Eletroforese em Gel de Agarose

O produto amplificado, denominado amplicon, foi submetido a eletroforese em gel de agarose a 1% (p/v), em cuba de eletroforese (Agaro-Power, Bionner). A voltagem utilizada foi de 100 V mantendo-se a amperagem em torno de 100 mA, condições em que a “corrida” durava 60 min. Nos “slots” do gel foram aplicados os controles, as amostras em teste e o marcador de peso molecular de 1Kb DNA Ladder (Invitrogen), adequado para mapear fragmentos de DNA fita dupla de 100 pb a 12 kb.

A todos os tubos foram adicionados previamente 8 µL de solução "gel loading" (Sigma Chemical Co., St Louis, Mo, USA) com a finalidade de aumentar a densidade do DNA, facilitando a dispersão das bandas e o acompanhamento da corrida devido a presença do corante azul de bromofenol.

Concluída a corrida eletroforética, o gel foi corado em uma solução de brometo de etídeo (5 mg/mL) e exposto a luz ultravioleta em um transiluminador, modelo ECX-20M

Systems, UVP). O brometo de etídeo tem afinidade pelo DNA, tornando visíveis as bandas formadas durante a amplificação.

5.6. ANÁLISE ESTATÍSTICA

Para avaliar a multiplicação e sobrevivência das EHEC O157:H7 durante os dias de armazenamento do QMF, foi realizado um modelo de regressão linear múltipla. O modelo incluiu níveis de inoculação, dias de armazenamento e tipo de cepa como efeitos principais. O pacote R foi utilizado para ajustar o modelo de regressão linear múltipla a contagem bacteriana (Draper & Smith, 1998). O nível de significância utilizado para determinar diferenças significativas devido aos níveis de inoculação, dias de armazenamento e tipo de cepa foi de 5% (p-valor 0,05). Em relação as etapas de processamento, foi feita uma análise descritiva da multiplicação e sobrevivência de EHEC O157:H7.

6. RESULTADOS E DISCUSSÃO

6.1. AVALIAÇÃO QUALIDADE FÍSICO-QUÍMICA E MICROBIOLÓGICA DO LEITE

A qualidade do leite é definida por parâmetros de composição química, físico- química e microbiológica, sendo assim o leite pasteurizado utilizado como matéria-prima para fabricação do QMF foi avaliado quanto a acidez (pH e acidez titulável), resíduo de antibióticos, presença de E. coli e Salmonella sp. O resultado da avaliação está demonstrado na (

Tabela 3).

Tabela 3 - Parâmetros físico-químicos e microbiológicos das amostras de leite pasteurizado utilizadas como matéria prima

Amostras de Leite Parâmetros L1 L2 L3 L4 Padrão pH 6,7 6,4 6,5 6,7 6,6 - 6,8a Acidez titulável (g de ácido lático/100mL) 0,18 0,17 0,17 0,17 0,14- 0,18b Resíduo de antibióticos

Negativo Negativo Negativo Negativo Ausênciab

E. coli (UFC/mL) >105 >105 1,7x105 3,5x104 4 NMPc

Salmonella sp/ mL Ausência Ausência Ausência Ausência Ausênciac

E. coli O157:H7 Ausência Ausência Ausência Ausência Ausênciad

a

Fox (2002), Damodaram et al. (2010), b Brasil (2002), cBrasil (2001), dPadrão estabelecido para o experimento.

Segundo o Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade a acidez é um dos requisitos mínimos a serem avaliados para se atestar a qualidade e identidade do leite pasteurizado, sendo que este valor deve ser de 0,14 a 0,18 g de ácido lático/100mL para todas

leite. Uma acidez alta é resultado da acidificação da lactose, provocada por microrganismos em multiplicação no leite. A acidez, tende, portanto, a aumentar a medida que o leite vai envelhecendo (Adolfo Lutz, 2005). Os valores encontrados neste trabalho variaram de 0,17 a 0,18 g% de ácido lático, mostrando-se em conformidade com os limites permitidos.

Em relação ao pH, de acordo com Fox (2003), e Damodaran et al. (2010), no leite cru, logo após a ordenha, o pH corresponde de 6,6 a 6,8. Os resultados obtidos da aferição do pH nas amostras de leite, apresentados na Tabela 2, a princípio demostrariam que as amostras L2 e L3 encontravam-se em não conformidade com a literatura. Entretanto, é importante considerar que essas amostras correspondem a leite pasteurizado tipo C, sendo necessário destacar que as etapas posteriores a ordenha e que antecedem a pasteurização, como interferentes no valor do pH. Segundo a Instrução Normativa n° 51, de 18 de setembro de 2002 (Brasil, 2002), o leite pasteurizado tipo C não é submetido a qualquer tipo de tratamento térmico na fazenda leiteira onde foi produzido, sendo transportado em temperatura ambiente, até o estabelecimento industrial, devendo ser recebido nesse local, até as 10h do dia de sua obtenção. Dessa forma, o leite cru pode permanecer longo período em temperatura ambiente, favorecendo o aumento da contagem da microbiota e consequente desdobramento da lactose em ácido lático, tornando o leite mais ácido, parâmetro que não será modificado após a pasteurização.

Avaliando de forma associada os resultados de acidez e pH, determinados nas amostras de leite pasteurizado, a matéria prima foi considerada em conformidade com os parâmetros legais e de literatura, sendo própria para a elaboração dos queijos.

Outro fator importante para atestar a qualidade do leite é a presença de antibióticos, este tipo de substância quando presente no leite pode causar, dentre muitos problemas, a modificação dos resultados das análises de qualidade, inibição da multiplicação da microbiota e interferir negativamente na produção de derivados, como o queijo (Fagundes, 2007; Nascimento et al., 2001). Todo leite utilizado para a fabricação dos queijos apresentou resultado negativo no que diz respeito a presença dos antibióticos testados.

Para avaliação da qualidade microbiológica do leite pasteurizado as amostras foram avaliadas qualitativamente quanto a presença de Salmonella sp. e quantitativamente em

relação a presença de E. coli como indicador de contaminação fecal. A pesquisa de E. coli O157:H7 foi realizada a fim de assegurar a ausência deste microrganismo antes da inoculação artificial no leite. Os resultados das análises microbiológicas foram comparados com os Padrões estabelecidos na Resolução RDC nº 12, de 2 de janeiro de 2001 (Brasil, 2001).

As amostras de leite pasteurizado estavam isentas de Salmonella sp., conforme estabelecido, pela legislação, resultado este em concordância aos encontrados por Oliveira (2005) e Ataíde (2008). No entanto, as contagens de E. coli mostraram-se bastante elevadas, com valores variando de 3,5 x 104 a >105 UFC.mL-1 de leite. A legislação não estabelece padrões para E. coli, contudo a contagem máxima permitida para coliformes a 45ºC é de 4 NMP (número mais provável).mL-1 para leite pasteurizado. Deve-se considerar que entre as bactérias indicadoras de contaminação fecal, E. coli é o verdadeiro indicador deste tipo de contaminação, por ser o único membro do grupo dos coliformes a 45ºC de origem exclusivamente fecal, podendo fornecer informações sobre as condições sanitárias de produção, processamento e armazenamento (Garboggini & Gallo, 1998).

E. coli, inclusive cepas patogênicas, são microrganismos frequentemente encontrados no leite cru e pasteurizado produzidos no Brasil. Catão e Cerballos (2001) pesquisaram E. coli em leite recém pasteurizado em uma indústria de laticínios no estado da Paraíba, e observaram que o valor médio de E. coli encontrado nas amostras foi maior que 103 NMP.mL-1. Ataíde et al. (2008), também em uma indústria de laticínios no estado da Paraíba, avaliaram 14 amostras de leite cru e pasteurizado, os resultados mostraram a presença de E. coli em 42,9% e 35,7% das amostras, respectivamente. Silva et al. (2001), analisaram 90 amostras de três diferentes marcas de leite pasteurizado comercializados na cidade do Rio de Janeiro e isolaram 208 cepas de E. coli, das quais 46 foram sorologicamente identificadas como EPEC.

Considerando que os coliformes são destruídos na pasteurização, os resultados elevados de E. coli demonstrados podem ser atribuídos a fatores, como leite cru altamente contaminado, falha na pasteurização do leite cru (tempo e temperatura inadequados), recontaminação do leite pasteurizado a partir de equipamentos e utensílios, contato com o leite cru ou ainda hábitos higiênicos inadequados dos manipuladores, indicando a necessidade

dos processos adotadas pelos produtores na pasteurização do leite e seleção mais criteriosa de fornecedores. A utilização da matéria-prima altamente contaminada pode influenciar na qualidade do produto final.

Não foi detectada E. coli O157:H7 nas amostras de leite, assegurando que as colônias deste microrganismo enumeradas no experimento não foram oriundas da matéria-prima utilizada..

6.2. QUALIDADE FÍSICO-QUÍMICA E MICROBIOLÓGICA DO QUEIJO MINAS