afetar adultos e não crianças (Echeverry, 2004).
EHEC está espalhada ao redor do mundo, mas a maior partes dos casos de doença foi relatada em nações industrializadas dos hemisférios norte e sul. Na Argentina e Chile, SHU é maior causa de falha renal em crianças (Rivas et al., 1998; Cordovez et al., 1992). Nos Estados Unidos, EHEC está associada a, aproximadamente, 74.000 casos de infecção e 61 mortes, anualmente (Mead et al., 1999).
No Brasil, o primeiro relato de isolamento de EHEC de um paciente com SHU ocorreu em um hospital da cidade de São Paulo, no ano de 2001, envolvendo uma criança, com história de diarréia aguda ocorrida três semanas antes da internação, cujos sintomas clínicos e resultados de exames laboratoriais levaram ao diagnóstico desta síndrome. A cepa
isolada pertencia ao sorotipo O26:H11 (Guth, et al., 2002).
3. OBJETIVO GERAL
O presente trabalho teve como objetivo avaliar a capacidade de multiplicação e sobrevivência de duas cepas de EHEC do sorotipo O157:H7, durante o processamento e armazenamento do QMF produzido a partir de leite pasteurizado contaminado artificialmente.
4. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Produzir QMF a partir de leite pasteurizado tipo C, contaminado artificialmente, com duas cepas de EHEC do sorotipo O157:H7;
• Verificar a adequação do QMF ao Padrão de Identidade e Qualidade de QMF, bem como os padrões microbiológicos definidos pela legislação.
• Avaliar a capacidade de multiplicação e sobrevivência das cepas de EHEC O157:H7 durante as diferentes etapas do processamento e armazenamento a 8°C do QMF produzido a partir de leite pasteurizado;
• Avaliar as possíveis variações de multiplicação e sobrevivência entre as duas cepas de O157:H7 estudadas;
• Determinar se a tecnologia empregada durante o processamento do queijo, assim como a qualidade microbiológica e físico-química do leite utilizado como matéria-prima, estão relacionados com o multiplicação e sobrevivência das cepas de EHEC O157:H7 estudadas.
5. MATERIAIS E MÉTODOS
5.1. CEPAS BACTERIANAS
5.1.1. Cepas Utilizadas
Neste estudo foram utilizadas as cepas EHEC O157:H7 RJ581, isolada de fezes de bovino em uma fazenda no Estado Rio de Janeiro, Brasil (Gonzalez, 2003) e EHEC O157:H7 ATCC 43495 (EDL933), cepa referência isolada de carne moída envolvida em um surto em uma cadeia de restaurante tipo fast food, no Estado de Michigan, nos EUA. A cultura estoque de cada cepa foi mantida a -20°C em meio TSB (Trypticase Soy Broth, Himedia) adicionado de glicerol a 20% (v/v) até o momento de sua utilização.
5.2. MATÉRIA-PRIMA
Os queijos utilizados na pesquisa foram fabricados a partir de leite pasteurizado padronizado tipo C (3% de gordura), adquirido no comércio local, da cidade de Niterói, com um dia de fabricação e mesmo lote, para cada partida do experimento.
5.3. AVALIAÇÃO DA QUALIDADE FÍSICO-QUÍMICA E MICROBIOLÓGICA DO LEITE
Existe, atualmente, um consenso de que o controle da qualidade do leite utilizado como matéria-prima é fundamental para garantir a qualidade dos produtos derivados (Germano & Germano, 2011). Nesse sentido, o leite utilizado como matéria-prima foi submetido a análises para verificação de alguns dos requisitos mínimos de qualidade físico-química descritos na Instrução Normativa nº 51, de 18 de setembro de 2002 (Brasil, 2002) e dos padrões microbiológicos descritos na Resolução RDC nº 12, de 02 de janeiro de 2001
(Brasil, 2001) . Todas as análises foram realizadas em duplicata.
5.3.1. Controle Físico-Químico do Leite
5.3.1.1. Acidez Total Titulável
A acidez do leite pasteurizado foi determinada segundo metodologia descrita na Instrução Normativa nº 68, de 12 de dezembro (Brasil, 2006). O método consiste em uma titulometria de neutraliazação, onde a concentração de ácidos da amostra é quantificado pela titulação de determinado volume de leite por uma solução de hidróxido de sódio, de concentração conhecida, utilizando como indicador a fenolftaleína. Os resultados foram expressos em percentual de ácido lático.
5.3.1.2. Potencial Hidrogeniônico (pH)
A medida do pH das amostras de leite foi realizada em conformidade com a metodologia descrita na Instrução Normativa nº 68, de 12 de dezembro de 2006 (Brasil, 2006) que fundamenta-se na medida da concentração de íons hidrogênio da amostra utilizando pHmetro calibrado com soluções tampões 4 e 7. Logo em seguida a calibração do aparelho (pH Meter Tec-2, Tecnal)) o pH das amostras medido.
5.3.1.3. Resíduo de antibióticos
A presença de resíduos de antibióticos nas amostras de leite foi pesquisada com a utilização do Kit Eclipse 50 (Cap-lab®), aprovado pelo Ministério de Agricultura, Pecuária e Abastecimento, segundo recomendações do fabricante. Este teste é baseado na inibição do crescimento dos esporos de Geobacillus stearothermophilus, sendo que estes estão contidos em recipientes com um meio de cultivo específico e um indicador ácido-base que quando
provocando a modificação do indicador de uma cor azul a amarelo esverdeado, nesse caso o teste é negativo para presença de antibióticos. Entretanto, se a amostra contém uma concentração de antibiótico superior ao limite de detecção do teste, o crescimento do microrganismo é inibido de modo que não haverá produção de ácido, e por consequência, modificação da cor do meio. Dentre os antibióticos detectáveis por este teste estão: penicilina G, ampicilina, amixicilina, oxacilina, cloraxilina, cefalexina, cefapirina, sulfatiazol, sulfametacina, sulfanilamida, oxitetraciclina, tetraciclina, eritromicina, tilosina, neomicina, estreptomicina.
5.3.2. Controle Microbiológico do leite
O controle microbiológico do leite foi realizado de acordo com os padrões estabelecidos pela RDC 12, de 02 de janeiro de 2001 (Brasil, 2001). Também foi realizada a pesquisa de E. coli O157:H7 no leite, a fim de garantir a ausência deste microrganismo na matéria prima.
5.3.2.1. Pesquisa de Salmonella sp.
A detecção de Salmonella sp. foi realizada de acordo com a metodologia analítica recomendada pela Instrução Normativa n° 62, de 26 de agosto de 2003 (Brasil, 2003). Primeiramente foi realizado um pré-enriquecimento, homogeneizando 25 mL da amostras em 225 mL de água peptonada tamponada a 1% (BPW), em stomacher (MK1204, Cap-Lab®
) por 120 segundos e incubando a 36ºC por 16 a 20 h.. Em seguida foi realizado um enriquecimento seletivo adicionando alíquotas de 0,1 mL do inóculo da etapa anterior em tubo contendo 10 mL de caldo Rappaport Vassiliadis e outra alíquota de 1 mL em caldo Selenito Cistina, os tubos foram incubados em banho-maria a 41ºC por 24 a 30h.
Para isolamento das possíveis colônias de Salmonella sp, a partir dos caldos de enriquecimento, o inóculo foi repicado sobre a superfície de placas contendo ágar Salmonella Shigella (ASS), estriado de forma a se obter colônias isoladas. Neste meio, as colônias de
Salmonella se apresentam claras, com centro negro. A confirmação deve ser feita através de provas bioquímica, tais como produção de citocromo oxidase; pirrolidonil peptidase (PYRase), urease; fermentação da glicose, sacarose e lactose no meio TSI, detecção de beta-galactosidase, descarboxilação da lisina, produção de H2S, motilidade e produção de indol.
5.3.2.2. Escherichia coli
A enumeração de E. coli (indicador de contaminação fecal), foi realizada através do método de detecção rápida, utilizando placas PetrifilmTMEC (3M Company, St. Paul, MN, EUA) para contagem de E. coli ecoliformes totais, segundo recomendações do fabricante.
Foi preparada uma diluição 1:10 em saco para homogeneização estéril, sendo a amostra homogeneizada em BPW, em stomacher por 120 segundos. Foi adicionado 1 mL da amostra homogeneizada no centro da placa de PetrifilmTM
EC. As placas foram incubadas a 35 ºC por 48 h para a enumeração de E. coli.
Estas placas contem nutrientes do meio vermelho violeta bile (VRB), um agente geleificante solúvel em água fria, um indicador de atividade glicuronidásica e um indicador que facilita a enumeração da colônia. A maioria das E. coli (cerca de 97%) produz β-D-glicuronidase, o que permite a formação de um precipitado azul associado a colônia. O filme superior retém o gás formado pelos coliformes totais e E. coli que são fermentadores de lactose. Cerca de 95% das E. coli produzem gás e são indicadas pelas colônias azuis a vermelho-azuladas, associadas ao gás retido na Placa Petrifilm EC (dentro de, aproximadamente, o diâmetro de uma colônia).
5.3.2.3. Escherichia coli O157:H7
A presença de E. coli O157:H7 também foi verificada como controle para garantir a ausência deste microrganismos, anteriormente a contaminação artificial do queijo.
Para a avaliação da presença de cepas de O157:H7 no leite utilizado para fabricação dos queijos, foi acrescentado 25 ml de leite a 225 ml de BPW, sendo incubado a 35°C por 6 h. Posteriormente, 100 µL do enriquecimento foi inoculado em Sorbitol MacConkey Agar (Himedia) suplementado com telurito de potássio (2,5 mg/L) e cefixime (0,05 mg/L) (CT-SMAC) (Zadik, et al., 1993), as placas foram incubadas por 24-48 h a 35ºC.
5.4. FABRICAÇÃO DO QUEIJO MINAS FRESCAL
Para a elaboração das amostras de QMF foram utilizados 2 litros de leite pasteurizado tipo C padronizado. Ao leite aquecido a 35°C, foram adicionados 200 ppm (parte por milhão) de CaCl2, e 0,0625 g.L-1 de coalho Halamix (Chr. Hansen A/S). Esperou-se 50 minutos para que ocorresse o processo de coagulação. Uma vez obtido um coágulo firme, foi realizado o corte da massa, com consequente liberação de soro. Procedeu-se a mexedura a 45°C por 15 minutos. A dessoragem foi realizada manualmente, com o auxílio de peneiras. A salga foi realizada através da adição de sal (2,1%), diretamente na massa do queijo, após a etapa de dessoragem. Após o preparo estes foram armazenados a 8°C por até 15 dias dentro de recipiente plástico fechado.
Os queijos foram preparados no Laboratório de Higiene e Controle Microbiológico de Alimentos da Faculdade de Farmácia-UFF, seguindo o fluxograma conforme apresentado na Figura 1 (Furtado, 2004).
Figura 1 - Fluxograma de Preparação do Queijo Minas Frescal, Furtado (2004). Homogeneização do leite
Aquecimento do leite até 35°C
Adição de cloreto de cálcio coalho
Coagulação por 50 minutos a 35 ºC
Corte da coalhada
Mexedura por 12 minutos a 45 ºC
Dessoragem, salga e enformagem
5.4.1. Contaminação artificial do queijo Minas frescal
As amostras de QMF foram produzidas a partir do leite pasteurizado padronizado tipo C. Os queijos foram preparados a partir de quatros lotes de leite denominados L1, L2, L3 e L4. Cada lote de leite foi dividido em três volumes, um volume inoculado com 102 e outro com 103 células de EHEC O157:H7 por ml e um terceiro volume não inoculado (controle), para cada cepa estudada (Tabela 1).
Tabela 1 - Denominação das amostras de QMF em relação a cepa bacteriana, ao inóculo inicial e ao lote de leite pasteurizado tipo C utilizado como matéria-prima.
Amostras de QMF Inóculo Lote de leite Cepa bacteriana
QA1 102 L1 RJ581 QB1 103 L1 RJ581 QC1 NI L1 RJ581 QA2 102 L2 RJ581 QB2 103 L2 RJ581 QC2 NI L2 RJ581 QA3 102 L3 EDL933 QB3 103 L3 EDL933 QC3 NI L3 EDL933 QA4 102 L4 EDL933 QB4 103 L4 EDL933 QC4 NI L4 EDL933
NI: não inoculado.
Para obtenção dos inóculos, utilizados para a contaminação do leite, uma alçada, contendo aproximadamente 10 µL de cada cepa bacteriana mantida a -20°C em meio TSB adicionado de glicerol a 20% (v/v), foi transferida para um tubo contendo 5 mL de meio TSB e incubada por 24 h em estufa a 35°C, alcançando um cultivo de 108 células por mL. A partir desse cultivo de 108 células por mL, determinado pela medida da densidade óptica (D.O), medida em espectrofotômetro (SPEC, 20 MV®
) em comprimento de onda de 600 nm, foram realizadas diluições, sendo inoculadas 102 e 103 células de EHEC O157:H7 por mL de leite
em duas partidas diferentes (Figura 2). Cultivo overnight (108) 9mL de salina (107) 2,2L de leite= 103 1mL 220µL preparo do queijo 103 200µl leite (103) 2L de leite= 102 preparo do queijo 102 200µL
Figura 2 - Esquema demonstrativo da inoculação artificial do leite para preparo do queijo Minas frescal.
Para cada cepa bacteriana estudada foram produzidos seis queijos, incluindo a repetição de cada experimento (Tabela 2).
Tabela 2 – Número de amostras de queijo Minas frescal produzidos, a partir de leite contaminado artificialmente com diferentes cepas de EHEC O157:H7.
Queijo inoculado
Inóculos (células.mL-1 de leite)
Total
0 102 103
RJ 581 2 2 2 6
EDL 933 2 2 2 6
Total 4 4 4 12
5.4.2. Avaliação da Qualidade Físico-Química do Queijo Minas Frescal
A avaliação da qualidade físico-química do queijo foi realizada a fim de verificar os requisitos mínimos de identidade e qualidade estabelecidos pela Portaria nº 352, de 4 de setembro de 1997 (Brasil, 1997) alterada pela Instrução Normativa nº 4 de 01 de março de 2004 (Brasil, 2004), no que se refere a gordura e umidade. Todas as análises foram feitas em duplicata.
5.4.2.1. Determinação do Teor de Umidade
A determinação da umidade foi procedida segundo o método de secagem em estufa a 105ºC, conforme a metodologia descrita pela Instrução Normativa nº 68, de 12 de dezembro de 2006 (Brasil, 2006). É uma análise gravimétrica que se fundamenta na perda de umidade e substâncias voláteis quando a amostra é submetida a aquecimento a 105ºC.
5.4.2.2. Determinação do Teor de Gordura
A análise de determinação do teor de gordura foi realizada pelo método butirométrico para queijo, segundo a metodologia descrita pela Instrução Normativa nº 68, de
12 de dezembro de 2006 (Brasil, 2006). Essa metodologia baseia-se no ataque seletivo da matéria orgânica por meio de ácido sulfúrico, com exceção da gordura que será separada por centrifugação, auxiliada pelo álcool amílico.
A classificação dos queijos quanto ao teor de gordura é feita através da quantidade de gordura no extrato seco (GES), sendo assim após a leitura no butirômetro aplica-se esse valor na fórmula abaixo:
% GES = % gordura x 100 % Est Onde:
% gordura = leitura do percentual de gordura do butirômetro; % Est = percentual de extrato seco.
5.4.3. Avaliação da Qualidade Microbiológica do Queijo Minas Frescal
A avaliação da qualidade microbiológica do queijo foi realizada a fim de verificar a conformidade com os padrões estabelecidos pela Resolução RDC n° 12, de 02 de janeiro de 2001 (Brasil, 2001). Todas as análises foram feitas em duplicata.
5.4.3.1. Pesquisa de Salmonella sp
A detecção de Salmonella sp foi realizada de acordo com a metodologia analítica recomendada pela Instrução Normativa n° 62, de 26 de agosto de 2003 (Brasil, 2003),como descrito anteriormente no item 6.4.2.1.
5.4.3.2. E. coli
A enumeração de E. coli foi realizada utilizando-se placas PetrifilmTM EC a partir da diluição de 10-1 em BPW, seguindo os passos descritos no item 6.4.2.2.
5.4.3.3. Listeria monocytogenes
A detecção de L. monocytogenes foi realizada de acordo com a metodologia analítica recomendada pela Instrução Normativa n° 62, de 26 de agosto de 2003 (Brasil, 2003). Para o preparo das amostras, 225mL do caldo para enriquecimento para Listeria sp. (LEB), foram adicionados a 25g de amostra e homogeneizado em stomacher por 120 segundos em seguida este inóculo foi incubado em estufa a 30ºC por 24h. Após a incubação, 0,1 mL da cultura foi transferida para um tubo contendo 10 mL de caldo Fraser a 30ºC por 24 a 48 h. Para isolamento das possíveis colônias típicas, o crescimento bacteriano em caldo Fraser foi transferido para placas contendo ágar Palcam (AP) suplementado com suplemento seletivo para Listeria (Himedia), de forma a proporcionar a obtenção de colônias isoladas. As placas de AP foram incubadas a 30 ºC por 24 a 48 h. A seleção das colônias típicas foi feita com o auxílio de contador de colônias. No AP as colônias típicas de L. monocytogenes devem apresentar na coloração verde acinzentada, em caso positivo. A confirmação deve ser feita através de provas, tais como verificação da produção de catalase, observação das características morfológicas e tintoriais, verificação do crescimento típico em meio semi-sólido e, adicionalmente, por meio da verificação da incapacidade de redução de nitrato e verificação da positividade nas reações de vermelho de metila (VM) e Voges Proskauer (VP).
5.4.3.4. Staphylococcus aureus
A enumeração de S. aureus, foi realizada pelo método de detecção rápida, através da utilização de placas PetrifilmTM Staph Express (STX) (3M Company, St. Paul, MN, EUA), segundo recomendação do fabricante.
Foi realizada a homogeneização da amostra com BPW em stomacher por 120 segundos (diluição 10-1). Uma aliquota de 1mL da amostra foi adicionado no centro da placa, sendo as placas incubadas a 35 ºC por 18 - 20 h.
A placa de PetrifilmTM Staph Express (STX) é um sistema pronto de meio de cultura que contém um agente geleificante solúvel em água fria. O meio cromogênico, Baird-Parker modificado na placa é seletivo e diferencial para S. aureus. Colônias vermelho-violetas na placa são indicativas de S. aureus, quando aparecerem colônias de outras cores, o disco de confirmação deve ser usado.
O disco de confirmação foi inserido na superfície das placas que apresentaram colônias de ouras cores que não vermelho-violeta, e estas foram novamente incubadas em estufa a 35°C, durante 1-3 h. Neste caso, foram consideradas S. aureus as colônias com halo rosado.
5.5. AVALIAÇÃO DA MULTIPLICAÇÃO E SOBREVIVÊNCIA DE O157:H7 DURANTE AS ETAPAS DE PROCESSAMENTO E ARMAZENAMENTO DO QUEIJO MINAS FRESCAL
5.5.1. Avaliação da Multiplicação e Sobrevivência de EHEC O157:H7
A multiplicação e sobrevivência das cepas de EHEC O157:H7, RJ 581 e EDL 933 foram avaliadas durante as etapas de processamento do QMF e nos dias 0, 2, 4, 5, 7, 10 e 15 de armazenamento. Os pontos de coleta durante o processamento e os dias de coleta estão demonstrados na (Figura 3).
Para a avaliação da multiplicação e sobrevivência das cepas O157:H7 nas etapas de processamento e armazenamento dos queijos, as amostras depois de coletadas foram diluídas de forma seriada (1:10, 1:100, 1:1000) em salina tampão fosfato 0,01M (pH 7,2) segundo Dulbeco (PBS-D - NaCl 8,0g, KCl 0,2g, Na2HPO4 0,2g, H2O q.s.p. 1000mL, pH 7,4) (Bird & Forrester, 1981), para que posteriormente fossem inoculados 100 µL de cada diluição,
incubadas por 24-48 h a 35ºC.
Depois do período de incubação, foi realizada a contagem de colônias típicas de E. coli O157 no contador de colônias. Foram consideradas colônias típicas de E. coli O157 as colônias claras, não fermentadoras de sorbitol, com centro negro, redutoras de telurito. Colônias típicas de E. coli O157, de cada etapa ou dia de armazenamento, foram selecionadas sendo submetidas a confirmação através da pesquisa do gene rfbO157 por PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) (Paton & Paton, 1998).
Figura 3 - Pontos de coleta de amostra durante as etapas de processamento e armazenamento do queijo minas frescal inoculado artificialmente.
Homogeneização do leite
Aquecimento do leite até 35 °C
Adição de cloreto de cálcio coalho
Coagulação por 50 minutos a 35 ºC
Corte da coalhada
Mexedura por 12 minutos a 45 ºC Dessoragem, salga e enformagem Armazenamento a 8°C Coleta Coleta Coleta Coleta Coleta 1 dia 2 dias 4 dias 5 dias 7 dias 10 dias 15dias
5.5.2. Processamento das Amostras para Realização da PCR
As colônias típicas de EHEC O157:H7 armazenadas a -20ºC, foram semeadas em TSA (Himedia) e incubadas a 35ºC por 18-20 h. O crescimento microbiano foi suspenso em PBS-D. Uma alíquota de 100 µL desta suspensão densa foi diluída em 900 µL de água desmineralizada estéril e aquecida por 10 minutos a 100°C sendo em seguida imersa em gelo, ocorrendo a lise celular e a desnaturação do DNA. A suspensão foi centrifugada a 1110 x g por 10 seg., sendo o sobrenadante utilizado como fonte do DNA molde ((Paton & Paton, 1998).
5.5.3. Cepas Controle
Foram utilizadas as cepas E. coli K-12 DH5α como controle negativo e RJ581 (O157:H7) e EDL933 (O157:H7) como controles positivos.
5.5.4. Reação da PCR
Para amplificação da região do gene rfbO157 foram utilizados os iniciadores 5’ CGG ACA TCC ATG TGA TAT GG 3’ e 5’ TTG CCT ATG TAC AGC TAA TCC 3’, na concentração de 250 nM, apresentando o produto amplificado o tamanho de 259 pb (pares de bases) (Paton & Paton, 1998).
A reação da PCR foi realizada em um volume final de 50 µL, onde foram utilizados 5,0 µL de tampão PCR 10 X (Tris-HCl 200 mM [pH 8,4], KCl 500 mM), MgCl2 1,5 mM, 250 nM de cada iniciador (Invitrogen Brasil - São Paulo, SP), 2,5 mM de cada dNTP (deoxinuleotídio-trifosfato; Invitrogen) e 1U de Taq DNA polimerase (Invitrogen).
Na execução da reação, foi utilizado tubo plástico especial (eppendorf®) de 1,5 mL, novo e estéril, no qual foram depositados os volumes dos reagentes necessários à
realização de todas as amplificações previstas, ao qual denominamos "mix" dos reagentes.
Em tubos de plásticos de 0,2 mL, previamente identificados, foram pipetados 45 µL do "mix" de reagentes, e em seguida 5,0 µL do DNA alvo, em cada tubo, sendo os tubos levados ao termociclador Biocycler, modelo MJ25 (Biosystems®
).
5.5.5. Programa Utilizado
A amplificação do gene rfbO157 foi realizada em 10 ciclos de 95°C por 60 segundos, 65°C por 120 segundos e 72°C por 90 segundos, 15 ciclos de 95°C por 60 segundos, 60°C por 120 segundos e 72°C por 90 segundos e mais 10 ciclos de 95°C por 60 segundos, 60°C por 120 segundos e 72°C por 150 segundos (Paton & Paton, 1998).
5.5.6. Eletroforese em Gel de Agarose
O produto amplificado, denominado amplicon, foi submetido a eletroforese em gel de agarose a 1% (p/v), em cuba de eletroforese (Agaro-Power, Bionner). A voltagem utilizada foi de 100 V mantendo-se a amperagem em torno de 100 mA, condições em que a “corrida” durava 60 min. Nos “slots” do gel foram aplicados os controles, as amostras em teste e o marcador de peso molecular de 1Kb DNA Ladder (Invitrogen), adequado para mapear fragmentos de DNA fita dupla de 100 pb a 12 kb.
A todos os tubos foram adicionados previamente 8 µL de solução "gel loading" (Sigma Chemical Co., St Louis, Mo, USA) com a finalidade de aumentar a densidade do DNA, facilitando a dispersão das bandas e o acompanhamento da corrida devido a presença do corante azul de bromofenol.
Concluída a corrida eletroforética, o gel foi corado em uma solução de brometo de etídeo (5 mg/mL) e exposto a luz ultravioleta em um transiluminador, modelo ECX-20M
